Summary
この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。
Abstract
これは、広く一般的な麻酔薬の使用は、生きている動物の脳から得た電気生理学的または顕微鏡データの関連性を弱体化させることができることを認めている。また、麻酔からの長い回復が長期的研究での繰り返し記録/イメージング·エピソードの頻度を制限します。したがって、非麻酔下の振舞いをマウスから、安定した録画を可能にする新たな方法は、細胞と認知神経科学の分野を進めることが期待される。既存のソリューションは、単なる物理的な拘束からこのようなコンピュータによって生成された仮想現実と組み合わせて使用される線形および球形のトレッドミルのような、より洗練されたアプローチの範囲です。ヘッド固定マウスは空輸モバイルホームケージの周りを移動し、ストレスのない条件の下でその環境を探索することができますのはここ、新規な方法が記載されている。この方法では、研究者が同時に行動試験（ 例えば 、学習、慣れや新規物体認識）を実行することができます二光子顕微鏡イメージングおよび/またはパッチクランプ記録を、すべて単一の実験で組み合わせる。この映像資料は、覚醒動物の頭部固定装置（モバイルホームケージ）の使用を記載し、動物の馴化の手順を示していて、方法の可能なアプリケーションの数を例示している。
Introduction
神経科学での刺激的な最近の傾向は、目を覚まし、行動するげっ歯類の脳内の神経回路網のプロービング分子·細胞のための実験的なアプローチを開発することである。このようなアプローチは、運動機能、感覚統合、知覚、学習、記憶だけでなく、傷害の進行、神経変性および遺伝性疾患の根底にある神経生理学的プロセスに新たな光を当てることを約束したままにします。さらに、目を覚まし、動物の脳から記録することは、新たな治療薬や治療法の開発に可能性を秘めています。
一般的に、神経生理学的実験に使用されている麻酔は、潜在的に実験結果の誤った解釈をもたらす、脳機能の基本的なメカニズムに影響を与えることができることを意識の高まりがある。このように、広く使われている麻酔薬ケタミンは急速に新たな樹状突起棘の形成を増加させ、シナプス機能1を強化する。他の一般的に使用されるanesthet外科麻酔レベルでのICイソフルランは完全に新生ラットとブロック内の自発的な皮質活動成体動物2スピンドルバースト振動を抑制します。現在では、アプローチの限られた数の二光子顕微鏡イメージング又はパッチクランプ記録により、非麻酔したマウスでの実験を可能にする。これらのアプローチは、自由に移動し、頭部固定製剤に分けることができる。
自由に動く動物の調製のユニークな魅力は、それが、ナビゲーション中に全身の動きを含む自然現象の評価を可能にすることである。自由に移動し、げっ歯類の脳内の画像への一つの方法は、小型化されたヘッドマウント顕微鏡やファイバースコープ3-5を添付することです。しかし、小型化された装置は、対物系二光子顕微鏡法に比べて制限された光学性能を有する傾向があり、容易に全細胞パッチクランプ記録6と組み合わせることはできません。
EXIヘッド固定目覚め齧歯類用スティング·ソリューションは、物理的な拘束7,8または自主ヘッドレスト9を示すことが動物を訓練のいずれか主に依存してきた。他の一般的なアプローチは、 例えば 、動物の手足はそれを置くことで移動できるように球形トレッドミル10です。このアプローチは、多くの場合、コンピュータで生成された仮想現実と組み合わされる。ヘッド固定したマウスでの電気生理学的実験は、主に細胞外記録を使用していたし、心血管機能11の中央制御、ニューロンの活動12に対する麻酔の影響、脳幹13情報処理14における聴覚反応を研究するために使用された。目を覚まし振舞いを動物で先駆的な細胞内/細胞全体の記録が2000年代に実施し、知覚と運動、15〜20に関連した神経活動に焦点を当てている。同じ頃、目を覚ましたマウスの最初の顕微鏡イメージング研究がPUBた2光子顕微鏡を物理的に抑制したラット7の感覚皮質に球状トレッドミル21上で動作しているマウスで使用されたlished、。
その後のインビボ顕微鏡および電気生理学の研究は、頭部固定の準備が正常に前肢の動き、臭気認識、泡立て、そして8,22-25をなめるに基づいて、行動パラダイムと組み合わせることができることを実証した。球状トレッドミル上に置かれたマウスは、コンピュータ10,26によって生成された仮想的な視聴環境をナビゲートするために訓練することができる。細胞内/細胞外記録は、このような仮想環境をナビゲートする頭部固定動物において、海馬場所細胞の活性化が27を検出することができる、ことを証明した。仮想視覚的な環境では、マウスがアクティブな動き27時の局所電場電位とシータ相歳差で通常の移動に関連したシータリズムを示しています。最近では、空間的および時間的activit神経細胞集団のYパターンは、仮想環境28のメモリの決定作業 を作業中にマウスでは、光学的に記録された。
