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Behavior

फ्लैट फिदा एयर उठाया प्लेटफार्म: एक नई विधि जाग पर माइक्रोस्कोपी या इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ व्यवहार के संयोजन के लिए स्वतंत्र रूप कृंतक चल रहा है

Published: June 29, 2014 doi: 10.3791/51869
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 2, 2, 1, 3, 4, 1, 1, 1
1Neuroscience Center, University of Helsinki, 2Neurotar LTD, 3A. I. Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eastern Finland, 4Laboratory Animal Center, University of Helsinki

Summary

इस विधि से नेविगेट और पशु के सिर की फर्म निर्धारण की आवश्यकता होती है जो सूक्ष्म इमेजिंग या एकल कक्ष electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान पता लगाने के लिए माउस के लिए एक ठोस, परिचित वातावरण बनाता है.

Abstract

यह व्यापक रूप से सामान्य anesthetics का उपयोग एक जीवित पशुओं के मस्तिष्क से प्राप्त electrophysiological या अति सूक्ष्म डेटा की प्रासंगिकता को कमजोर कर सकते हैं कि स्वीकार किया है. इसके अलावा, संज्ञाहरण से लंबा वसूली अनुदैर्ध्य अध्ययन में दोहराया रिकॉर्डिंग / इमेजिंग प्रकरणों की आवृत्ति को सीमित करता है. इसलिए, गैर anesthetized बर्ताव चूहों से स्थिर रिकॉर्डिंग की अनुमति होगी कि नए तरीकों सेलुलर और संज्ञानात्मक न्यूरो के क्षेत्र अग्रिम करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं. मौजूदा समाधान मात्र शारीरिक संयम से इस तरह के कंप्यूटर जनित आभासी वास्तविकता के साथ संयोजन में उपयोग किया रेखीय और गोलीय treadmills के रूप में और अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण, को लेकर. एक सिर तय माउस एक हवाई उठाया मोबाइल homecage घूमने और तनाव मुक्त परिस्थितियों में अपने पर्यावरण का पता लगाने सकता है, जहां यहाँ, एक उपन्यास विधि वर्णित है. इस विधि के शोधकर्ताओं के साथ एक साथ व्यवहार परीक्षण (जैसे, शिक्षा, आदी होना या उपन्यास वस्तु मान्यता) प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता हैदो photon इमेजिंग सूक्ष्म और / या पैच दबाना रिकॉर्डिंग, सभी एक ही प्रयोग में संयुक्त. इस वीडियो लेख जाग पशु सिर फिक्सेशन डिवाइस (मोबाइल homecage) के उपयोग का वर्णन करता है, पशु आदी की प्रक्रियाओं को दर्शाता है, और विधि के संभावित अनुप्रयोगों की एक संख्या एक मिसाल है.

Introduction

न्यूरोसाइंसेस में एक रोमांचक हाल की प्रवृत्ति आणविक और सेलुलर कृन्तकों बर्ताव, जाग के मस्तिष्क में neuronal नेटवर्क की जांच के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित करना है. इस तरह के दृष्टिकोण मोटर समारोह, ज्ञानेन्द्रिय एकीकरण, धारणा, सीखने, याददाश्त, साथ ही चोट प्रगति, neurodegeneration और आनुवंशिक रोगों आबाद कि neurophysiological प्रक्रियाओं पर नया प्रकाश डाला करने के लिए वादा पकड़. इसके अलावा, जाग जानवर के मस्तिष्क से रिकॉर्डिंग उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों और उपचार के विकास में वादा है.

सामान्यतः neurophysiological प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है जो संज्ञाहरण, संभावित प्रयोगात्मक निष्कर्षों की गलत व्याख्या करने के लिए अग्रणी, मस्तिष्क समारोह के बुनियादी तंत्र को प्रभावित कर सकते हैं कि एक बढ़ती जागरूकता है. इस प्रकार, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया संवेदनाहारी ketamine तेजी से नए वृक्ष के समान spines के गठन को बढ़ाता है और synaptic समारोह 1 बढ़ाता है; एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया anesthetशल्य चिकित्सा संज्ञाहरण के स्तर पर आईसी isoflurane पूरी तरह से वयस्क जानवरों 2 में नवजात चूहों और ब्लॉक धुरी फट दोलनों में सहज cortical गतिविधि को रोकता है. वर्तमान में, दृष्टिकोण का केवल एक सीमित संख्या दो photon इमेजिंग सूक्ष्म या पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से गैर anesthetized चूहों में प्रयोगों के लिए सक्षम. इन तरीकों को स्वतंत्र रूप से चल रहा है और सिर से तय की तैयारी में विभाजित किया जा सकता है.

एक स्वतंत्र रूप से चलती जानवर तैयारी का अनूठा आकर्षण यह नेविगेशन के दौरान पूरे शरीर की गतिविधियों सहित, प्राकृतिक व्यवहार के आकलन की अनुमति देता है. एक स्वतंत्र रूप से घूम रहा कृंतक के दिमाग के अंदर छवि को एक तरह से एक छोटी सिर पर चढ़कर माइक्रोस्कोप या अक्षितंतुदर्शी 3-5 देते है. हालांकि, छोटी उपकरणों उद्देश्य आधारित दो photon माइक्रोस्कोपी की तुलना में सीमित ऑप्टिकल प्रदर्शन हो जाते हैं, और आसानी से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग 6 के साथ संयुक्त नहीं किया जा सकता.

EXiसिर फिक्सिंग एक जाग कृंतक के लिए स्टिंग समाधान शारीरिक संयम 7,8 पर या स्वैच्छिक सिर संयम 9 प्रदर्शन करने के लिए पशु प्रशिक्षण पर या तो मुख्य रूप से भरोसा किया है. एक अन्य लोकप्रिय दृष्टिकोण जानवर के अंगों, जैसे, एक गोलाकार ट्रेडमिल 10 इस पर रखकर ले जाने के लिए अनुमति देने के लिए है; इस दृष्टिकोण अक्सर कंप्यूटर जनित आभासी वास्तविकता के साथ संयुक्त है. सिर तय चूहों पर electrophysiological प्रयोगों ज्यादातर कोशिकी रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल किया है और हृदय समारोह 11 केंद्रीय विनियमन, neuronal गतिविधि 12 पर संज्ञाहरण के प्रभाव, brainstem 13 और सूचना संसाधन में 14 श्रवण प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. जाग बर्ताव पशुओं में अग्रणी intracellular / पूरे सेल रिकॉर्डिंग 2000 के दशक में प्रदर्शन किया गया और धारणा और गति 15-20 से संबंधित तंत्रिका गतिविधि पर ध्यान केंद्रित किया है. लगभग उसी समय, जाग चूहों पर पहले सूक्ष्म इमेजिंग अध्ययन पब गयादो photon माइक्रोस्कोपी शारीरिक रूप से रोका चूहों 7 का संवेदी प्रांतस्था में और एक गोलाकार ट्रेडमिल 21 पर चल रहे चूहों पर प्रयोग किया जाता था, जहां lished,.

बाद में विवो माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई एक सिर निर्धारण तैयारी सफलतापूर्वक forelimb आंदोलनों, गंध मान्यता, गर्मी, और 8,22-25 चाट के आधार पर व्यवहार मानदंड के साथ जोड़ा जा सकता है कि प्रदर्शन किया. गोलाकार ट्रेडमिल पर रखा चूहे एक कंप्यूटर 10,26 द्वारा उत्पन्न आभासी दृश्य वातावरण नेविगेट करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है. Intracellular / कोशिकी रिकॉर्डिंग ऐसे आभासी वातावरण नेविगेट एक सिर तय पशु में, हिप्पोकैम्पस जगह कोशिकाओं की सक्रियता 27 से पता लगाया जा सकता है कि प्रदर्शन किया. एक आभासी दृश्य वातावरण में, चूहों सक्रिय आंदोलन 27 के दौरान स्थानीय क्षेत्र की क्षमता और थीटा चरण पुरस्सरण में सामान्य आंदोलन से संबंधित थीटा ताल प्रदर्शित करता है. हाल ही में, स्थानिक और लौकिक activitneuronal आबादी के y पैटर्न एक आभासी वातावरण 28 में स्मृति निर्णय कार्यों काम करने के दौरान चूहों में ऑप्टिकली दर्ज किए गए.

