Summary
שיטה זו יוצרת סביבה מוחשית, מוכרת לעכבר כדי לנווט ולחקור במהלך הקלטות מיקרוסקופיות הדמיה או תא בודד אלקטרו, אשר דורשות קיבוע איתן של ראשו של בעל החיים.
Abstract
זה נרחב הודה כי השימוש בהרדמה כללית יכול לערער את הרלוונטיות של נתונים אלקטרו או Microscopical המתקבלים מהמוח של חית חיים. יתר על כן, ההחלמה הממושכת מהרדמה מגבילה את התדירות של פרקים להקלטה / הדמיה חוזרות ונשנות במחקרים ארוכי טווח. לפיכך, שיטות חדשות שתאפשר הקלטות יציבים מעכברים מתנהגים לא הרדים צפויות לקדם את תחומי מדעי המוח סלולריים וקוגניטיביות. פתרונות קיימים נעים בין עצם ריסון פיזי לגישות מתוחכמות יותר, כגון הליכונים ליניארי וכדוריים המשמשים בשילוב עם מציאות וירטואלית ממוחשבת. הנה, שיטה חדשה מתוארת בי עכבר קבוע בראש יכול להסתובב homecage הנייד הרים את האוויר ולחקור את סביבתו בתנאים ללא מתח. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבצע בדיקות התנהגותיות (למשל, למידה, התרגלות או זיהוי אובייקט רומן) בו זמנית עםשני פוטונים הדמיה מיקרוסקופית ו / או הקלטות תיקון מהדק, כל שילוב בניסוי יחיד. וידאו מאמר זה מתאר את השימוש במכשיר ער קיבוע ראש החיה (homecage הנייד), מדגים את הנהלים של התרגלות לבעלי חיים, ומדגים מספר היישומים האפשריים של השיטה.
Introduction
מגמה האחרונה מרגשת בתחום מדעי המוח היא לפתח גישות ניסיוניות למולקולריים ותאי חיטוט של רשתות עצביות במוח של ער, מתנהג מכרסמים. גישות כאלה מחזיקות מבטיחות לשפוך אור חדש על תהליכים נוירופיזיולוגיים העומדים בבסיס תפקוד מוטורי, אינטגרציה חושית, תפיסה, למידה, זיכרון, כמו גם התקדמות פציעה, ניוון מוחיים ומחלות גנטיות. יתר על כן, הקלטה מהמוח של החיה ערה טומנת בחובו הבטחה בפיתוח של סוכנים טיפוליים חדשניים וטיפולים.
קיימת מודעות הולכת וגדלה כי הרדמה, אשר שימוש בו נפוצות בניסויים נוירופיזיולוגיות, יכולה להשפיע על המנגנונים הבסיסיים של תפקוד המוח, שעלול להוביל לפרשנות מוטעה של ממצאים ניסיוניים. לפיכך, קטמין ההרדמה בשימוש נרחב במהירות מגביר היווצרות של קוצים הדנדריטים חדשים ומשפר את התפקוד הסינפטי 1; עוד anesthet נפוץisoflurane ic ברמות הרדמה כירורגית מדכא לחלוטין את פעילות בקליפת המוח ספונטנית אצל חולדות שזה עתה נולד ותנודות-פרץ ציר לוקים בבעלי חיים מבוגרים 2. נכון לעכשיו, רק מספר מוגבל של גישות לאפשר ניסויים בעכברים שאינם מורדמים באמצעות הדמיה מיקרוסקופית שני פוטונים או הקלטות תיקון מהדק. ניתן לחלק את הגישות אלה להכנות באופן חופשי מרגשות וקבוע בראש.
האטרקטיביות הייחודית של הכנת בעלי חיים לנוע בחופשיות היא שהיא מאפשרת הערכה של התנהגות טבעית, כולל תנועות גוף כולו במהלך ניווט. דרך אחת לתמונה בתוך המוח של מכרסם לנוע בחופשיות היא לצרף מיקרוסקופ רכוב ראש מיניאטורי או fiberscope 3-5. עם זאת, מכשירים ממוזערים נוטים להיות בעלי ביצועים אופטיים מוגבלים בהשוואה לשני פוטונים במיקרוסקופ המבוסס על מטרה, ולא ניתן לשלב בקלות עם הקלטות תא התיקון-clamp כל 6.
Exiפתרונות עוקץ לתיקון ראש מכרסם ערה הסתמכו בעיקר גם על ריסון פיזי 7,8 או בהכשרת בעלי החיים להפגין איפוק ראש מרצון 9. גישה פופולרית נוספת היא לאפשר לאיברים של בעלי החיים לנוע על ידי הצבתו ב, למשל, הליכון כדורי 10; גישה זו לעתים קרובות בשילוב עם מציאות וירטואלית ממוחשבת. ניסויים אלקטרו על עכברים קבוע בראש שמשמשים בעיקר הקלטות תאיים ושמשו ללמוד רגולציה מרכזית של תפקוד לב וכלי דם 11, השפעות של הרדמה על פעילות עצבית 12, התגובה השמיעתית בגזע המוח 13 ועיבוד מידע 14. הקלטות החלוצים תאיים / כל התא בבעלי חיים מתנהגים ער בוצעו ב2000s והתמקדו בפעילות עצבית הקשורים לתפיסה והתנועה 15-20. בערך באותו הזמן, מחקרי הדמיה המיקרוסקופיים הראשונים על עכברים ער היו פאבראיתי אור, שבו שני פוטונים במיקרוסקופ שימש בקליפה המוטורית של חולדות מאופקות פיזי 7 ועל עכברים רצים על הליכון כדורי 21.