画期的な研究を可能にしたにもかかわらず、球状のトレッドミルのデザインは、いくつかの固有の制限があります。まず、動物は、壁やバリアなど全く有形の障害にならない回転空輸ボール、無制限の表面に移動させるために必要とされている。視覚入力がこれらの種が自然に依存している触覚感覚入力（ 例えば 、ウィスカータッチまたはなめる）と比較して、マウスおよびラットに、おそらくあまり効果的であるため、この制限は、コンピュータで生成された「仮想現実」によって補償部分であるだけで上。第二に、ボール表面のかなりの曲率をケージ内の平らな床の上を歩いてするために使用する実験用マウスのために不快なことがあります。最後に、ボールの膨大な直径（マウスおよびラットのための300ミリメートルのための少なくとも200ミリメートル）は、球状の垂直方向のサイズをレンダリング比較的大きなトレッドミル装置。これは、それが困難な市販の顕微鏡のセットアップの大部分球形トレッドミルを組み合わせることになり、多くの場合、カスタムメイドの顕微鏡のフレームを用いてトレッドミルの周りの新しいセットアップを構築する必要があります。
ヘッド固定マウスは平らな床有形壁が特徴空輸モバイルホームケージの周りを移動し、ストレスのない条件下での物理的な環境を探索することができのはここ、新規な方法が記載されている。この記事では、マウスのトレーニングと頭部固定の手順を示していて、2光子顕微鏡、固有の光学イメージングとパッチクランプ記録が目を覚まし振舞いをマウスの脳内で行われている代表的な例を提供しています。
Protocol
ここで紹介するすべての手順は、動物のケア（動物実験（2006分の62）にフィンランドACT）のためのローカルのガイダンスに従って行った。動物ライセンス（ESAVI/2857/04.10.03/2012）は、地方自治体（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）から入手した。成体マウス（生後1〜3ヶ月、体重20〜40グラム）は、ヘルシンキ大学の認定を動物施設におけるグループの住宅ケージで飼育し、餌と水を自由に与えた。
1。頭蓋窓注入
以下に簡単に説明するように頭蓋窓は、わずかな変更を加えて公開されたプロトコルに応じて29から31に移植されています。
- 頭蓋窓注入を開始する前に、機器を滅菌する。術後合併症のリスクを最小限に抑えるために、手術中に無菌状態を維持する。
- 鎮痛剤を投与し（ケトプロフェン、2.5 mg / kg）を30分で手術前と24時間後に手術。アンケタミン（80 mg / kgで）の混合物を使用して、マウスをesthetizeおよびキシラジン（10 mg / kgの）を腹腔内注射した。定期的に足をつまんで麻酔深度を監視します。 37.0℃で、動物の体温を維持するために、加熱パッドを使用し手術によって誘導される炎症や脳浮腫を軽減するために、皮下注射によってデキサメタゾン（2ミリグラム/ kg）を管理します。
- 乾燥なってから目を保護するために目の潤滑剤を塗布。マウスの頭を剃ると剃らエリアを清掃してください。額に首筋からのラインに沿って、外科はさみや鉗子を用いて皮膚をカット。頭蓋骨に接続された任意の結合組織を除去します。
- じっくりと高速外科ドリルを使って左の前頭骨に小さな井戸のドリル。掘削井戸に（材料を参照）、ミニボルトをねじ込みます。ねじのない複数の半フルターンを行っていません。
注：直接表面的な皮質血管の上に配置されたそれらの領域を避けてください。これらのVESの破壊SELSは大量出血につながることができます。 - 開頭を実行するには、右頭頂骨に円形の窓（直径3〜3.5ミリメートル）を開けます。 100μg/mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した蒸留H 2 O中の皮質バッファのドロップ（125mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、2mMのCaCl 2を 、および2mMのMgSO 4を適用する/ ml）と慎重に円形の窓の内側に配置された骨の一部を除去。
注：細胞の特定の亜集団で蛍光タンパク質を発現する手順のこの時点で、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたは他のウイルスベクターの頭蓋内注射を実行する。 - 頭蓋窓の丸いガラスカバースリップ（＃1.5厚みコード）を置きます。アクリル接着剤で頭蓋骨にカバースリップを取り付けます。カバースリップの上に金属製ホルダーを配置し、歯科用セメント、ポリアクリル接着剤の混合物で固定します。
注：上記の手順は、頭蓋のWindows用に最適化されています光学イメージング実験に使用した。電気生理学的実験に適した「反転」頭蓋窓を製造するために、別の手順を使用します。まず、頭蓋骨に金属ホルダーを接着します。ビデオに例示したようにホルダーの開口部内に円形の窓を開けます。代わりに、脳の動き32を防止または最小化するために、関心領域にわたって小さい開頭（直径0.5mm未満）を作る。皮質バッファを更新するか、頭蓋窓上のシリコーン接着剤の滴を配置し、丸いガラスカバースリップで閉じます。 - 操作が完了した後に、容易にアクセス可能な食料と水を温めてケージに動物を配置します。それは麻酔から完全に回復した後にのみ、グループの住宅ケージに動物を返します。移動する不本意、飲食、体重減少、流涎、立毛、または異常な呼吸音などの痛みの兆候を検出すると、再投与する鎮痛剤、。
2。アニマLの取り扱い
- そのケージからマウスを取り出し、単純に5〜10分間、それを保持します。動物の処理中に冷静に、ぎくしゃくした動きや音を立てないようにしてください。
- 取り扱った後、そのケージにマウスを返す。
- 実験者とのマウスを快適にするために、取り扱いのエピソードの間に不均等な間隔で処理手順2-3Xを繰り返します。
- 小さな柔らかい布切れを取り、不等間隔で動物2〜3倍をラップします。