सफलता अनुसंधान सक्षम होने के बावजूद, गोलाकार ट्रेडमिल डिजाइन कई अंतर्निहित सीमाएँ हैं. सबसे पहले, पशु ऐसी दीवारों या बाधाओं के रूप में कोई ठोस बाधाएं बन गया है जो एक घूर्णन एयर उठाया गेंद, के एक असीमित सतह पर स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है. दृश्य इनपुट इन प्रजातियों स्वाभाविक रूप से निर्भर हैं, जो स्पर्श संवेदी इनपुट (जैसे, गलमुच्छा स्पर्श या चाटना), की तुलना में चूहों और चूहों पर यकीनन कम प्रभावी है क्योंकि यह सीमा, कंप्यूटर जनित "आभासी वास्तविकता" द्वारा मुआवजा हिस्से में ही है पर. दूसरा, गेंद सतह के काफी वक्रता उनके पिंजरों में एक फ्लैट मंजिल पर चलने के लिए इस्तेमाल प्रयोगशाला चूहों के लिए असुविधाजनक हो सकता है. अंत में, गेंद का सरासर व्यास (चूहों और चूहों के लिए 300 मिमी के लिए कम से कम 200 मिमी) गोलाकार के ऊर्ध्वाधर आकार rendersअपेक्षाकृत बड़े ट्रेडमिल डिवाइस. इस मुश्किल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी setups के बहुमत के साथ गोलाकार ट्रेडमिल गठबंधन करने के लिए बना देता है, और अक्सर कस्टम बनाया माइक्रोस्कोप फ्रेम के माध्यम से ट्रेडमिल के चारों ओर एक नए सेटअप के निर्माण की आवश्यकता है.

एक सिर तय माउस एक फ्लैट फर्श और ठोस दीवारों कि सुविधाओं के एक हवाई उठाया मोबाइल homecage चारों ओर ले जाते हैं, और तनाव मुक्त परिस्थितियों में भौतिक वातावरण का पता लगाने सकता है, जहां यहाँ, एक उपन्यास विधि वर्णित है. यह लेख माउस प्रशिक्षण और सिर निर्धारण की प्रक्रिया को दर्शाता है, और दो photon माइक्रोस्कोपी, आंतरिक ऑप्टिकल इमेजिंग और पैच दबाना रिकॉर्डिंग जाग बर्ताव चूहों के मस्तिष्क में प्रदर्शन कर रहे हैं, जहां प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करता है.

Protocol

यहाँ प्रस्तुत सभी प्रक्रियाओं जानवरों की देखभाल (पशु प्रयोग (62/2006) पर फिनिश अधिनियम) के लिए स्थानीय मार्गदर्शन के अनुसार प्रदर्शन किया गया. पशु लाइसेंस (ESAVI/2857/04.10.03/2012) स्थानीय प्राधिकरण (ELÄINKOELAUTAKUNTA-एला) से प्राप्त हुई थी. वयस्क चूहों (उम्र 1-3 महीने, वजन 20-40 ग्राम) हेलसिंकी विश्वविद्यालय के प्रमाणित जानवरों की सुविधा में समूह आवास पिंजरों में रखा जाता है और भोजन और पानी यथेच्छ के साथ प्रदान किया गया.

1. कपाल विंडो आरोपण

संक्षेप में नीचे वर्णित के रूप में कपाल खिड़की, प्रकाशित प्रोटोकॉल मामूली संशोधनों के साथ 29-31 के अनुसार प्रत्यारोपित किया जाता है:

  1. कपाल विंडो आरोपण शुरू करने से पहले उपकरणों जीवाणुरहित. पश्चात की जटिलताओं के जोखिम को कम करने के लिए सर्जरी के दौरान बाँझ स्थिति बनाए रखने.
  2. 30 मिनट सर्जरी और 24 घंटे के बाद सर्जरी से पहले एक एनाल्जेसिक (ketoprofen, 2.5 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन. एकketamine का एक मिश्रण (80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) का उपयोग माउस esthetize intraperitoneally इंजेक्शन. नियमित रूप से पंजा pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखने के. 37.0 डिग्री सेल्सियस पर पशु के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड का प्रयोग करें , सर्जरी प्रेरित सूजन और मस्तिष्क edema कम उप त्वचीय इंजेक्शन द्वारा dexamethasone (2 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन.
  3. ड्राई हो रहा से आंखों की रक्षा के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें. माउस के सिर दाढ़ी और बाल काटे क्षेत्र को साफ. माथे पर कूड़ा से रेखा के साथ शल्य कैंची और संदंश का उपयोग त्वचा में कटौती. खोपड़ी से जुड़ी किसी भी संयोजी ऊतक निकालें.
  4. धीरे धीरे और सावधानी से एक उच्च गति शल्य चिकित्सा ड्रिल का उपयोग कर छोड़ दिया ललाट हड्डी पर एक छोटी सी अच्छी तरह से ड्रिल. Drilled कुएं में एक मिनी बोल्ट (सामग्री देखें) भाड़ में. पेंच का कोई एक से अधिक और एक आधा भरा बदल जाता है प्रदर्शन.
    नोट: सीधे सतही cortical जहाजों के ऊपर स्थित हैं कि उन क्षेत्रों से बचें. इन ves का विघटनSELS भारी खून बह रहा हो सकता है.
  5. कपाल - उच्छेदन करने के लिए, सही पार्श्विका हड्डी में एक परिपत्र खिड़की (व्यास में 3-3.5 मिमी) ड्रिल. 100 माइक्रोग्राम पेनिसिलिन 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक आसुत एच 2 ओ में प्रांतस्था बफर की एक बूंद (125 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 CaCl, और 2 मिमी MgSO 4 लागू करें / एमएल) और ध्यान से गोल खिड़की के अंदर स्थित हड्डी का हिस्सा हटा दें.
    नोट:, कोशिकाओं की एक विशिष्ट subpopulation में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त प्रक्रिया में इस बिंदु पर एडिनो से जुड़े वायरल (AAV) वेक्टर या अन्य वायरल वैक्टर intracranial इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए.
  6. कपाल खिड़की पर एक दौर गिलास coverslip (# 1.5 मोटाई कोड) की स्थिति. Polyacrylic गोंद के साथ खोपड़ी को coverslip देते हैं. Coverslip के शीर्ष पर एक धातु धारक प्लेस और दंत सीमेंट और polyacrylic गोंद के मिश्रण के साथ यह तय कर लो.
    नोट: ऊपर वर्णित प्रक्रिया कपाल खिड़कियों के लिए अनुकूलित हैऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया. , Electrophysiological प्रयोगों के लिए उपयुक्त एक "उल्टे" कपाल विंडो तैयार एक अलग प्रक्रिया का उपयोग करें. सबसे पहले, खोपड़ी के लिए धातु धारक गोंद. वीडियो में उदाहरण के रूप में धारक के उद्घाटन के भीतर एक परिपत्र खिड़की ड्रिल. वैकल्पिक रूप से, मस्तिष्क आंदोलन 32 को रोकने या कम करने के लिए ब्याज के क्षेत्र के ऊपर एक छोटे कपाल - उच्छेदन (व्यास में कम से कम 0.5 मिमी) बनाते हैं. Cortical बफर ताज़ा करे या कपाल खिड़की पर सिलिकॉन चिपकने वाला की एक बूंद जगह, फिर एक दौर गिलास coverslip के साथ बंद हुआ.
  7. आपरेशन पूरा करने के बाद आसानी से सुलभ भोजन और पानी के साथ एक गर्म पिंजरे में जानवरों की जगह. यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक हो जाने के बाद ही समूह आवास पिंजरे में पशु लौटें. चाल है, खाने या पीने के लिए अनिच्छा, वजन घटाने, लार, piloerection या असामान्य सांस ध्वनियों सहित दर्द के किसी भी लक्षण का पता लगाने पर एनाल्जेसिक पुनः प्रशासन.

2. एनिमाएल हैंडलिंग

  1. अपने पिंजरे से माउस ले और बस 5-10 मिनट के लिए इसे पकड़ो. जानवर से निपटने जबकि शांत रहो, झटकेदार आंदोलनों और शोर मचा रहा से बचें.
  2. संभालने के बाद अपने पिंजरे के लिए माउस वापसी.
  3. प्रयोगवादी साथ माउस को आरामदेह बनाने के क्रम में, हैंडलिंग एपिसोड के बीच असमान अंतराल के साथ निपटने की प्रक्रिया 2-3X दोहराएँ.
  4. एक छोटा सा नरम चीर लो और असमान अंतराल के साथ पशु 2-3X लपेटो.
  5. पशु शांत रहते हैं और लपेटा जा रहा है के आदी हो जाना चाहिए. माउस उत्साहित और नर्वस है, हैंडलिंग और रैपिंग प्रक्रियाओं को दोहराएँ.