מחקרי מיקרוסקופיה ואלקטרופיזיולוגיה לאחר in vivo הראו כי הכנת קיבוע הראש יכולה להיות משולבת בהצלחה עם פרדיגמות התנהגותי המבוססות על תנועות forelimb, זיהוי ריח, ומעיף, ומלקקים את 8,22-25. עכברים שהונחו על הליכון הכדורי יכולים להיות מאומנים כדי לנווט בסביבה החזותית הווירטואלית שנוצרה על ידי מחשב 10,26. הקלטות תאי / תאיים, הוכיחו כי, בבעלי חיים קבועים בראש ניווט סביבה וירטואלית כגון, הפעלה של תאים בהיפוקמפוס מקום ניתן לאתרם 27. בסביבה חזותית וירטואלית, עכברים להפגין קצב תטא נורמלי הקשורים לתנועה בפוטנציאל המקומי השדה ונקיפת תטא השלב במהלך תנועה פעילה 27. לאחרונה, activit המרחב ובזמןדפוסי y של אוכלוסיות נוירונים נרשמו אופטי בעכברים במהלך העבודה משימות החלטת זיכרון בסביבה וירטואלית 28.
למרות שאפשר פריצת דרך במחקר, יש לו את עיצוב הליכון הכדורי כמה מגבלות מובנות. ראשית, נדרש בעלי החיים לנוע על פני השטח בלתי מוגבל של כדור הרים באוויר מסתובב, שאינו מהווה מכשולים מוחשיים, כגון קירות או מחסומים. הגבלה זו היא רק בחלק פיצוי "המציאות מדומה" המחשב שנוצר, כי קלט חזותי הוא לטעון פחות יעיל בעכברים וחולדות בהשוואה לקלט החושי המישוש (למשל, זיף בנגיעה או ללקק), שמינים אלה באופן טבעי לסמוך הלאה. שנית, העקמומיות הניכרת של פני השטח הכדור עשויה להיות לא נוחה לעכברי מעבדה המשמשים להליכה על רצפה שטוחה בכלובים שלהם. לבסוף, בקוטר העצום של הכדור (לפחות 200 מ"מ לעכברים ו300 מ"מ לחולדות) הופך את הגודל האנכי של כדורימכשיר הליכון גדול יחסית. זה עושה את זה קשה לשלב הליכון כדורי עם רוב setups מיקרוסקופיה זמין מסחרי, ולעתים קרובות דורש בניית התקנה חדשה סביב הליכון באמצעות מסגרות מיקרוסקופ בהזמנה אישית.
הנה, שיטה חדשה מתוארת בי עכבר קבוע בראש יכול להסתובב homecage הנייד הרים את האוויר שכוללת רצפה שטוחה וקירות מוחשיים, ולחקור את הסביבה הפיסית בתנאים ללא מתח. מאמר זה מדגים את הנהלים של אימוני עכבר וקיבוע הראש, ומספק דוגמאות מייצגות שבו הקלטות של שני פוטונים במיקרוסקופ, דימות אופטי פנימי ותיקון-clamp מבוצעות במוח של עכברים מתנהגים ער.
Protocol
כל ההליכים שהוצגו כאן בוצעו על פי הנחיות מקומיות לטיפול בבעלי חיים (החוק הפיני בניסויים בבעלי החיים (62/2006)). הרישיון של בעלי החיים (ESAVI/2857/04.10.03/2012) הושג מרשות מקומית (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). עכברים בוגרים (גיל 1-3 חודשים, גרם במשקל 20-40) הוחזקו בכלובי קבוצה לדיור במתקן בעלי החיים מאושרים מאוניברסיטת הלסינקי ומסופקים עם מזון ומים כהרצון.
1. השרשה חלון גולגולתי
חלון גולגולתי הוא מושתל על פי פרוטוקולים שפורסמו 29-31 עם שינויים קלים, כפי שתארו בקצרה להלן:
- לעקר את המכשירים לפני תחילת חלון ההשתלה גולגולתי. לשמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח כדי למזער את הסיכון לסיבוכים לאחר ניתוח.
- לנהל משכך כאבים (Ketoprofen, 2.5 מ"ג / קילוגרם) 30 דקות לפני הניתוח ו24 לאחר ניתוח משאבי אנוש.esthetize העכבר באמצעות תערובת של קטמין (80 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) הזריק intraperitoneally. באופן קבוע לפקח על עומק ההרדמה על ידי צביטת כפה. השתמש בכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב37.0 ° C. כדי להפחית את הדלקת נגרם על הניתוח ובצקת מוחית, לנהל dexamethasone (2 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקה תת עורית.