- 動物は落ち着いてラップさに慣れる必要があります。マウスは興奮して緊張している場合は、取り扱いやラッピングの手順を繰り返します。
3。ペットのためのトレーニング
- 取り扱いやラッピングに慣れた後、次の日が終了し、モバイルホームケージ内の動物のトレーニングを開始。
- 動物の前とトレーニング中に毎日量る記録します。
NOTE：トレーニング中に、動物がその重量の10％以上を失った場合は、トンから除外すべき彼の実験。 - 訓練された動物の大きさに合わせるために、モバイル装置のホームケージ頭部固定アームの垂直位置を調整する。標準的な実験加圧された空気出口（典型的には、ガスタンクいるか、すなわち 、約5バール〜300リットル/分、十分に高い圧力および空気流の速度を提供する空気ポンプ）への装置の空気入口に接続します。
- ぼろ動物をラップします。
- ヘッド固定アームに、動物の頭に取り付けられた金属製ホルダーを挿入して、しっかりとネジを締めて固定します。空気の流れをオンにして、空気の流れが空輸ホームケージの自由浮揚に最適であることを確認してください。ぼろを削除することで、モバイルホームケージに動物を放します。
- ノイズに動物を慣らすために、すべてのトレーニングセッション中だけでなく、実験の間（例えば、ラジオや録音された音楽や音声を使用して）周囲の音を一定のエクスポージャーを提供します。
- D最初のトレーニングセッションをuring、トレーニングセッションが終了するまで消灯して、最初の1時間に室内光を保持します。
- モバイルホームケージでの訓練の2時間後に、頭部固定から動物を解放し、水や食料の供給とのケージに戻します。安静時の条件下で少なくとも2時間そのままにしておきます。
- 70％エタノール溶液を用いて、各トレーニングセッションの後、モバイルホームケージをきれいにし、水道水ですすいでください。使い捨てのペーパータオルで水を吸い取り、次に使用する前に、モバイルホームケージを乾燥させます。
- 動物が訓練されている間に室内灯で、2時間の連続した研修を行ってはオフ。
- 一日二回のトレーニングセッションを実行します。
- 8から12のトレーニングセッションの後、一度に最大2時間の実験セッションで動物を使用しています。
注：以上の1〜2時間持続する長時間のトレーニングセッション中に、マウスWを提供することを検討手動またはモバイルホームケージフレームに取り付けられたピペットホルダを用いて送達することができる飲料水、i番目。あるいは、水は、モバイルホームケージの壁に直接ハイドロゲルの粘性の液滴を配置することによって、動物の自由摂取用に供給することができる。
注：いずれかの慢性的なストレスの影響を除外するために訓練する前に、毎日動物を比較検討することを忘れないでください。どの時点でも、そのような凍結、発声、またはストレス誘発性の下痢などのストレス反応を示して、いる場合の実験からの動物を除外します。
4。アプリケーション
- モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける二光子イメージング
- モバイルホームケージを組み立てます。ブリッジヘッド固定アームの位置を確認してください。
- ぼろの訓練を受けた動物をラップします。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームに金属ホルダーを固定します。ぼろを削除します。
- 使用してほこりから注入されたカバーガラスを清掃してください70％エタノール溶液で、それを乾燥させる。
- カバークラス上の浸漬液の滴を配置します。水はすぐに蒸発するので、好ましくは、粘性のある溶液を使用しています。
- （あなたは、顕微鏡のセットアップで静止している第二に、同一のデバイスを持っていない限り）、顕微鏡下で訓練された動物と、モバイルホームケージデバイスを配置します。
- カスタムメイドまたはフェムト秒パルス赤外線レーザを備えた市販のレーザー走査型顕微鏡イメージングシステムのいずれかを使用して撮像を行う。
- 蛍光顕微鏡の広視野モードを使用して、関心領域を見つける。脳血管系を評価し、血管のパターンを調べた後、適切なターゲット領域を選択するために、長いパスフィルタを使用してください。
- 画像皮質血管系への、ながら動物はぼろに固定化されている間のどちらか尾静脈に70,000 MWのテキサスレッド結合デキストラン（またはその類似体）の1％溶液を注入、または眼窩動物はホームケージに移動配置される。チューニング860 nmの二光子レーザ出射光を収集するためにバンドパスフィルタ（590-nm）を使用する。 THY1プロモーター下神経細胞の亜集団における感受性蛍光タンパク質GCaMP3 - 、例えば、YFPまたはCa 2 +を発現するトランスジェニックマウスを神経形態や利用ニューロン活動の細部を評価するために515から560 nmの発光フィルターを使用してください。
- 画像取得のための適切なソフトウェアを使用してください。
- 画像形成後、ネジを緩めてヘッド固定アームから動物を解放する。そのケージに動物を返し、それが次の撮影セッションを開始する前に少なくとも2時間、休息することができます。
- その後の再イメージのために関心領域（ROI）のすべての領域の座標を格納します。画像と同じ時間をかけてのROI、および座標の画像の重なりを最大化するたびに、調整してください。
- 画像を分析し、適切なSOFTWを使用して3次元再構成を行う（ 例えば 、ImageJは、等）である。
- モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける固有の光学イメージング
- 固有の光学イメージングセットアップの画像取得カメラの下、モバイルホームケージを組み立てます。
- ぼろの訓練を受けた動物をラップします。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームへの金属ホルダーを固定します。
- 70％エタノール溶液を使用してほこりから注入されたカバーガラスをきれいにし、それを乾燥させます。
- 注入されたガラス上グリセロールの低下を置き、8ミリメートルラウンドカバーガラスでそれをカバーしています。
- 対側感覚毛とは反対の送風管を用いてマニピュレータを配置します。
- 高速度カメラの位置を調整し、皮質血管系の上に焦点を当てています。
- 船舶·マップを取得するために、カメラのフィルターなしで緑色光（フィルター546BP30）を使用します。
- 約400マイクロメートル皮質表面の下に、大脳皮質に深く集中する。
- 画像Tへ彼の血液酸素化レベル依存性（BOLD）光信号は、カメラの前で590LPフィルターを配置し、赤色光（630BP30フィルター）で皮質を照らす。
- それは均等に露出オーバーを回避する、関心領域を介して配信されるように、皮質表面の照明を調整する。関心領域は、カメラのダイナミックレンジ70〜90％のセグメント内に収まるように照度を調整します。
- カメラの画像を収集するためにLongDaq画像取得ソフトウェアを使用してください。
- 低周波数刺激（0.05ヘルツ）での実験のために（1秒当たり10フレームとの間、すなわち 、）1〜10 [Hz]の画像取得周波数を使用する。
- 本来の光信号との干渉を防ぐために、ルームライトのスイッチを切る。
- マウスはモバイルホームケージに適応するために少なくとも30分を許可します。
- 刺激なしの6分のエピソードの間に画像のベースラインの活動を。
- 誘発Cを記録するにはortical活動は、高い周波数（25 Hz）の6分の合計期間の空気パフの列と10秒ON/10秒OFFモード（0.05 Hzの刺激）に感覚毛を刺激。
- 画像取得後は、ヘッド固定アームからマウスを離すとそのケージに戻します。
- 刺激応答の振幅が対雑音比が優れた信号になり、覚醒動物では比較的高い傾向があるため、周波数の追加データ·フィルタリングを使用しないでください。
- 画像への*。TIFスタックファイルの取得したセットを変換し、 例えば 、使用してさらにそれらを分析、オープンソースフィジーのソフトウェア（ImageJの）。画像計算ツールを使用して、感覚毛の刺激の間に得られたフレームからベースライン自発的活動を引きます。あるいは、適切なソフトウェアを用いて周波数領域のデータをフィルタ。
- モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおけるパッチクランプ記録
- モバイルホームケージを組み立てます。
- ぼろの訓練を受けた動物をラップします。細菌感染を防ぐためにtrimethoprime（5 mg / kg）をし、スルファド（25 mg / kgの）を管理。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームへの金属ホルダーを固定します。
- クリーンおよび70％エタノール溶液または0.5％のグルコン酸クロルヘキシジンを用いて移植歯科用セメント「キャップ」、カバーガラスを殺菌し、乾燥させる。
- じっくりと金属ホルダーからカバーガラスを取り外します。
- ペニシリン、ストレプトマイシンを補充した皮質のバッファを更新し、滅菌止血タンポンと破片から頭蓋窓を清掃してください。
- 皮質バッファに接地電極を配置します。
- マイクロマニピュレータに電気生理学ヘッドステージに配置します。
- 6.5から8.5MΩまでの先端抵抗を目指し、ホウケイ酸ガラスからピペットを製作。細胞内液とパッチピペットを埋める。パッチピペット溶液の組成物である（単位：mm）以下の8のKCl、111グルコン酸K、0.5のCaCl 2、2のNaOH、10グルコース、10 HEPES、2のMg-ATPおよび5 BAPTA、pHはKOHで7.2に調整した。膜電位の値は-12 mVで33の計算された液間電位差を補正しなければなりません。
- 定位座標を用いて、関心領域を対象とし、速やかにピペットチップに強い正の圧力を維持しながら、脳に電極を移動します。 硬膜浸透およびピペット位置決めした後、先端抵抗を測定し、後続のステップの成功率を向上させるために、より多く10〜15％の抵抗増加を示す電極を捨てる。
- 周囲の脳組織の膨潤を避けるために、半分に正の圧力を低下させる。更なるステップは、標準的な「盲」プロトコルに似ています。から記録するニューロンを見つけるニューロンが近いproximitで検出されるまで、段階的に脳にチップを下げるために電極インピーダンスの特性が変化する時系列で示すように、ピペットチップのY、。ニューロンの存在の重要な指標は、ピペットの複数の連続した前進のステップにわたって電極抵抗の単調増加（32μmのステップにわたってピペット抵抗の一般的には、20％増）である。
- 対象となるニューロンとギガシール接触を形成するために、ピペットの負圧と過分極を適用します。
- 全細胞構成を確立するために、セルに大きな負圧の短いパルスを印加する。良好なシールを維持するために、2〜3程度で電極を撤回。