3. पशु प्रशिक्षण

  1. हैंडलिंग और रैपिंग को आदी होना के बाद अगले दिन पूरा हो गया है मोबाइल homecage में जानवर का प्रशिक्षण शुरू करो.
  2. पशु के पहले और प्रशिक्षण के दौरान दैनिक तौलना रिकार्ड.
    नोट: प्रशिक्षण के दौरान, जानवर अपने वजन के 10% से अधिक खो देता है, तो, यह टी से बाहर रखा जाना चाहिएवह प्रयोगों.
  3. प्रशिक्षित जानवर के आकार से मेल करने के क्रम में मोबाइल homecage डिवाइस के सिर निर्धारण हाथ के ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करें. मानक प्रयोगशाला दबाव हवा आउटलेट (आम तौर पर, एक गैस टैंक या यानी लगभग 5 बार और 300 एल / मिनट, एक पर्याप्त उच्च दबाव और हवा के प्रवाह की दर प्रदान करता है कि एक हवाई पंप) के लिए उपकरण की हवा प्रवेश जुड़ें.
  4. एक खपरैल में पशु लपेटें.
  5. सिर निर्धारण हाथ में पशु के सिर से जुड़ी है, जो धातु धारक,, डालें और मजबूती से शिकंजा कस द्वारा यह तय कर लो. हवा का प्रवाह चालू करें और हवा का प्रवाह हवा उठाया homecage से मुक्त तैरने की क्रिया के लिए इष्टतम है कि सुनिश्चित करें. खपरैल निकाल कर मोबाइल homecage में पशु रिलीज.
  6. शोर करने के लिए पशु अभ्यस्त करने के लिए, परिवेश लगता है के लिए एक निरंतर संपर्क में उपलब्ध कराने (उदाहरण के लिए, का उपयोग, रेडियो या दर्ज संगीत और भाषण) सभी प्रशिक्षण सत्र के दौरान के साथ ही प्रयोगों के दौरान.
  7. डीपहला प्रशिक्षण सत्र uring, प्रशिक्षण सत्र के अंत तक प्रकाश बंद कर देते हैं तो पहले घंटे के लिए पर कमरा प्रकाश रखना.
  8. मोबाइल homecage में प्रशिक्षण के 2 घंटे बाद, सिर निर्धारण से पशु जारी है और पानी और भोजन की आपूर्ति के साथ अपने पिंजरे के लिए यह वापसी. विश्राम परिस्थितियों में कम से कम 2 घंटे के लिए छोड़ दें.
  9. एक 70% इथेनॉल के समाधान का उपयोग करने के लिए प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के बाद मोबाइल homecage साफ और नल के पानी से कुल्ला. डिस्पोजेबल कागज तौलिया के साथ पानी सोख और अगले उपयोग करने से पहले मोबाइल homecage सूखी.
  10. पशु प्रशिक्षित किया जा रहा है, जबकि कमरे में प्रकाश के साथ, 2 घंटे के लिए लगातार प्रशिक्षण सत्र प्रदर्शन करना बंद कर दिया.
  11. दो बार दैनिक प्रशिक्षण सत्र को पूरा करें.
  12. 8 से 12 प्रशिक्षण सत्र के बाद, एक समय में करने के लिए 2 घंटे के लिए एक प्रायोगिक सत्र में जानवर का उपयोग करें.

नोट: अधिक से अधिक 1-2 घंटा है कि पिछले लंबे समय तक प्रशिक्षण सत्र के दौरान, डब्ल्यू माउस उपलब्ध कराने पर विचारया तो स्वयं या मोबाइल homecage फ्रेम से जुड़ी एक विंदुक धारक का उपयोग कर दिया जा सकता है जो ith पीने के पानी,. वैकल्पिक रूप से, पानी सीधे मोबाइल homecage की दीवारों पर पन जेल की चिपचिपा बूंदों रखकर पशु की यथेच्छ उपयोग के लिए आपूर्ति की जा सकती.

नोट: किसी भी पुराने तनाव प्रभाव से इनकार करने के प्रशिक्षण से पहले हर दिन जानवरों के वजन करने के लिए याद रखें. किसी भी समय बिंदु पर, यह ऐसी ठंड, वोकलिज़ेशन, या तनाव प्रेरित दस्त के रूप में तनाव प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है, यदि प्रयोग से एक जानवर को बाहर निकालें.