- החל סיכה העין כדי להגן על העיניים מפני מקבל יבש. לגלח את ראשו של העכבר ולנקות את האזור המגולח. חותכים את העור באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגית לאורך הקו מהעורף למצח. הסר את כל רקמת חיבור הצמודה לגולגולת.
- לאט ובזהירות לקדוח באר קטן על העצם השמאלי הקדמי באמצעות מקדח כירורגים במהירות גבוהה. בורג בורג מיני (ראה חומרים) לתוך הבאר שנקדחה. לבצע שום סיבובים מלאים יותר מפעם אחת וחצי של הבורג.
הערה: יש להימנע מאותם אזורים שנמצאים ישירות מעל כלי קליפת המוח השטחי. שיבוש של Ves אלהSels יכול להוביל לדימום מסיבי. - כדי לבצע פתיחת גולגולת, לקדוח חלון עגול (3-3.5 מ"מ בקוטר) בעצמות הקודקודית הימנית. החל ירידה של חיץ קליפת המוח (125 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, גלוקוז 10 מ"מ, 10 HEPES מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, ו -2 מ"מ 4 MgSO במזוקק H 2 O בתוספת 100 יחידות פניצילין / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהסיר בזהירות את החלק של העצם הנמצא בתוך החלון העגול.
הערה: כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי בsubpopulation מסוים של תאים, לבצע הזרקה תוך גולגולתי של ויראלי adeno הקשורים וקטור (AAV) או וקטורים נגיפיים אחרים, בשלב זה בהליך. - מקם coverslip עגול זכוכית (קוד עובי # 1.5) על החלון גולגולתי. צרף את coverslip לגולגולת עם דבק polyacrylic. הנח בעל מתכת על גבי coverslip ולתקן אותה עם התערובת של מלט שיניים ודבק polyacrylic.
הערה: ההליך המתואר לעיל היא מותאם לחלונות גולגולתהמשמש בניסויי הדמיה אופטיים. כדי להכין חלון גולגולתי "הפוך" מתאים לניסויי אלקטרו, להשתמש בהליך שונה. ראשית, להדביק את בעל מתכת לגולגולת. מקדחה חלון עגול בתוך הפתיחה של בעל כפי שהודגם בווידאו. לחלופין, להפוך את פתיחת גולגולת קטנה יותר (פחות מ 0.5 מ"מ קוטר) על פני האזור של עניין על מנת למנוע או למזער את תנועת מוח 32. רענן החיץ בקליפת המוח או מקום טיפה של דבק סיליקון על החלון גולגולתי, ולאחר מכן לסגור אותו עם coverslip זכוכית עגול. - לאחר שסיימתי את הפעולה, מקום חי בכלוב מחומם עם מזון ומים נגישים בקלות. להחזיר את בעל החיים לכלוב קבוצה לדיור רק לאחר שהוא מתאושש באופן מלא מהרדמה. Re-לנהל משכך כאבים על גילוי כל סימנים של כאב, ובכלל זה חוסר רצון לזוז, לאכול או לשתות, ירידה במשקל, הפרשת ריר, piloerection או קולות נשימה לא נורמלים.
2. Animaטיפול l
- קח את העכבר מהכלוב שלה ופשוט להחזיק אותו במשך 5-10 דקות. להיות רגוע בזמן הטיפול בבעלי החיים, להימנע מביצוע תנועות קופצניות ורעשים.
- לאחר הטיפול, להחזיר את העכבר לכלוב שלה.
- חזור על הליך הטיפול 2-3x עם מרווחים לא שווים בין פרקי טיפול, על מנת להפוך נוח העכבר עם בניסויים.
- קח סמרטוט רך קטן ולעטוף את החיה 2-3x עם מרווחים לא שווים.
- בעלי החיים צריכים להישאר רגועים ולהתרגל להיות עטוף. אם העכבר הוא נרגש ועצבני, לחזור על נהלי טיפול וגלישת.
3. הדרכה בעלי חיים
- התחל הכשרה של בעלי החיים בhomecage הנייד למחרת אחרי ההתרגלות לטיפול וגלישת הושלם.
- הקלט את בעלי החיים של לשקול יומי לפני ובמהלך האימון.
הערה: אם במהלך האימון, החיה מאבדת מעל 10% מהמשקל שלה, היא צריכה להיות מחוץ tהוא ניסויים. - התאם את המיקום האנכי של זרוע קיבוע ראש מכשיר homecage הנייד כדי להתאים את הגודל של החיה המאולפת. חבר את כניסת האוויר של המכשיר לשקע סטנדרטי מעבדה בלחץ אוויר (בדרך כלל, או מיכל דלק או משאבת אוויר המספק לחץ וקצב זרימת האוויר גבוה מספיק, כלומר כ בר 5 ו300 ליטר / דקה).
- לעטוף את החיה בסמרטוט.