- 所望の期間中に記録自発的または誘発作用、最大20〜40分。
- 記録した後、脳からピペットを取り外します。
- 皮質バッファを更新するか、頭蓋窓上のシリコーン接着剤の滴を配置し、金属ホルダーの上に丸いカバーガラスを接着します。
- アニムをリリースネジを緩めてヘッド固定アームからアル。次の記録の前に少なくとも1日のケージに動物を返します。
- 例えば 、FitMasterソフトウェアを使用してデータを分析します。
- モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける馴化 - 脱馴化嗅覚テスト
- きれいな綿片（2×2cmに）取り付ける両面テープを使用してモバイルホームケージの壁の内側に水道水に浸漬した。コットン片を「標的ゾーン」の中間に位置するように、壁の外側にカラーマーカを配置することによって、4つのゾーンに移動ホームケージ壁に分割する。 「ターゲット」ゾーンに壁部分の反対に直面してheadholderアームに動物を固定し、それを30分間、モバイルホームケージに適応することができます。
- きれいな綿の別の部分を取り、1％のバニラエッセンス数滴とそれを濡らす。 vanilを運ぶ1モバイルホームケージの壁にきれいな綿を交換してくださいLA匂い。 5分間の香りを提示する。匂いの提示期間中にモバイルホームケージの動きを追跡。動物は、モバイルホームケージの移動の合計時間に関連して「ターゲット」ゾーンに直面して費やした累積時間を測定することにより、臭いの関心のレベルを推定する。
- 5分間のセッション間隔で、バニラの香りを使用して5分間のアプリケーションセッションを3回繰り返します。すべてのセッションでは「バニラ」綿の新鮮な一枚を使用してください。
- 最後の第五のセッション中に、社会的に重要な臭いで動物を提示します。 （反対の性別の動物から、前の日に取得した）尿数滴の綿のきれいな部分を湿らせ、5分間のターゲットゾーンの真ん中に配置します。
- モバイルホームケージの周りに起きて、マウスの移動における新しい匂い認識
- モバイルホームケージ壁の外側にカラーマーカを配置することによって、4つのゾーンに分割する壁。 ATTきれいな綿のach 2個（2×2 cm）を（ターゲットゾーン1及びゾーン2ターゲットとして指定された）互いに対向する区域の中央に壁の内側に水道水に浸漬した。標的ゾーンの外側の壁セグメントに面するheadholderアームに動物を固定し、30分間、モバイルホームケージに適応することを可能にする。
- ゾーン1とゾーン2を対象とする水道水で濡れた別のものを対象とする1％のバニラエキスで濡れ場所コットンワンピース匂いの間に10分間のモバイルホームケージの動きを映像を記録します。新鮮なものとの両方の綿の部分を交換してください。プレゼンテーションセッション。動物がターゲットゾーン1に直面している時間の割合として出席臭いを計算する相対累積時間は、ゾーン1と2に直面しました。
- 10分間隔の後に、その後の10分の期間のためにホームケージの壁にアプリケータの別のペアを配置します。 1％のバナナeでターゲットゾーン1内の「バニラ」コットンと綿棒濡れを配置ターゲットゾーン2内XTRACT。モバイルホームケージの動きを録画してください。動物は、ゾーン1と2が直面する累積時間に対する新規匂い（ターゲットゾーン2）相対で壁セグメントに直面している時間の割合としての新規匂いに優先を計算します。
Representative Results
ここで紹介する方法は、顕微鏡イメージングや目を覚まし、頭を固定、それ以外は自由に移動し、行動するマウスでの単一セルの電気生理学的記録を対象としています。動物の頭蓋骨がヘッド固定アームにしっかりと固定されている動物は、現実に（仮想ではなく）、有形慣れた環境での二次元で移動することができる。空輸モバイルホームケージにマウスをHabituatingことは毎日二度2-HRのトレーニングセッションの4-6日間（ 図1）で構成されています。訓練された動物は、次いで、直ちに実験に使用することができる。代表的な研究では、数時間から数日または数週間の間隔で配置されている画像化セッションまたはパッチクランプ記録セッションの数が含まれています。重要なことに、光学的および電気生理学的記録の両方は、単一の実験内で、認知または行動刺激および読み出しと同時に行うことができる。
の機械的安定性を評価するためにモバイルホームケージ内でマウスの頭部固定実験動物は、モバイルホームケージ（ 図2）をナビゲートしながら、蛍光共役デキストランおよびYFPを発現する皮質樹状突起の標識された皮質の血管の画像シーケンスを収集した。動物の歩行運動中の脳の最大変位は、通常、1〜1.5マイクロメートルを超えなかった。これらの変位は、水平方向に発生せず、非常にまれにモーションアーチファクトの不必要な任意の修正をレンダリングする、撮像面の検出可能な変化をもたらした。モバイルホームケージでの安定したヘッド固定は、麻酔したマウスと同じ信頼性で目を覚まし、動物の個々の樹状突起棘の定量化を可能にする。樹状突起棘密度、形態および代謝回転は、数時間から数日または数週間の範囲の間隔で実行される複数の撮像セッションでの縦断的研究の間監視することができる。