4. ऐप्लकेशन

  1. जाग माउस में दो photon इमेजिंग मोबाइल Homecage के आसपास घूम रहा
    1. मोबाइल homecage इकट्ठे. पुल और सिर निर्धारण हाथ की स्थिति की जाँच करें.
    2. एक खपरैल में प्रशिक्षित पशु लपेटें. मोबाइल homecage में पशु रखें. सिर निर्धारण हाथ में धातु धारक दबाना. खपरैल निकालें.
    3. का उपयोग कर धूल से प्रत्यारोपित कवर कांच साफएक 70% इथेनॉल के समाधान और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
    4. कवर वर्ग पर विसर्जन तरल पदार्थ की एक बूंद रखें. पानी तेजी से लुप्त हो जाएगा क्योंकि अधिमानतः, एक चिपचिपा समाधान का उपयोग करें.
    5. (आप माइक्रोस्कोपी सेटअप में स्थिर है, जो एक दूसरे के समान डिवाइस, जब तक) खुर्दबीन के नीचे प्रशिक्षित पशु के साथ मोबाइल homecage डिवाइस रखें.
    6. एक कस्टम मेड या एक femtosecond स्पंदित अवरक्त लेजर से लैस एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन इमेजिंग प्रणाली का उपयोग इमेजिंग प्रदर्शन.
    7. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के व्यापक क्षेत्र मोड का उपयोग हित के क्षेत्र का पता लगाएं. मस्तिष्क vasculature आकलन और रक्त वाहिकाओं के पैटर्न की जांच के बाद एक उपयुक्त लक्ष्य क्षेत्र का चयन करने के लिए लंबे पास फिल्टर का प्रयोग करें.
    8. पशु खपरैल में स्थिर, या रेट्रो orbitally जबकि जबकि छवि cortical vasculature को, या तो पूंछ नस में, 70,000 मेगावाट टेक्सास लाल संयुग्मित dextran (या इसके एनालॉग) के एक 1% समाधान इंजेक्षनपशु मोबाइल homecage में तैनात है. 860 एनएम के लिए ट्यून दो photon लेजर और प्रकाश उत्सर्जित इकट्ठा करने के लिए बैंड पास फिल्टर (590-650 एनएम) का उपयोग करें. Thy1 प्रमोटर के तहत न्यूरॉन्स की एक subpopulation में संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन GCaMP3 -, उदाहरण के लिए, YFP या सीए 2 + व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों कि neuronal आकारिकी या उपयोग neuronal गतिविधि के ठीक विवरण आकलन करने के लिए 515-560 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें.
    9. छवि अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
    10. इमेजिंग के बाद, शिकंजा ढीला द्वारा सिर निर्धारण हाथ से पशु छोड़ें. अपने पिंजरे में पशु लौटें और यह अगले इमेजिंग सत्र शुरू करने से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए आराम करने की अनुमति देते हैं.
    11. बाद में reimaging के लिए ब्याज (आरओआई) के हर क्षेत्र के निर्देशांक स्टोर. छवि एक ही समय के साथ ROIs, और निर्देशांक छवि ओवरलैप को अधिकतम करने के लिए हर समय समायोजित करें.
    12. छवियों का विश्लेषण और एक उपयुक्त softw का उपयोग कर तीन आयामी पुनर्निर्माण करना(उदाहरण के लिए, ImageJ, आदि) हैं.
  2. जाग माउस में आंतरिक ऑप्टिकल इमेजिंग मोबाइल Homecage के आसपास घूम रहा
    1. एक आंतरिक ऑप्टिकल इमेजिंग सेटअप की छवि अधिग्रहण कैमरा के तहत मोबाइल homecage इकट्ठे.
    2. एक खपरैल में प्रशिक्षित पशु लपेटें. मोबाइल homecage में पशु रखें. सिर निर्धारण हाथ में धातु धारक दबाना.
    3. एक 70% इथेनॉल के समाधान का उपयोग कर धूल से प्रत्यारोपित कवर कांच साफ और सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
    4. प्रत्यारोपित कांच पर ग्लिसरॉल की एक बूंद प्लेस और एक 8 मिमी दौर कवर पर्ची के साथ कवर.
    5. Contralateral नासारोम को हवा झटका ट्यूब विपरीत के साथ एक आपरेटर रखें.
    6. उच्च गति कैमरे की स्थिति को समायोजित करें और cortical वाहिका संरचना पर ध्यान केंद्रित.
    7. जहाजों का नक्शा प्राप्त करने के लिए एक कैमरा फिल्टर के बिना हरी बत्ती (फिल्टर 546BP30) का प्रयोग करें.
    8. लगभग 400 micrometers cortical सतह के नीचे, प्रांतस्था में गहरी ध्यान दें.
    9. छवि के लिए टीवह रक्त oxygenation स्तर पर निर्भर (बोल्ड) ऑप्टिकल संकेत, कैमरे के सामने 590LP फिल्टर जगह और लाल बत्ती (फिल्टर 630BP30) के साथ प्रांतस्था रोशन.
    10. यह समान रूप से overexposure से परहेज हित के क्षेत्र के माध्यम से वितरित किया जाता है, ताकि cortical सतह की रोशनी को समायोजित करें. ब्याज के क्षेत्र कैमरे के गतिशील रेंज के 70-90% खंड के भीतर गिर जाता है, ताकि रोशनी की तीव्रता को समायोजित करें.
    11. कैमरे से छवियों को इकट्ठा करने के लिए LongDaq छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
    12. कम आवृत्ति उत्तेजना (0.05 हर्ट्ज) के साथ प्रयोग के लिए प्रति सेकंड (1 और 10 तख्ते के बीच यानी,) 10 हर्ट्ज के लिए 1 की छवि अधिग्रहण आवृत्ति का प्रयोग करें.
    13. आंतरिक ऑप्टिकल संकेत के साथ किसी भी हस्तक्षेप को रोकने के लिए कमरे की बत्ती बंद कर.
    14. माउस मोबाइल homecage के लिए अनुकूल करने के लिए कम से कम 30 मिनट की अनुमति दें.
    15. उत्तेजना के बिना एक 6 मिनट प्रकरण के दौरान छवि आधारभूत गतिविधि.
    16. पैदा सी रिकॉर्ड करने के लिएortical गतिविधि, एक उच्च आवृत्ति (25 हर्ट्ज) 6 मिनट की कुल अवधि के लिए हवा कश के सफर के साथ एक 10 सेकंड ON/10 सेकंड बंद मोड (0.05 हर्ट्ज उत्तेजना) में नासारोम प्रोत्साहित.
    17. छवि अधिग्रहण के बाद, सिर निर्धारण हाथ से माउस रिलीज और अपने पिंजरे के लिए यह वापसी.
    18. उत्तेजना प्रतिक्रियाओं के आयाम शोर अनुपात करने के लिए उत्कृष्ट संकेत है, जिसके परिणामस्वरूप जाग पशुओं में अपेक्षाकृत अधिक हो जाते हैं, क्योंकि आवृत्ति के लिए अतिरिक्त डेटा को छानने का उपयोग न करें.
    19. छवियों *. TIF ढेर फ़ाइलों के प्राप्त सेट कन्वर्ट और जैसे, का उपयोग कर उन्हें आगे का विश्लेषण, खुला स्रोत फिजी सॉफ्टवेयर (ImageJ). छवि कैलक्यूलेटर उपकरण का उपयोग नासारोम उत्तेजना के दौरान प्राप्त तख्ते से आधारभूत सहज गतिविधि घटाएँ. वैकल्पिक रूप से, उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आवृत्ति डोमेन में डेटा फ़िल्टर.
  3. जाग माउस में पैच दबाना रिकॉर्डिंग मोबाइल Homecage के आसपास घूम रहा
    1. मोबाइल homecage इकट्ठे.
    2. एक खपरैल में प्रशिक्षित पशु लपेटें. बैक्टीरिया के संक्रमण को रोकने के लिए trimethoprime (5 मिलीग्राम / किग्रा) और sulfadoxine (25 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन. मोबाइल homecage में पशु रखें. सिर निर्धारण हाथ में धातु धारक दबाना.
    3. स्वच्छ और एक 70% इथेनॉल के समाधान या 0.5% chlorhexidine digluconate का उपयोग प्रत्यारोपित दंत सीमेंट 'टोपी' और कांच कवर बाँझ और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
    4. धीरे धीरे और सावधानी से धातु धारक से कांच कवर हटा दें.
    5. पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक cortical बफर ताज़ा और एक बाँझ hemostatic तंपन साथ मलबे से कपाल खिड़की साफ.
    6. Cortical बफर में जमीन इलेक्ट्रोड रखें.
    7. एक micromanipulator में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी headstage रखें.
    8. 6.5 से 8.5MΩ को लेकर नोक प्रतिरोध पर निशाना, borosilicate ग्लास से pipettes बनाना. एक intracellular समाधान के साथ पैच विंदुक भरें. पैच विंदुक समाधान की रचना है(मिमी) निम्नलिखित 8 KCl, 111 कश्मीर gluconate, 0.5 CaCl 2, 2 NaOH, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, 2 मिलीग्राम एटीपी, और 5 BAPTA, पीएच KOH के साथ 7.2 के लिए समायोजित किया गया. झिल्ली संभावित मूल्यों -12 एम वी 33 की गणना की तरल जंक्शन क्षमता के लिए सही किया जाना चाहिए.
    9. Stereotaxic निर्देशांक का उपयोग हित के क्षेत्र लक्ष्य, और जल्दी से पिपेट टिप पर मजबूत सकारात्मक दबाव बनाए रखते हुए दिमाग में इलेक्ट्रोड चाल है. ड्यूरा मेटर पैठ और विंदुक स्थिति के बाद, टिप प्रतिरोध को मापने और बाद के चरणों की सफलता दर को बेहतर बनाने के क्रम में 10-15% से अधिक की प्रतिरोध में वृद्धि हुई है, बताते हैं कि इलेक्ट्रोड त्यागें.
    10. आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों की सूजन से बचने के लिए आधे से सकारात्मक दबाव को कम. आगे कदम मानक "अंधा पैच" प्रोटोकॉल के समान हैं. , से रिकॉर्ड करने के लिए एक न्यूरॉन लगता है एक न्यूरॉन एक करीबी proximit में पाया जाता है जब तक एक stepwise फैशन में मस्तिष्क में टिप को कम करने के लिएपिपेट टिप के वाई, इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा परिवर्तन की एक विशेषता अस्थायी अनुक्रम द्वारा संकेत के रूप में. एक न्यूरॉन की मौजूदगी के महत्वपूर्ण संकेतक पिपेट की कई लगातार आगे कदम भर इलेक्ट्रोड प्रतिरोध में एक monotonic वृद्धि (तीन 2 माइक्रोन कदम भर पिपेट प्रतिरोध में आम तौर पर, एक 20% वृद्धि) है.
    11. लक्षित न्यूरॉन के साथ एक gigaseal संपर्क प्रपत्र, पिपेट की एक नकारात्मक दबाव और hyperpolarization लागू होते हैं.
    12. पूरे सेल विन्यास की स्थापना के लिए सेल करने के लिए एक बड़ा नकारात्मक दबाव का एक संक्षिप्त पल्स लागू करें. एक अच्छा सील रखने के लिए 2-3 माइक्रोन से इलेक्ट्रोड वापस लेना.
    13. समय की एक वांछित अवधि के दौरान रिकॉर्ड सहज या पैदा की गतिविधि, अप करने के लिए 20-40 मिनट.
    14. रिकॉर्डिंग के बाद, मस्तिष्क से पिपेट हटा दें.
    15. Cortical बफर ताज़ा करे या कपाल खिड़की पर सिलिकॉन चिपकने वाला की एक बूंद जगह, तो धातु धारक के शीर्ष पर एक दौर गिलास coverslip गोंद.
    16. Anim रिलीजशिकंजा ढीला द्वारा सिर निर्धारण हाथ से अल. अगली रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम एक दिन के लिए अपने पिंजरे में पशु लौटें.
    17. जैसे, FitMaster सॉफ्टवेयर, के साथ डेटा का विश्लेषण.
  4. आदी होना-dishabituation घ्राण टेस्ट जाग माउस में मोबाइल Homecage के आसपास घूम रहा
    1. एक साफ सूती टुकड़ा (2 एक्स 2 सेमी) अनुलग्न एक दो तरफा टेप का उपयोग मोबाइल homecage की दीवार के भीतर की ओर करने के लिए नल के पानी में डूबा हुआ है. कपास का टुकड़ा "लक्ष्य" क्षेत्र के बीच में स्थित है, इसलिए है कि दीवार के बाहरी तरफ रंग मार्करों रखकर चार क्षेत्रों में मोबाइल homecage दीवार विभाजित करते हैं. 'लक्ष्य' क्षेत्र के लिए दीवार खंड विपरीत सामना करना पड़ रहा headholder हाथ में पशु फिक्स और इसे 30 मिनट के लिए मोबाइल homecage के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. स्वच्छ कपास का एक टुकड़ा ले लो और 1% वेनिला निकालने की कुछ बूंदों के साथ यह गीला. Vanil ले जाने के एक साथ मोबाइल homecage दीवार पर साफ सूती बदलेंला गंध. 5 मिनट के लिए गंध प्रस्तुत करते हैं. गंध प्रस्तुति की अवधि के दौरान मोबाइल homecage की गतिविधियों पर नज़र रखने. पशु मोबाइल homecage आंदोलन के कुल समय के संबंध में 'लक्ष्य' जोन का सामना करना पड़ खर्च करता है कि संचयी समय को मापने के द्वारा गंध के हित के स्तर का अनुमान है.
    3. एक 5 मिनट अंतर - सत्र के अंतराल के साथ, वेनिला की गंध का उपयोग कर 5 मिनट आवेदन सत्र तीन बार दोहराएँ. हर सत्र में "वेनिला" कपास की एक ताजा टुकड़ा का प्रयोग करें.
    4. पिछले पांचवें सत्र के दौरान एक सामाजिक रूप से महत्वपूर्ण गंध के साथ पशु प्रस्तुत करते हैं. (विपरीत लिंग के एक जानवर से पूर्व दिवस पर प्राप्त) मूत्र की कुछ बूंदों के साथ कपास की क्लीन टुकड़ा गीले और 5 मिनट के लिए लक्ष्य क्षेत्र के बीच में जगह है.
  5. मोबाइल homecage के आसपास जाग माउस बढ़ने में उपन्यास गंध मान्यता
    1. मोबाइल homecage दीवार के बाहरी तरफ रंग मार्करों रखकर चार क्षेत्रों में दीवार विभाजित करते हैं. AttACH दो स्वच्छ कपास टुकड़े (2 एक्स 2 सेमी) (लक्ष्य जोन 1 और लक्ष्य क्षेत्र 2 के रूप में नामित) एक दूसरे का विरोध करने क्षेत्रों के बीच में दीवार के भीतर की ओर करने के लिए नल के पानी में डूबा हुआ है. लक्षित क्षेत्र के बाहर एक दीवार खंड का सामना करना पड़ headholder हाथ में पशु फिक्स और इसे 30 मिनट के लिए मोबाइल homecage के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. दोनों कपास ताजा लोगों के साथ टुकड़े बदलें:. जगह जोन 1 लक्ष्य को 1% वेनिला निकालने के साथ गीला एक कपास टुकड़ा और 2 जोन लक्षित करने के लिए पानी के नल के साथ एक दूसरे को गीला गंध के दौरान 10 मिनट के लिए मोबाइल homecage आंदोलनों का वीडियो रिकॉर्ड प्रस्तुति सत्र. पशु लक्ष्य क्षेत्र 1 का सामना करना पड़ खर्च करता है कि समय के प्रतिशत के रूप में भाग लेने गंध की गणना रिश्तेदार संचयी समय क्षेत्र 1 और 2 का सामना करना पड़ बिताया.
    3. एक 10 मिनट के अंतराल के बाद, बाद में 10 मिनट की अवधि के लिए homecage दीवार पर applicators की एक और जोड़ी जगह है. लक्ष्य क्षेत्र 1 और 1% केले ई के साथ गीला कपास applicator में "वेनिला" कपास रखेंलक्ष्य 2 जोन में xtract. मोबाइल homecage आंदोलनों का एक वीडियो रिकॉर्डिंग बनाओ. पशु जोन 1 और 2 का सामना करना पड़ संचयी समय के लिए उपन्यास गंध (लक्ष्य क्षेत्र 2) रिश्तेदार के साथ दीवार खंड का सामना करना पड़ खर्च करता है कि समय के प्रतिशत के रूप में उपन्यास गंध को वरीयता की गणना.