- הכנס את מחזיק המתכת, אשר מחובר לראש של החיה, לזרוע קיבוע הראש ובתקיפות לתקן את זה על ידי הידוק הברגים. הפעל את זרימת האוויר ולוודא כי זרימת האוויר היא אופטימלית להנפקה ללא homecage-הרים את האוויר. לשחרר את בעל החיים לתוך homecage הנייד על ידי הסרת הסמרטוט.
- כדי להרגיל את בעל החיים לרעש, מספק חשיפה מתמדת לקולות סביבה (באמצעות, למשל, הרדיו או מוסיקה מוקלטת ודיבור) במהלך כל האימונים, כמו גם במהלך הניסויים.
- During האימון הראשון, לשמור את האור בחדר במשך השעה הראשונה, ולאחר מכן לכבות את האור עד סוף האימון.
- לאחר 2 שעות של אימונים בhomecage הנייד, לשחרר את בעלי החיים מקיבעון הראש ולהחזיר אותו לכלוב שלה עם אספקה של מים ומזון. תשאיר את זה במשך לפחות 2 שעות בתנאי מנוחה.
- נקה את homecage הנייד לאחר כל אימון באמצעות פתרון אתנול 70% ולשטוף אותו במים ברז. משרים-up המים עם מגבת נייר חד פעמית ולייבש את homecage הנייד לפני השימוש הבא.
- בצע אימונים ברציפות במשך שעה 2, עם האור בחדר כבוי ואילו בעלי החיים הוא להיות מאומנים.
- בצע את האימון פעמיים ביום.
- לאחר 8-12 אימונים, השתמשו בבעלי החיים בהפעלה ניסיונית לתקופה של עד 2 שעות בכל פעם.
הערה: במהלך אימונים ממושכים שנמשכים יותר משעה 1-2, לשקול מתן העכבר wה-i מים שתייה, שיכול להיות מועברים באופן ידני או להשתמש במחזיק פיפטה המחובר למסגרת homecage הניידת. לחלופין, מים יכולים להיות מסופקים שימוש כרצונך מודעה של בעלי החיים על ידי הצבת טיפות צמיגות של הידרו ג'ל ישירות על קירות homecage הנייד ל.
הערה: זכור לשקול את בעלי החיים בכל יום לפני האימון כדי לשלול תופעות לחץ כרוניות. תכלול בעלי חיים מהניסוי אם, בכל נקודת זמן, זה מדגים תגובות לחץ כגון הקפאה, ניקוד, או שלשול שנגרם עקב מתח.
4. יישומים
- ההדמיה שני פוטונים בAwake העכבר נעה סביב Homecage הנייד
- להרכיב את homecage הנייד. בדקו את עמדותיו של הגשר וזרוע קיבוע הראש.
- עטוף את בעלי החיים שהוכשרו בסמרטוט. מניחים את החיה בhomecage הניידת. הצמד את מחזיק המתכת בזרוע קיבוע הראש. הסר את הסמרטוט.
- נקה את מכסה הזכוכית המושתלת מפני אבק באמצעותפתרון 70% אתנול ולאפשר לו להתייבש.
- מניחים ירידה של נוזל הטבילה על עטיפת הכיתה. רצוי, להשתמש בפתרון צמיג, משום שמים יתאדו במהירות.
- מניחים את מכשיר homecage הנייד עם החיה מאומנת תחת המיקרוסקופ (אלא אם כן יש לך מכשיר שני, זהה, שהוא נייח בהתקנה מיקרוסקופית).
- לבצע ההדמיה תוך שימוש במערכת הדמיה לייזר מיקרוסקופ סריקה זמינה מסחרי מצוידים בליזר אינפרא אדום פעמו femtosecond בהתאמה אישית, או.
- מצא את האזור של עניין באמצעות המצב הרחב בתחום של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להשתמש במסנני מסירה ארוכים כדי להעריך בכלי דם במוח ובחר אזור יעד מתאים לאחר שבחן את הדפוס של כלי דם.
- לכלי דם בקליפת המוח תמונה, להזריק פתרון 1% מdextran 70,000 MW טקסס האדום מצומדת (או האנלוגי שלה), או לוריד הזנב בעוד החיה היא משותקת בסמרטוט, או רטרו orbitally תוךבעלי החיים ממוקם בhomecage הנייד. כוון את לייזר שני פוטונים ל860 ננומטר ולהשתמש במסנן מעביר להקה (590-650 ננומטר) כדי לאסוף את האור הנפלט. השתמש במסנן הפליטה 515-560 ננומטר כדי להעריך את הפרטים הקטנים של מורפולוגיה עצבית או פעילות עצבית ניצול, למשל, עכברים מהונדסים המבטאים YFP או Ca 2 + - GCaMP3 החלבון פלואורסצנטי הרגישים בsubpopulation של נוירונים תחת אמרגן Thy1.
- השתמש בתוכנה מתאימה לרכישת תמונה.