Mの使いやすさTHY1-GCaMP3トランスジェニックマウスおよび野生型マウスにおけるii）の固有の光信号に結像i）の二光子顕微鏡法：機能性光学イメージングのためobileのホームケージは、2つのアプローチを用いて覚醒マウスの体性感覚皮質において試験した。のCa 2 +イメージングは、細胞の多くの蛍光標識されたニューロンの体、ならびにそれらの樹状突起と軸索（ 図3）を含むレイヤ2/3、で行った。インタレスト（関心領域）の選択された領域からの蛍光オーバータイムのプロットは、モバイルホームケージ内のマウスの積極的なナビゲーション中（GCaMP3蛍光の一過性の増加として測定される）自発的な神経活動を示す、 図3に示します。本来の信号に基づいて光学的画像は、機能ドメインの空間分布をマッピングすることができます。 図4は、Vに対応して体性感覚野に沿って伝播（地域ニューロンの活性化を反映した）血液酸素レベルの波のような変化を示している0.05ヘルツの周波数でibrissa刺激。
モバイルホームケージとパッチクランプ記録の実現可能性をテストするために、我々は2〜3ヶ月齢のC57BL/6Jマウスを使用していました。体性感覚皮質の層2/3ニューロンは電流クランプ·モードを使用して全細胞構成でから記録した。目を覚ましたマウスの脳内でのパッチクランプ記録は、ヘッド固定モバイルホームケージには、脳スライスパッチクランプブラインドと本質的に類似していた。試みの約50％が70％以上で安定した全細胞構成記録を得、そのうちの成功ギガシールの形成をもたらした。により細胞の機械的変位にギガシールの接触を失うことのない事象は認められなかった。 図5は、代表的な10分の長い電流クランプがマウスのアクティブな（実行中）のエピソードとパッシブ（休息）状態と相関して記録する60秒のフラグメントを示しています。
図1。モバイルホームケージにおける覚醒したマウスの頭部固定方法。 A）空輸モバイルホームケージの設計と典型的な実験のタイムラインの一般的な概念。B）図のイラストの概要。研究では、2週間前の取り扱いと8毎日二度のトレーニングセッションに続いて、ラッピング、マウスをhabituatingに頭蓋窓の移植で始まる。代表的な研究では、数時間から数日または数週間の間隔で配置されている画像化セッションまたはパッチクランプ記録セッションの数が含まれています。両方の光学的および電気生理学的測定は、単一の実験内の認知や行動の刺激と読み出しと並行して行うことができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。モバイルホームケージの周りを移動起きてマウスでの2光子顕微鏡イメージングの例。 70kDaのテキサスレッド結合デキストランで標識した、B）皮質血管系、。個々の血管セグメントの直径は、経時的に、マウスの休止と稼働（A）の期間中に血管内腔を横切って描かれた線のプロファイルをプロットすることにより測定される。動脈および静脈の血流の速度、血管壁（B）に平行に引かれた線に沿って線走査によって測定される。の亜集団においてYFPを発現するトランスジェニックマウスの脳において視覚化ニューロン形態のC、D）ファイン詳細THY1プロモーター下ニューロン。マウスの体性感覚野（C）における錐体ニューロンの三次元再構成。樹状Bの画像目を覚まし、行動するマウスで取得された牧場では、個々の樹状突起棘の形態（D）の定量化のために十分に安定している。マウスの動きによって引き起こされる脳の運動のE）の定量化。大きな振幅の変位は、マウスのランニングの期間と相関している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。モバイルホームケージの周りを移動覚ましTHY1-GCaMP3マウスにおけるニューロン集団活動の例。皮質層のA）の二光子画像Ⅱ/Ⅲ神経細胞。 ROIを、例えば、神経細胞体、樹状突起と軸索が黄色で表示されます。（時間Sに示す関心領域からGCaMP3蛍光のB）ΔF/ Fトレースeries）は1.5秒/コマで記録された。C）ズームインされた領域65ミリ秒/フレームで画像化した。D）C言語で黄色のROIからの蛍光を経時的にプロットし、アクションに対応GCaMP3蛍光の一過性の増加（赤）を示している潜在的に誘導されるのCa 2 +流入のエピソード。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4固有の光学信号をイメージングによる覚醒マウスの皮質における機能的応答の空間分布をマッピングする例。モバイルホにおけるベースライン活性の頭蓋窓を介して表面的な血管のA）明視野図である。B）マグニチュード·マップ0.05ヘルツの周波数で感覚毛の刺激に反応して体性感覚野に沿って伝搬する神経活動の6分間のエピソード。C）マグニチュードマップ中にmecage。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。モバイルホームケージの周りを移動起きてマウスの皮質の全細胞パッチクランプ記録の例。マウス皮質層2/3のニューロンからA）の電流クランプ記録。 （トレースの下に示されている）0.5秒、100-PA電流注入は、活動電位のバーストになる。細胞は錐体細胞のためのスパイク頻度順応特性を示した。B）連続電流クランプ記録を（トレース上のピンク色で示されている）マウスの '自発運動と相関し、同じニューロンから。マウスの（C）を休止および（D）を実行している期間中のレイヤ2/3のニューロンの代表的な自発活動は、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