Representative Results

विधि यहाँ प्रस्तुत जाग, सिर तय की लेकिन अन्यथा आज़ादी से चलती है और बर्ताव चूहों में सूक्ष्म इमेजिंग या एकल कक्ष electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए करना है. 'जानवरों खोपड़ी सिर निर्धारण हाथ को मजबूती से तय हो गई है, जबकि पशु एक रियल (आभासी के खिलाफ), ठोस और परिचित वातावरण, में दो आयामों में स्थानांतरित कर सकते हैं. एयर उठाया मोबाइल homecage को चूहों Habituating दो बार दैनिक 2 घंटा प्रशिक्षण सत्र के 4-6 दिनों (चित्रा 1) के होते हैं. प्रशिक्षित पशु तो तुरंत प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ठेठ अध्ययन कुछ घंटों से कई दिनों या हफ्तों से लेकर अंतराल पर स्थान दिया गया है कि इमेजिंग सत्र या पैच दबाना रिकॉर्डिंग सत्रों के एक नंबर शामिल हैं. महत्वपूर्ण बात है, दोनों ऑप्टिकल और electrophysiological रिकॉर्डिंग एक ही प्रयोग के भीतर, संज्ञानात्मक या व्यवहार उत्तेजनाओं और readouts के साथ एक साथ किया जा सकता है.

के यांत्रिक स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिएप्रायोगिक पशुओं मोबाइल homecage (चित्रा 2) नेविगेट कर रहे थे, जबकि मोबाइल homecage में माउस के सिर निर्धारण, फ्लोरोसेंट संयुग्मित dextran के साथ और YFP व्यक्त cortical डेन्ड्राइट का लेबल cortical जहाजों की छवि दृश्यों एकत्र किए गए थे. जानवर की हरकत के दौरान मस्तिष्क के अधिक से अधिक विस्थापन आम तौर पर 1-1.5 micrometers से अधिक नहीं था. ये विस्थापन क्षैतिज दिशाओं में हुई और बहुत मुश्किल से ही गति कलाकृतियों का अनावश्यक किसी भी सुधार प्रतिपादन, इमेजिंग विमान के एक detectable पाली में हुई. मोबाइल homecage में स्थिर सिर निर्धारण anesthetized चूहों के रूप में एक ही विश्वसनीयता के साथ जाग पशुओं में व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. वृक्ष के समान रीढ़ घनत्व, आकृति विज्ञान और कारोबार के कुछ घंटों से कई दिनों या हफ्तों से लेकर अंतराल पर प्रदर्शन किया कई इमेजिंग सत्र के साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन के दौरान नजर रखी जा सकती है.

एम के प्रयोज्यThy1-GCaMP3 ट्रांसजेनिक चूहों पर मैं) दो photon माइक्रोस्कोपी और जंगली प्रकार चूहों में द्वितीय) आंतरिक ऑप्टिकल संकेत इमेजिंग: कार्यात्मक ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए obile homecage दो दृष्टिकोण का उपयोग जाग चूहों के somatosensory प्रांतस्था में परीक्षण किया गया था. सीए 2 + इमेजिंग सेल कई fluorescently लेबल न्यूरॉन्स के शव, साथ ही उनके dendrites और axons (चित्रा 3) शामिल हैं जो परत 2/3, में प्रदर्शन किया गया था. ब्याज (ROIs) के चयनित क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति से अधिक समय के भूखंडों मोबाइल homecage में माउस के सक्रिय नेविगेशन के दौरान (GCaMP3 प्रतिदीप्ति में क्षणिक वृद्धि के रूप में मापा) सहज neuronal गतिविधि का प्रदर्शन, 3 चित्र में दिखाया गया. आंतरिक संकेतों पर आधारित ऑप्टिकल इमेजिंग कार्यात्मक डोमेन के स्थानिक वितरण मानचित्रण की अनुमति देता है. चित्रा 4 वी के जवाब में somatosensory प्रांतस्था साथ प्रचारित किया कि (क्षेत्रीय neuronal सक्रियण दर्शाती) रक्त oxygenation स्तर में लहर की तरह परिवर्तन दिखाता है0.05 हर्ट्ज की आवृत्ति पर ibrissa उत्तेजना.