- לאחר הדמיה, לשחרר את בעלי החיים מזרוע קיבוע ראשו על ידי שחרור הברגים. להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה ולאפשר לו לנוח לפחות 2 שעות לפני תחילת פגישת ההדמיה הבאה.
- אחסן את הקואורדינטות של כל אזור של עניין (ROI) לreimaging שלאחר מכן. תמונה זהה ROIs לאורך זמן, ולהתאים את קואורדינטות בכל פעם על מנת למקסם את החפיפה התמונה.
- לנתח את התמונות ולעשות שחזורים תלת ממדיים באמצעות softw מתאיםהם (למשל, ImageJ, וכו ').
- דימות אופטי פנימי בAwake העכבר נע סביב Homecage הנייד
- להרכיב את homecage הנייד תחת המצלמה רכישת התמונה של התקנת הדמיה אופטית פנימית.
- עטוף את בעלי החיים שהוכשרו בסמרטוט. מניחים את החיה בhomecage הניידת. הצמד את מחזיק המתכת לתוך זרוע קיבוע הראש.
- נקה את מכסה הזכוכית המושתלת מפני אבק באמצעות פתרון אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש.
- מניחים ירידה של גליצרול על הזכוכית המושתלת ולכסות אותו עם להחליק את מכסה עגול 8 מ"מ.
- הנח מניפולטור עם ההפך צינור אוויר המכה בvibrissa הנגדי.
- להתאים את המיקום של המצלמה במהירות גבוהה ולמקד אותה בכלי הדם בקליפת המוח.
- השתמש באור ירוק (מסנן 546BP30) ללא מסנן מצלמה לרכוש את מפת כלי.
- פוקוס עמוק יותר לתוך קליפת המוח, כ 400 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח.
- כדי לא תמונההוא אות רמת חמצון הדם תלויה (BOLD) אופטית, למקם את מסנן 590LP מול המצלמה ומאיר את הקליפה עם אור אדום (מסנן 630BP30).
- התאם את התאורה של פני השטח של קליפת המוח, כך שהוא מחולק באופן שווה דרך האזור של עניין, הימנעות מחשיפת יתר. התאם את עוצמת התאורה, כך שהאזור של עניין נופל בתוך מגזר 70-90% מהטווח הדינאמי של המצלמה.
- השתמש בתוכנת רכישת תמונת LongDaq לאסוף תמונות מהמצלמה.
- השתמש בתדירות רכישת תמונה של 1 עד 10 הרץ (כלומר, בין 1 ו10 פריימים לשניה) לניסויים בגירוי בתדר נמוך (0.05 הרץ).
- כבה את האור בחדר כדי למנוע כל הפרעה לאותות אופטיים הפנימיים.
- אפשר לפחות 30 דקות לעכבר כדי להסתגל לhomecage הנייד.
- תמונת הפעילות הבסיסית במהלך פרק 6 דקות ללא גירוי.
- כדי להקליט ג עוררפעילות ortical, לעורר vibrissa במצב 10 שניות ON/10 שניות OFF (0.05 גירוי הרץ) בתדירות גבוהה (25 הרץ) רכבת של פחזניות אוויר לתקופה הכוללת של 6 דקות.
- לאחר רכישת תמונה, שחרר את העכבר מזרוע קיבוע הראש ולהחזיר אותו לכלוב שלה.
- אין להשתמש בנתוני סינון נוסף לתדירות, כי העוצמות של תגובות גירוי נוטות להיות גבוהה יחסית בחיות ערה, וכתוצאה מכך אות מצוינת יחס רעש.
- להמיר את הסטים של תמונות שהושגו עד *. קבצי ערימת טיף ולנתח אותם עוד יותר באמצעות, למשל, הקוד הפתוח תוכנת פיג'י (ImageJ). הפחת את הפעילות הספונטנית הבסיסית מהמסגרות שהושגו במהלך גירוי vibrissa שימוש באפשרות מחשבון תמונה. לחלופין, נתוני מסנן בתחום התדר באמצעות תוכנה מתאימה.
- הקלטות תיקון מהדק בAwake העכבר נעו סביב Homecage הנייד
- להרכיב את homecage הנייד.
- עטוף את בעלי החיים שהוכשרו בסמרטוט. לנהל trimethoprime (5 מ"ג / קילוגרם) וsulfadoxine (25 מ"ג / קילוגרם) כדי למנוע זיהום חיידקים. מניחים את החיה בhomecage הניידת. הצמד את מחזיק המתכת לתוך זרוע קיבוע הראש.
- נקי ולעקר את "כובע" מושתל השיניים מלט וזכוכית כיסוי באמצעות פתרון אתנול 70% או 0.5% digluconate כלורהקסידין ולאפשר לו להתייבש.
- לאט ובזהירות להסיר את מכסה הזכוכית ממחזיק המתכת.
- רענן החיץ בקליפת המוח בתוספת פניצילין, סטרפטומיצין ולנקות את החלון גולגולתי מפסולת עם טמפון עוצר דמום סטרילי.
- מניחים את האלקטרודה הקרקע למאגר בקליפת המוח.