モバイルホームケージでのトレーニングセッションの間に図6。動物の体重減少とhead-fixed/non-fixedマウスの自発運動。トレーニングセッションの前にA）動物の体重（+ SD、％を意味する）。その体重減少が完全に7-8 回目のトレーニングセッション、モバイルホームケージにマウスの水平移動の相対的な。B）弾道で逆転される注意、ヘッド固定（円）のどのトレーニングセッション、第 8の間、モバイルホームケージの追跡動きから外挿した。C）トレーニングセッション、第 8の間に丸いケージを模索非ヘッド固定マウスの動きを追跡した。D）持続し、訓練の1-4日目の間に固定されていない（三角）マウスの動き（+ SD、％を意味する）。 4日目に、ヘッドを固定したマウスは、いずれも（1日目として）凍結や過度の運動活性を示すことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Discussion
より良い脳生理学と病理学を理解するために、研究は各調製のための最も適切な技術を利用し、準備の複雑さの様々なレベルで実行する必要があります。目覚めと行動する動物実験は、かなりの方法論的な課題を代表しているが現時点では、神経科学の方法論の広い範囲（フルボディのfMRIからのサブオルガネラSTED顕微鏡に）容易に、麻酔動物に適用される。
ここでは、新たなアプローチが実験動物は、しっかりと頭に固定であるにもかかわらず、空輸モバイルホームケージの周りに移動することができますし、ストレスのない条件で、その具体的な環境を探検する場所に記載されている。ここで紹介するヘッド固定振る舞う動物の準備は非常に重要、多くの利点を提供します。まず、この方法で得られた電気生理学や撮影データは、麻酔によっても拘束誘起応力によってどちらも妥協である。モバイルホームにマウスの位置ケージは、迅速であり、さらには一過性に動物を麻酔は必要ありません。第二に、空輸ホームケージは細かい神経細胞の形態の変化を定量化すると、目を覚まし動物で単一細胞の電気生理学的活動を記録するために必要とされる機械的安定性を確保します。最後に、モバイルホームケージの設計は、球状のトレッドミルと比較して、よりコンパクトであり、従って、覚醒マウスの脳における二光子イメージング又はパッチクランプ記録のための標準的な正立顕微鏡下でモバイルホームケージを配置することができる。
モバイルホームケージで確固たる頭部固定は、基礎となる脳領域への光または電気的アクセスのための中心部にある円形の開口部に、特別に設計された4翼金属ホルダーの移植を必要とします。これらの金属ホルダは、接着剤、歯科用セメントおよび頭蓋骨にねじ込ま小さなボルトの組み合わせによって頭蓋骨に取り付けられている。この外科的処置は、以前は多数に基づいて開発された公開された手順を、安定かつ再現可能な頭蓋窓製剤をもたらすことが見出された。 in vivoでの電気生理学的実験で、月状の窓34、小型開頭（0.5mm未満）32、および掘削ガラス張りの準備35のために利用されている。ここで、「反転」頭蓋窓を大きく（直径3.5mm）、小さい（0.5mm未満の直径）開頭術のいずれかを移植した。脳の動きを最小限にすることは、電気生理学的実験のために、小さなサイズの開頭術を実行することをお勧めします理由である、安定した単一細胞記録のために重要である。光学イメージング実験のための頭蓋窓の移植時に、動物は、ウィンドウが最初に一過性透明性を失い、その後に応じて、50〜70％の収率で（それを回復する期間中に少なくとも2〜3週間、回復させマウス系統の遺伝的背景）。頭蓋窓とSTABILの透明性頭蓋骨に装着歯科用セメント「キャップ」のITYは、動物取扱中に一定双眼顕微鏡および物理的な検査によって確認することができます。 2〜3週間の回復期間の終了時に、歯科用セメントの残留後の運用炎症または機械的な欠陥の兆候を示し、これらの動物は、実験から除外して終了する必要があります。
マウスを訓練開始するための最適な年齢は2〜4ヶ月（20〜40 gで体重に相当）である。若い動物では、頭蓋骨に歯科用セメント「キャップ」のアンカーは、モバイルホームケージに頭固定のマウスの移動によって課されている機械的ストレス、その回復力を低下させる可能性がある、信頼できない可能性がある。雄および雌マウスは、モバイルホームケージ内をナビゲートすることも同様喜んで現れるが、雌マウスにおいて透明性を回復頭蓋窓（データは示していない）のより良好な比率を達成する傾向がある。したがって、T順番でO約30％以上の雄マウスに頭蓋窓を注入する、イメージングのために選択された動物のコホートにおける性別をバランスよく配合を確保することをお勧めします。社会的相互作用は、従ってそれは同腹子が操作訓練を受けた群と並列に収納用のケージに一緒に保持されることをお勧めし、動物の福利を改善し、ストレスを軽減することが知られている。
球状のトレッドミルの準備のために13公開された方法とは対照的に、モバイルホームケージを利用する方法は、ヘッド固定の時点でマウスを麻酔は必要ありません。それも簡単にし、 "光"麻酔のエピソードがまもなく後に得られた生理学的測定に基づいている可能性が高いことを任意の残留効果を除外することができますので、この違いは重要です。実際、研究で頭部固定は麻酔下で行われていた場所にもかかわらず、実際の実験は1ができない、短時間の待機期間13の後に開始されました実験データに簡単な麻酔エピソードの可能性長期的な影響を除外します。他の研究では、36不動のままに動物をやる気にさせるための手段として固定し、使用する水の報酬を頭に動物の体系的な慣れのために水の欠乏に頼ってきた。しかし、報酬ベースのヘッド固定方法は、適用可能な行動試験の選択肢を制限し、、重要なのは、十分に確立された刺激 - 報酬関連の1を占めている。これとは対照的に、モバイルホームケージに固定を頭にマウス馴化の方法は、水の欠乏とその後の報酬を必要としません。