मोबाइल homecage साथ पैच दबाना रिकॉर्डिंग की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, हम 2-3 महीने पुराने C57BL/6J चूहों का इस्तेमाल किया. Somatosensory प्रांतस्था में परत 2/3 न्यूरॉन्स वर्तमान दबाना मोड का उपयोग पूरे सेल विन्यास में से दर्ज किए गए. जाग चूहों के मस्तिष्क में पैच दबाना रिकॉर्डिंग सिर तय मोबाइल homecage पर मस्तिष्क स्लाइसें में पैच clamping के अंधे को अनिवार्य रूप से समान था. प्रयास के लगभग 50% अधिक से अधिक 70% स्थिर पूरे सेल विन्यास रिकॉर्डिंग सामने आए हैं, जिनमें से सफल gigaseal गठन में हुई. कारण कोशिकाओं के यांत्रिक विस्थापन को gigaseal संपर्क खोने का कोई घटनाओं मनाया गया. 5 माउस के सक्रिय (चल रहा है) के एपिसोड और निष्क्रिय (विश्राम) राज्यों के साथ सहसंबद्ध एक प्रतिनिधि 10 मिनट लंबा वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग की एक 60 सेकंड टुकड़ा दिखाता है चित्रा.

चित्रा 1 चित्रा 1. मोबाइल homecage में जाग चूहों के सिर निर्धारण की विधि. ए) एयर उठाया मोबाइल homecage डिजाइन और एक ठेठ प्रयोगात्मक समय की सामान्य अवधारणा. बी) चित्र के चित्र का अवलोकन. अध्ययन में दो सप्ताह पूर्व से निपटने और आठ दो बार दैनिक प्रशिक्षण सत्र के बाद है जो रैपिंग, करने के लिए माउस habituating को कपाल खिड़की के आरोपण के साथ शुरू होता है. विशिष्ट अध्ययन कुछ घंटों से कई दिनों या हफ्तों से लेकर अंतराल पर स्थान दिया गया है कि इमेजिंग सत्र या पैच दबाना रिकॉर्डिंग सत्रों के एक नंबर शामिल हैं. दोनों ऑप्टिकल और electrophysiological माप एक ही प्रयोग के भीतर संज्ञानात्मक या व्यवहार उत्तेजनाओं और readouts के साथ समानांतर में किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


मोबाइल homecage के आसपास घूम रहा जाग चूहों पर दो photon सूक्ष्म इमेजिंग के चित्रा 2. उदाहरण. 70 केडीए टेक्सास लाल संयुग्मित dextran के साथ लेबल ए, बी) Cortical वाहिका संरचना,. व्यक्तिगत पोत क्षेत्रों के व्यास समय पर माउस के आराम और चल (ए) की अवधि के दौरान पोत लुमेन भर में तैयार की लाइनों के प्रोफाइल की साजिश रचने के द्वारा मापा जाता है. धमनियों और नसों में रक्त के प्रवाह की दर पोत दीवार (बी) के subpopulation में YFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क में कल्पना की neuronal आकारिकी की. सी, डी) ठीक विवरण के समानांतर तैयार की तर्ज पर लाइन स्कैनिंग से मापा जाता है Thy1 प्रमोटर के तहत न्यूरॉन्स. माउस के somatosensory प्रांतस्था (सी) में पिरामिड न्यूरॉन्स के तीन आयामी पुनर्निर्माण. एक वृक्ष के समान ख की छवियोंएक जाग, बर्ताव माउस में अधिग्रहण खेत व्यक्ति वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी (डी) माउस आंदोलनों की वजह से मस्तिष्क गति की. ई) मात्रा की मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर हैं. बड़ा आयाम displacements माउस की दौड़ के समय के साथ सहसंबंधी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
जाग Thy1-GCaMP3 माउस मोबाइल homecage के आसपास घूम में neuronal आबादी गतिविधि का आंकड़ा 3. उदाहरण. Cortical परत द्वितीय / तृतीय न्यूरॉन्स की एक) दो photon छवि. ROIs, उदाहरण के लिए neuronal सेल निकायों, dendrites और axons (समय ओं) पीला. बी में एक में दिखाया ROIs से GCaMP3 प्रतिदीप्ति की ΔF / एफ निशान दिखाए गए हैंसी में पीला ROIs से eries) 1.5 सेकंड / फ्रेम में दर्ज की गई. सी) तेजी से बढ़ी में 65 मिसे / फ्रेम में imaged क्षेत्र. डी) प्रतिदीप्ति समय के साथ साजिश रची, कार्रवाई करने के लिए संगत GCaMP3 प्रतिदीप्ति में क्षणिक बढ़ जाती है (लाल) से पता चलता है संभावित प्रेरित सीए 2 + बाढ़ एपिसोड. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
आंतरिक ऑप्टिकल संकेतों इमेजिंग के माध्यम से एक जाग माउस के प्रांतस्था में कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के स्थानिक वितरण मानचित्रण का आंकड़ा 4. उदाहरण. मोबाइल Ho में आधारभूत गतिविधि का कपाल खिड़की के माध्यम से सतही रक्त वाहिकाओं के एक) उज्ज्वल क्षेत्र देखें. बी) परिमाण का नक्शाएक 6 मिनट प्रकरण 0.05 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर नासारोम उत्तेजना के जवाब में somatosensory प्रांतस्था साथ प्रचार neuronal गतिविधि की. सी) परिमाण मानचित्र दौरान mecage. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
मोबाइल homecage के आसपास घूम रहा एक जाग माउस के प्रांतस्था में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग की चित्रा 5. उदाहरण. माउस cortical परत 2/3 में एक न्यूरॉन से एक) वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग. एक 0.5 सेकंड, (ट्रेस नीचे संकेत) 100-PA वर्तमान इंजेक्शन कार्रवाई क्षमता का एक फट में यह परिणाम है. सेल पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए कील आवृत्ति अनुकूलन विशेषता दिखाया. बी) सतत वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग(ट्रेस ऊपर गुलाबी में दिखाया गया है) माउस 'हरकत गतिविधि के साथ सहसंबद्ध ही न्यूरॉन से. माउस के (सी) आराम और (डी) चलाने की अवधि के दौरान परत 2/3 न्यूरॉन के प्रतिनिधि सहज गतिविधि. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
मोबाइल homecage में प्रशिक्षण सत्र के दौरान चित्रा 6. पशु वजन घटाने और head-fixed/non-fixed चूहों की हरकत गतिविधि. प्रशिक्षण सत्र से पहले एक) पशु वजन (+ एसडी,% मतलब है). वजन कम है कि पूरी तरह से 7-8 वें प्रशिक्षण सत्र मोबाइल homecage करने के लिए माउस का क्षैतिज हरकत रिश्तेदार की. बी) गति से उलट है ध्यान दें,8 वें प्रशिक्षण सत्र 8 वें प्रशिक्षण सत्र के सिर तय (वृत्त की. डी) अवधि) के दौरान दौर पिंजरे की खोज एक गैर सिर तय माउस की. सी) ट्रैक आंदोलनों के दौरान मोबाइल homecage का पता लगाया आंदोलन से extrapolated किया गया था और जो प्रशिक्षण के 1-4 वें दिन के दौरान गैर तय (त्रिकोण) चूहों आंदोलन (+ एसडी,% मतलब है). 4 दिन, सिर तय चूहों न तो दिन (1 पर) के रूप में ठंड और न ही अत्यधिक हरकत गतिविधि प्रदर्शित, ध्यान दें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

बेहतर मस्तिष्क शरीर विज्ञान और विकृति को समझते हैं, अनुसंधान प्रत्येक तैयारी के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक का उपयोग, तैयारी जटिलता के स्तर की एक किस्म पर किया जाना चाहिए. जाग और बर्ताव जानवरों पर प्रयोग एक महत्वपूर्ण methodological चुनौती का प्रतिनिधित्व किया है, जबकि वर्तमान में, तंत्रिका विज्ञान के तरीके की एक विस्तृत श्रृंखला (पूरे शरीर fMRI से उप organelle STED माइक्रोस्कोपी) आसानी से anaesthetized जानवरों के लिए लागू कर रहे हैं.