- הנח את headstage אלקטרופיזיולוגיה בmicromanipulator.
- לפברק טפטפות מהזכוכית בורוסיליקט, מכוון התנגדות קצה החל 6.5 ל8.5MΩ. למלא את פיפטה התיקון עם פתרון תאיים. ההרכב של פתרון פיפטה את התיקון הואהבא (במ"מ): 8 KCl, 111 K-גלוקונאט, 0.5 CaCl 2, 2 NaOH, 10 גלוקוז, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, ו -5 BAPTA, pH הותאם ל7.2 עם KOH. ערכי פוטנציאל הממברנה חייבים להיות מתוקנים לפוטנציאל צומת נוזלים מחושב של -12 mV 33.
- מקד את האזור של עניין באמצעות קואורדינטות stereotaxic, ובמהירות להעביר את האלקטרודה לתוך המוח תוך שמירה על לחץ חיובי חזק על קצה פיפטה. לאחר חדירת מאטר הדורה ומיצוב פיפטה, למדוד את התנגדות הקצה וזורקים את אלקטרודות המראות עלייה בהתנגדות של יותר מ 10-15%, על מנת לשפר את שיעור ההצלחה של הצעדים שלאחר מכן.
- להפחית את הלחץ החיובי בחצי, כדי למנוע נפיחות של רקמת המוח שמסביב. צעדים נוספים דומים לפרוטוקול "תיקון עיוור" הסטנדרטי. למצוא נוירון כדי להקליט מ, להוריד את הקצה לתוך המוח באופן הדרגתי עד לנוירון הוא זוהה בproximit קרובy של קצה פיפטה, כפי שצוין על ידי רצף של זמן אופייני של שינויי עכבת אלקטרודה. המדד המרכזי לנוכחות של נוירון הוא עלייה מונוטונית בהתנגדות האלקטרודה על פני כמה צעדים קדימה ברציפות של פיפטה (בדרך כלל, עליית 20% בהתנגדות פיפטה על פני שלושה שלבים 2-מיקרומטר).
- כדי ליצור קשר עם gigaseal נוירון הממוקד, להחיל לחץ וhyperpolarization שליליים של טפטפת.
- החל דופק קצר של לחץ שלילי גדול יותר לתא על מנת להקים את תצורת כל התא. לחזור בו האלקטרודה על ידי 2-3 מיקרומטר כדי לשמור על חותם טוב.
- פעילות שיא ספונטנית או עוררה בתקופה רצויה של זמן, עד 20-40 דקות.
- לאחר ההקלטה, הסר את פיפטה מהמוח.
- רענן החיץ בקליפת המוח או מקום טיפה של דבק סיליקון על החלון גולגולתי, ולאחר מכן להדביק את coverslip זכוכית עגול בחלק העליון של מחזיק המתכת.
- שחרר את עניםאל מזרוע קיבוע ראשו על ידי שחרור הברגים. להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה לפחות יום אחד לפני ההקלטה הבאה.
- לנתח את הנתונים עם, למשל, תוכנת FitMaster.
- מבחן חוש הריח הרגלה-dishabituation העברה בAwake העכבר סביב Homecage הנייד
- צרף חתיכה נקייה כותנה (2 X 2 סנטימטר) טבל במים ברז לצד הפנימי של הקיר של homecage הנייד באמצעות קלטת דו צדדית. מחלקים את קיר homecage הנייד לארבעה אזורים על ידי הנחת סמני צבע בצד החיצוני של הקיר, כך שפיסת צמר גפן ממוקמת באמצע "אזור היעד". תקן את החיה בזרוע headholder מול ההפך קיר הקטע לאזור "היעד" ולאפשר לו להסתגל לhomecage הנייד למשך 30 דקות.
- קח פיסת הכותנה נקייה אחרת ולהרטיב אותו עם כמה טיפות של התמצית וניל 1%. החלף את הכותנה נקייה על קיר homecage הנייד עם אחד שנשא את vanilריחה. תציג את הריח למשך 5 דקות. לעקוב אחר התנועות של homecage הנייד במהלך תקופת מצגת ריח. להעריך את רמת העניין לריח על ידי מדידת הזמן המצטבר שהחיה מבלה מול האזור "היעד" ביחס לזמן הכולל של תנועת homecage הניידת.
- חזור על הפעלת היישום של 5 דקות שלוש פעמים באמצעות ריח הווניל, עם מרווח בין מושב 5 דקות. השתמש בפיסת צמר גפן "וניל" טרי בכל פגישה.
- להציג את החיה עם ריח מבחינה חברתית משמעותי במהלך הפגישה האחרונה, החמישית. הרטב פיסת צמר גפן נקייה עם כמה טיפות של שתן (שהושגו ביום הקודם מבעלי חיים של המין השני) ולמקם אותו באמצע טווח היעד במשך 5 דקות.