水供給システムを有するモバイルホームケージを補完する長期的な実験のために推奨されます。ここで紹介するペットのためのトレーニングセッションや実験は、標準的な12時間の明スケジュール（LI下に保持されたマウスのための生理的に受動的な期間に相当する、（午前8時から午後6時までの間）、昼間に行われた午後6時午前6時とオフにGHTS）。水の摂取を直接マウスの活動と関連しているので、トレーニング/撮像/記録セッションの持続時間は2時間を超えない場合、パッシブマウス期間中に水供給を必要としない。トレーニングセッションのタイミング及び継続時間に加えて、1つは、モバイルホームケージに動物をhabituatingために必要なセッションの最適数の問題に対処する必要がある。 i）の重量損失、およびii）自発運動レベル：この目的のために、2つの基準は、頭部固定手順によって誘起される応力を評価した。 図6に示すように、重量損失は、トレーニング2日目に6％の平均レベルに達し、完全に訓練4日目（ 図6A）によって反転される。一貫して重さのダイナミクスと、頭固定の動物の自発運動レベルは、訓練の初日に抑制されているが、訓練4日目（ 図6D）によって安定化させる。これらの測定値に基づいて、我々はsuggesここプロトコルで説明したように、モバイルホームケージ上のマウスの訓練期間の最小限の期間は、4日間でトン。
空輸、フラットの床のモバイルホームケージの使用は、ヘッドを固定したマウスのためのトレーニングパラダイムに複雑なタスク（感覚、知覚、認知）を追加することができます。本研究では行動試験の2のプロトコルが提示されています。両方のプロトコルは、臭気の手がかりを利用して、マウスの大脳皮質における縦イメージング/レコーディングと組み合わせることができます。モバイルホームケージが非吸収性材料から製造されていますが、1はまだ考慮にデバイスとテスト臭（S）の香りの間で可能な干渉を取る必要があります。行動実験の視覚的/触覚的合図を妨害するもう一つの要因は、シームレスではない、したがって、ランドマークなどの動物によって知覚され得る壁とインサートとの間の接合である。ここは注目に値する、そのような統合の際に、動物の苦痛を最小にするためにモバイルホームケージ壁への臭気提示綿の配置などrventionsは、実験者は、可能な限り迅速な介入を行い、炭素ケージの長時間の処理を避けるために練習してください。小説臭い/オブジェクトのプレゼンテーションのための代替戦略が考えられる、 例えば動物の頭の位置に対応して高さの炭素ケージ壁の内側表面に付着し、小さな棚の上に、ハイドロゲルベースのソリューションを配置すると、ドロップしたり（例えば、食品チップなど）のオブジェクト。
本研究で示されているように、モバイルホームケージは、水平移動、situp、舐めて、泡立てる、グルーミング、鼻突く、熟練した前足の動き、および壁は前肢に触れるなど、2次元の動きの広い範囲を実行するために頭部を固定した動物を可能にする。モバイルホームケージやここで紹介するプロトコルを使用して、研究者は、刺激条件の両方を制御性の高い感覚ニューロン系を研究することができますSと行動の読み取りアウト。さらに、覚醒マウスでの認知能力の研究はエアコン、空間ナビゲーションと意思決定の作業中に実行することができます。
この方法のいくつかの実際的な制限があります。まず、加圧された空気のかなりの量がホームケージリフティング力を達成し、長期的な実験を行うために必要とされる。第二に、その現在の実装では、モバイルホームケージは直径わずか18センチ、したがって、複雑な実験環境が空間的制約を受けることなく設計することができる仮想現実に比べて比較的小型でシンプルな空間を提供する。第三には、ここで紹介するウィスカの刺激と報酬ベースの実験の間、デバイスはマウス用の可能性の壁接触を制限する使用された。 （このような目を向けられた光プロジェクターなど）外部の視覚や感覚刺激チャネルの追加は、と比較して、より人間工学的でコンパクトな装置の設計が必要となる球状のトレッドミルの実験で使用されてきた複数画面又はドーム投影溶液。
要約すると、空輸モバイルホームケージに移動するヘッド固定マウスの使用が大幅に単一の実験中の観察と操作の、携帯分子および行動のレベルを組み合わせた研究を容易にします。ここに示された特定のアプリケーションでは、非麻酔下の振舞いをマウスで2光子顕微鏡イメージング、内因性光信号イメージングとパッチクランプ記録が含まれています。なお、この方法は目を覚まし、挙動マウスの実験で新しい展望を開き、薬剤開発および脳機能の基礎研究の両方のための有用なツールとして役立つことが期待される。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、原稿の彼の貴重なコメントのために教授エーロカストレンに感謝します。作品は、フィンランドの国際的な流動、および神経科学のフィンランド大学院（脳と心博士後期課程）のためのフィンランドアカデミー、センターからの補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
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