इधर, एक उपन्यास दृष्टिकोण एक प्रयोगशाला पशु, दृढ़ता से सिर तय होने के बावजूद, एक एयर उठाया मोबाइल homecage चारों ओर स्थानांतरित कर सकते हैं और तनाव मुक्त परिस्थितियों में इसकी ठोस पर्यावरण का पता लगाने जहां वर्णन किया गया है. यहाँ प्रस्तुत सिर तय बर्ताव पशु तैयारी महत्वपूर्ण लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. सबसे पहले, इस विधि के साथ प्राप्त electrophysiological या इमेजिंग डेटा संज्ञाहरण से और न ही विवश प्रेरित तनाव से न तो uncompromised हैं. मोबाइल घर में माउस की स्थितिपिंजरे जल्दी है और यहां तक ​​कि क्षणिक जानवर anesthetizing की आवश्यकता नहीं है. दूसरा, एयर उठाया homecage ठीक neuronal आकारिकी में बदलाव यों और जाग पशुओं में एकल कक्ष electrophysiological गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए जरूरी है कि यांत्रिक स्थिरता सुनिश्चित करता है. अंत में, मोबाइल homecage का डिजाइन इस प्रकार जाग माउस के मस्तिष्क में दो photon इमेजिंग या पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक मानक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत मोबाइल homecage को स्थिति की अनुमति, गोलाकार ट्रेडमिल की तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट है.

मोबाइल homecage में फर्म सिर निर्धारण अंतर्निहित मस्तिष्क क्षेत्र को ऑप्टिकल या बिजली का उपयोग के लिए केंद्र में एक दौर खोलने के साथ, एक विशेष रूप से डिजाइन चार पंखों वाला धातु धारक का आरोपण की आवश्यकता है. ये धातु धारकों गोंद, दंत सीमेंट और खोपड़ी की हड्डी में खराब एक छोटे बोल्ट का एक संयोजन के माध्यम से खोपड़ी से जुड़े होते हैं. इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया पहले की एक बड़ी संख्या के आधार पर विकसित किया गया थाप्रक्रियाओं प्रकाशित, और एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कपाल खिड़की तैयारी में परिणाम नहीं मिला. Vivo में electrophysiological प्रयोगों, एक चंद्रमा के आकार खिड़की 34, एक छोटे आकार के कपाल - उच्छेदन (कम से कम 0.5 मिमी) 32, और एक drilled कांच से ढके तैयारी 35 के लिए उपयोग किया गया है. यहाँ, "उल्टे" कपाल खिड़की एक बड़े (3.5 मिमी व्यास) या छोटे (कम से कम 0.5 मिमी व्यास) कपाल - उच्छेदन के साथ या तो प्रत्यारोपित किया गया था. मस्तिष्क आंदोलन को न्यूनतम यह electrophysiological प्रयोगों के लिए छोटे आकार craniotomies प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है, जिसके कारण स्थिर एकल कक्ष रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है. ऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोगों के लिए कपाल खिड़की के आरोपण पर, पशुओं खिड़की पहली क्षणिक अपनी पारदर्शिता खो देता है और उसके बाद पर निर्भर करता है, एक 50-70% उपज के साथ (यह आएगा जो अवधि के दौरान कम से कम 2 या 3 सप्ताह के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है माउस तनाव की आनुवंशिक पृष्ठभूमि). कपाल खिड़की और stabil की पारदर्शिताखोपड़ी से जुड़ी दंत सीमेंट 'टोपी' के अल्पसंख्यक जानवर से निपटने के दौरान एक नियमित द्विनेत्री माइक्रोस्कोप और भौतिक निरीक्षण के माध्यम से सत्यापित किया जा सकता है. 2-3 सप्ताह वसूली की अवधि के अंत में, दंत सीमेंट में अवशिष्ट के बाद परिचालन सूजन या यांत्रिक दोष के किसी भी संकेत है कि प्रदर्शन के उन जानवरों प्रयोगों से बाहर रखा गया है और समाप्त किया जाना चाहिए.

चूहों प्रशिक्षण शुरू करने के लिए इष्टतम उम्र 2-4 महीने (20-40 ग्राम के शरीर के वजन के लिए इसी) है. छोटे जानवरों में, खोपड़ी के लिए दंत सीमेंट 'टोपी' के प्रस्तोता मोबाइल homecage में सिर तय माउस की हरकत द्वारा लगाया गया है कि यांत्रिक तनाव को अपने लचीलापन कम हो सकती है, जो अविश्वसनीय हो सकता है. पुरुष और महिला चूहों मोबाइल homecage में नेविगेट करने के लिए समान रूप से तैयार दिखाई देते हैं, (डेटा) नहीं दिखाया मादा चूहों में उनके पारदर्शिता फिर से कपाल खिड़कियों के बेहतर प्रतिशत हासिल करने के लिए एक प्रवृत्ति है. इसलिए, में आदेश टीओ लगभग 30% अधिक नर चूहों में कपाल Windows दाखिल, इमेजिंग के लिए चयनित जानवरों की पलटन में लिंग का एक संतुलित मिश्रण सुनिश्चित की सिफारिश की है. सामाजिक संबंधों इसलिए यह littermates संचालित और प्रशिक्षित समानांतर में और समूह आवास पिंजरों में एक साथ रखा जाता है कि सलाह दी जाती है, जानवरों की भलाई में सुधार और तनाव को कम करने के लिए जाना जाता है.

गोलाकार ट्रेडमिल तैयारी 13 के लिए प्रकाशित प्रक्रियाओं के विपरीत, मोबाइल homecage उपयोग विधि सिर निर्धारण के क्षण में माउस anesthetizing की आवश्यकता नहीं है. यह भी एक संक्षिप्त और "प्रकाश" संज्ञाहरण प्रकरण के बाद शीघ्र ही प्राप्त की शारीरिक माप पर है की संभावना है कि किसी भी अवशिष्ट प्रभाव से इनकार करने के लिए अनुमति देता है क्योंकि यह अंतर महत्वपूर्ण है. दरअसल, भले ही सिर निर्धारण संज्ञाहरण के तहत किया गया था और वास्तविक प्रयोगों से नहीं कर सकते हैं, एक संक्षिप्त प्रतीक्षा अवधि 13 के बाद शुरू कर दिया गया है, जहां पढ़ाई मेंप्रयोगात्मक डेटा पर संक्षिप्त संज्ञाहरण प्रकरण के संभावित लंबे समय से स्थायी प्रभाव बाहर. अन्य अध्ययनों निर्धारण करने के लिए सिर पशुओं की व्यवस्थित आदी के लिए पानी के अभाव पर भरोसा किया और 36 स्थिर रहने के लिए पशु को प्रेरित करने के साधन के रूप में पानी इनाम का इस्तेमाल किया है. हालांकि, इनाम आधारित सिर निर्धारण पद्धति लागू व्यवहार परीक्षण का विकल्प सीमा और, महत्वपूर्ण बात है, अच्छी तरह से स्थापित प्रोत्साहन इनाम संघों में से एक में रह रहे हैं. इसके विपरीत, मोबाइल homecage में निर्धारण करने के लिए सिर माउस आदी की विधि पानी के अभाव और बाद में इनाम की आवश्यकता नहीं है.

एक जल वितरण प्रणाली के साथ मोबाइल homecage सप्लीमेंट लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों के लिए सिफारिश की है. यहाँ प्रस्तुत पशु प्रशिक्षण सत्र और प्रयोगों मानक 12 घंटा प्रकाश अनुसूची (ली के तहत रखा जाता है कि उन चूहों के लिए physiologically निष्क्रिय अवधि से मेल खाती है, (8:00-06:00) दिन के दौरान किया गया) 6 बजे 6 बजे और बंद पर ghts. पानी का सेवन सीधे माउस की गतिविधि के साथ जुड़ा हुआ है के बाद से एक प्रशिक्षण / इमेजिंग / रिकॉर्डिंग सत्र की अवधि 2 घंटा से अधिक नहीं है, निष्क्रिय अवधि चूहों के दौरान पानी के वितरण की आवश्यकता नहीं है. प्रशिक्षण सत्र का समय और अवधि के अलावा, एक मोबाइल homecage को जानवरों habituating के लिए आवश्यक सत्र के इष्टतम संख्या के मुद्दे से निपटने की जरूरत है. मैं) वजन घटाने, और द्वितीय) हरकत गतिविधि स्तर: अंत करने के लिए, दो मापदंड सिर निर्धारण प्रक्रियाओं से प्रेरित तनाव का मूल्यांकन किया गया. चित्रा 6 में दिखाया गया है, वजन घटाने प्रशिक्षण दिन 2 पर 6% की औसत स्तर तक पहुँच जाता है, और पूरी तरह से प्रशिक्षण सुबह 4 (चित्रा 6A) से उलट है. लगातार तौलना गतिशीलता के साथ, सिर तय जानवरों की हरकत गतिविधि स्तर के प्रशिक्षण के पहले दिन पर दबा दिया जाता है, लेकिन प्रशिक्षण सुबह 4 (चित्रा 6D) द्वारा स्थिर. इन मापों के आधार पर हमने सुझावएतद्द्वारा प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में मोबाइल homecage पर माउस प्रशिक्षण अवधि की न्यूनतम अवधि, 4 दिन है कि टी.