- הכרת ריח רומן בעכבר מרגש ער סביב homecage הנייד
- מחלקים את הקיר לארבעה אזורים על ידי הנחת סמני צבע בצד החיצוני של קיר homecage הנייד. עו"דשתי פיסות כותנה נקיות אח (2 X 2 סנטימטר) טבלו במים ברז לצד הפנימי של הקיר באמצע האזורים מנוגדים זה לזה (כאזור אזור יעד 1 ויעד אזור 2). תקן את החיה בזרוע headholder מול קיר קטע מחוץ לאזורי היעד ולאפשר לו להסתגל לhomecage הנייד למשך 30 דקות.
- החלף את שתי פיסות הכותנה עם אלה טריים:. מקום פיסת צמר גפן רטוב עם התמצית וניל 1% למקד אזור 1 ועוד אחד רטובה במים ברז כדי למקד את האזור 2 להקליט את הווידאו של תנועות homecage הניידת עבור 10 דקות בריח הפעלת מצגת. לחשב את ריח השתתפות כאחוז מהזמן שהחיה מבלה מול אזור היעד 1 ביחס הזמן מצטבר בילה מול אזורי 1 ו -2.
- לאחר מרווח 10 דקות, מקום עוד זוג אפליקטורים על קיר homecage לתקופה דקות שלאחר מכן 10. מניחים את הכותנה "וניל" באזור היעד 1 ומוליך צמר גפן רטוב עם 1% דואר בננהxtract ביעד האזור 2. הפוך הקלטת וידאו של תנועות homecage הניידת. לחשב את ההעדפה לריח רומן כאחוז זמן שהחיה מבלה עם פנים לקיר קטע עם ריח הרומן (יעד אזור 2) ביחס לזמן מצטבר מול אזורי 1 ו -2.
Representative Results
השיטה שהוצגה כאן מיועדת להדמיה מיקרוסקופית או קלטות אלקטרו תא בודד בעכברים ער, אחרת באופן חופשי הנעים והתנהגות קבועה בראש אבל. בעלי החיים יכולים לנוע בשני ממדים באמיתיים (בניגוד לוירטואלי), איכות סביבה מוחשית ומוכרת, בזמן שגולגולתם של בעלי החיים קבועים בחוזקה בזרוע קיבוע הראש. הרגלת העכברים לhomecage הנייד הרים את האוויר מורכב מ4-6 ימים של אימוני 2-HR פעמים ביום (איור 1). החיות מאומנים לאחר מכן ניתן להשתמש בניסויים באופן מיידי. מחקר טיפוסי כולל מספר מפגשי הדמיה או הפעלות הקלטת התיקון-clamp שהם מרווחים במרווחי זמן הנעים בין כמה שעות לכמה ימים או שבועות. חשוב מכך, ניתן לבצע את שני הקלטות אופטיות ואלקטרו בו זמנית עם גירויים וקריאות קוגניטיבי או התנהגותי, תוך ניסוי יחיד.
כדי להעריך את היציבות מכאנית שלקיבוע ראשו של העכבר בhomecage הנייד, רצפי התמונה של כלי קליפת המוח שכותרתו עם dextran ניאון מצומדות ושל דנדריטים בקליפת המוח להביע YFP נאספו תוך חיות הניסוי היו ניווט homecage הנייד (איור 2). התקות מקסימליים של המוח בזמן התנועה של בעלי החיים בדרך כלל לא יעלו על 1-1.5 מיקרומטר. התקות אלה התרחשו בכיוונים אופקיים והביאו לעתים רחוקות מאוד במעבר לגילוי של מטוס ההדמיה, עיבוד מיותר כל תיקון של חפצים בתנועה. קיבוע ראש יציב בhomecage הנייד מאפשר כימות של קוצים הדנדריטים בודדים בבעלי חיים ער עם אותה האמינות כמו בעכברים מורדמים. צפיפות הדנדריטים עמוד השדרה, מורפולוגיה ומחזור יכולים להיות במעקב במהלך מחקרים ארוכי טווח עם הפעלות הדמיה מרובות שבוצעו במרווחי זמן הנעים בין כמה שעות לכמה ימים או שבועות.
השימושיות של מ 'homecage obile עבור דימות אופטי תפקודי נבדק בקליפה החושית של עכברים ער באמצעות שתי גישות: א) שני פוטונים במיקרוסקופ על העכברים הטרנסגניים Thy1-GCaMP3 וii) הדמיה אות אופטי פנימית בwild-type עכברים. Ca 2 + הדמיה בוצעה בשכבה 2/3, המכילה גופי תא של הנוירונים שכותרתו fluorescently רבים, כמו גם הדנדריטים והאקסונים שלהם (איור 3). החלקות של הקרינה בהשוואה לזמן מאזורים נבחרים של עניין (ROIs) מוצגות באיור 3, אשר מדגימות את פעילות ספונטנית עצבית (כפי שנמדדה עליות חולפות בקרינת GCaMP3) במהלך הניווט הפעיל של העכבר בhomecage הנייד. הדמיה אופטית המבוססת על אותות פנימיים מאפשרת מיפוי הפריסה המרחבית של תחומים פונקציונליים. איור 4 ממחיש שינויים כמו גל ברמת חמצון דם (המשקפים הפעלה עצבית אזורית) שמופצים יחד קליפה החושית בתגובה לvגירוי ibrissa בתדירות של 0.05 הרץ.