एयर उठा लिया, फ्लैट फिदा मोबाइल homecage का उपयोग सिर तय चूहों के लिए प्रशिक्षण मानदंड को जटिल कार्य (ज्ञानेन्द्रिय, अनुभूति, और संज्ञानात्मक) को जोड़ने की अनुमति देता है. अध्ययन में मौजूद व्यवहार परीक्षण के दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं. दोनों प्रोटोकॉल गंध cues का उपयोग और माउस प्रांतस्था में अनुदैर्ध्य इमेजिंग / रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा जा सकता है. मोबाइल homecage nonabsorbent सामग्री से निर्मित है, एक अभी भी खाते में डिवाइस और परीक्षण गंध (ओं) की गंध के बीच संभव interferences लेने की जरूरत है. एक व्यवहार प्रयोग के दृश्य / स्पर्श cues के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि एक और पहलू सहज नहीं है और, इसलिए, एक मील का पत्थर के रूप में जानवर ने माना जा सकता है जो दीवार और डालने के बीच जंक्शन है. यह यहां देख रही लायक है, कि इस तरह क ¥ दौरान पशु के संकट को कम करने के क्रम मेंमोबाइल homecage दीवार के लिए एक गंध पेश कपास की नियुक्ति के रूप में rventions, प्रयोगवादी जितना ज्यादा हो सके इस तरह के हस्तक्षेप प्रदर्शन और कार्बन पिंजरे के लंबे समय तक हैंडलिंग से बचने के लिए अभ्यास करना चाहिए. उपन्यास गंध / वस्तु प्रस्तुति के लिए वैकल्पिक रणनीतियों हाइड्रोजेल आधारित समाधान पशु के सिर स्थिति के साथ संगत ऊंचाई पर कार्बन पिंजरे दीवार की भीतरी सतह से जुड़ी छोटी अलमारियों पर चला जाता है या (जैसे खाद्य चिप्स के रूप में) वस्तुओं रखकर, जैसे, बोधगम्य हैं.

मोबाइल homecage सिर तय जानवरों क्षैतिज हरकत, situp, संवारने whisking, वर्तमान अध्ययन में सचित्र रूप forelimbs के साथ, नाक poking, कुशल सामने पंजा आंदोलनों, और दीवार को छू, चाट सहित दो आयामी आंदोलनों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शन करने की अनुमति देता है . मोबाइल homecage और यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रयोग, शोधकर्ताओं उत्तेजना हालत दोनों पर नियंत्रण के एक उच्च स्तर के साथ ज्ञानेन्द्रिय neuronal प्रणाली का अध्ययन कर सकते हैंएस और व्यवहार पढ़ें बहिष्कार. इसके अलावा, जाग चूहों में संज्ञानात्मक क्षमताओं की पढ़ाई कंडीशनिंग, स्थानिक नेविगेशन और निर्णय लेने की कार्य के दौरान किया जा सकता है.

इस विधि के कई व्यावहारिक सीमाएं हैं. सबसे पहले, दबाव हवा का एक महत्वपूर्ण राशि homecage उठाने शक्ति प्राप्त करने के लिए और लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों प्रदर्शन करने की जरूरत है. दूसरा, अपने वर्तमान कार्यान्वयन में मोबाइल homecage व्यास में केवल 18 सेमी है, और इसलिए एक जटिल प्रयोगात्मक वातावरण किसी भी स्थानिक प्रतिबंध के बिना बनाया जा सकता है, जहां आभासी वास्तविकता, की तुलना में एक अपेक्षाकृत छोटे और सरल अंतरिक्ष प्रदान करता है. तीसरा, गलमुच्छा उत्तेजना और यहाँ प्रस्तुत इनाम आधारित प्रयोगों के दौरान, एक युक्ति संभावना माउस के लिए दीवार से संपर्क करें कि सीमा इस्तेमाल किया गया था. (जैसे एक आंख का निर्देशन प्रकाश प्रोजेक्टर के रूप में) एक बाहरी दृश्य या संवेदी उत्तेजना चैनल के अलावा तुलना में एक अधिक ergonomic और कॉम्पैक्ट डिवाइस को डिजाइन करने की आवश्यकता होगीगोलाकार ट्रेडमिल प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है जो एक से अधिक स्क्रीन या गुंबद के प्रक्षेपण समाधान.

संक्षेप में, हवा से उठा लिया मोबाइल homecage में चलती सिर तय चूहों का उपयोग बहुत एक ही प्रयोग के भीतर अवलोकन और गड़बड़ी की, सेलुलर आणविक और व्यवहार के स्तर है कि गठबंधन के अध्ययन की सुविधा. यहाँ सचित्र विशिष्ट अनुप्रयोगों दो photon इमेजिंग सूक्ष्म, आंतरिक ऑप्टिकल संकेत इमेजिंग और गैर anesthetized बर्ताव चूहों में पैच दबाना रिकॉर्डिंग में शामिल हैं. यह इस दृष्टिकोण जाग, बर्ताव माउस पर प्रयोग में नए क्षितिज खोल सकते हैं और दवा के विकास और मस्तिष्क समारोह के बुनियादी अनुसंधान दोनों के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम करेगा कि उम्मीद है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि पर अपने बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए प्रो Eero Castren धन्यवाद. काम फिनलैंड के अंतर्राष्ट्रीय गतिशीलता, और तंत्रिका विज्ञान की फिनिश ग्रेजुएट स्कूल (मस्तिष्क और मन डॉक्टरल प्रोग्राम) के लिए फिनलैंड के अकादमी, केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tweezers, Stainless Steel, 115 mm XYtronic XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine Aesculap Isis GT420
Binocular Microscope Zeiss Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad Supertech TMP-5b
Blunt microsurgical blade BD REF 374769
Borosilicate tube with filament Sutter Instruments BF120-69-10 For patch pipette production
Camera  Foscam FI8903W Night visibility
Carprofen Pfizer Rimadyl vet
Dental cement DrguDent, Dentsply REF 640 200 271
Dexamethasone FaunaPharma Rapidexon vet
Disposable drills Meisinger HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10x Sigma D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm FST 91150-20
Eyes-lubricant Novartis Viscotears For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion 
Foredom drill control Foredom  FM3545
Foredom micro motor handpiece Foredom MH-145
Four-winged metal holder Neurotar
Head Holder for Mice Narishige SG-4N Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge Avitene, Ultrafoam BARD Ref 1050050
Imaris Bitplane
Ketamine Intervet Ketaminol vet
Kwik-Sil  WPI
Mai Tai DeepSee laser Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm Aesculap BD302R
Microelectrode puller Narishige PC-10H Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator Sensapex
Mini bolt Centrostyle Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope Olympus FV1000MPE
Nonwoven swabs, 5 x 5 Molnlycke Health Care Mesoft Surgical tampons
Polyacrylic glue Henkel Loctite 401
Round glass coverslip Electron Microscopy Sciences 1.5 thickness
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900
Student iris scissors, straight 11.5 cm FST 91460-11
Xylazine Bayer Health Care Rompun vet

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References

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Kislin, M., Mugantseva, E., Molotkov, D., Kulesskaya, N., Khirug, S., Kirilkin, I., Pryazhnikov, E., Kolikova, J., Toptunov, D., Yuryev, M., Giniatullin, R., Voikar, V., Rivera, C., Rauvala, H., Khiroug, L. Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents. J. Vis. Exp. (88), e51869, doi:10.3791/51869 (2014).

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