כדי לבדוק היתכנות של הקלטות תיקון מהדק עם homecage הנייד, השתמשנו עכברי C57BL/6J 2-3 חודשים בן. שכבה 2/3 תאי עצב בקליפה החושית נרשמו בתצורת תא כולו באמצעות מהדק מצב הנוכחי. הקלטת התיקון-clamp במוח של עכברים ער על homecage הסלולרי קבוע בראש היה דומה במהות לעיוורת תיקון-הידוק בפרוסות מוח. כ -50% מניסיונות הסתיימו בהיווצרות gigaseal מוצלחת, מתוכם יותר מ 70% הניבו הקלטת תצורה כל התא יציבה. אין אירועים של אובדן קשר gigaseal בשל עקירה מכאנית של תאים נצפו. איור 5 מדגים שבר 60 שניות של הקלטת נציג 10 דקות ארוכה הנוכחי מהדק מתואם עם פרקים של של העכבר הפעיל (ריצה) ומדינות פסיביות (מנוחה).
src = "/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" width = "600" />
איור 1. שיטת קיבוע הראש של עכברים ער בhomecage הנייד. א) סקירה כללית של העיצוב הרים האוויר הנייד homecage ואיורים של המושג הכללי. B) תרשים של ציר זמן ניסוי טיפוסי. המחקר מתחיל בהשתלה של החלון גולגולתי שבועיים לפני ההרגלה בעכבר כדי טיפול וגלישת, ואחריו שמונה אימונים פעמים ביום. המחקר הטיפוסי כולל מספר מפגשי הדמיה או הפעלות הקלטת מהדק תיקון שהם מרווחים במרווחי זמן הנעים בין כמה שעות לכמה ימים או שבועות. ניתן לעשות זאת בשתי מדידות אופטיות ואלקטרו במקביל עם גירויים קוגניטיביים או התנהגותיים וקריאות בניסוי יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ילדה = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 2. דוגמא להדמיה מיקרוסקופית שני פוטונים על עכברים ער נעו סביב homecage הנייד. ב ') בכלי דם, בקליפת מוח, שכותרתו עם dextran האדום מצומדות 70 kDa טקסס. הקוטר של מגזרי כלי בודדים נמדד על ידי התוויית לאורך זמן הפרופיל של הקווים המצוירים על פני לומן הכלי בתקופות של המנוחה של העכבר והפעלה (). קצב זרימת דם בעורקים וורידים נמדד בקו סריקה לאורך הקווים נמשכים במקביל לקיר הכלי (ב ') פרטים קטנים. C, D) של מורפולוגיה עצבית דמיינו במוח של עכברים הטרנסגניים המבטאות YFP בsubpopulation של נוירונים תחת אמרגן Thy1. שחזור תלת ממדי של תאי עצב פירמידלי בקליפה החושית של העכבר (C). התמונות של ב הדנדריטיםהחווה נרכשה בעכבר ער, מתנהג הן יציבה מספיק לכימות של מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים בודדת) כימות. E של תנועה במוח שנגרמה על ידי תנועות עכבר (ד '). התקות משרעת גדולות יותר לתאם עם תקופות של הריצה של העכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דוגמא לפעילות עצבית אוכלוסייה בערים Thy1-GCaMP3 העכבר נע סביב homecage הנייד. א) תמונת שני פוטונים של שכבת קליפת המוח II / III נוירונים. ROIs, למשל גופי תא, דנדריטים ואקסונים עצביים מוצגות בצהוב. ב ') עקבות ΔF / F של הקרינה GCaMP3 מROIs מוצגת ב( זמן שלהקרינה eries נרשם ב1.5 שניות / מסגרת). C) הוגדל-באזור צילם ב65 msec / מסגרת. ד ') מROIs הצהובה בC זממה לאורך זמן, מראה את העליות חולפות (האדום) בקרינת GCaMP3 שהמתאימה לפעולה 2 + פרקי זרם מושרה פוטנציאל Ca. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. דוגמא למיפוי הפריסה המרחבית של תגובות תפקודיות בקליפת המוח של עכבר ער באמצעות הדמיה האותות אופטיים הפנימיים. א) תצוגה של כלי דם השטחיים שדה בהיר דרך החלון גולגולתי. ב 'מפת מגניטודה) של הפעילות הבסיסית בהו ניידmecage במהלך פרק 6 דקות. C) מפת מגניטודה של פעילות עצבית מתפשט לאורך קליפה החושית בתגובה לגירוי vibrissa בתדר של 0.05 הרץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. דוגמא של הקלטת התיקון-clamp כל התא בקליפת המוח של עכבר ער נע סביב homecage הנייד. א) הקלטה נוכחי מהדק מנוירון בשכבת קליפת המוח עכבר 2/3. שניות 0.5, הזרקת 100 הרשות הפלסטינית נוכחית (מצויינים בהמשך העקבות) גורמת לפרץ של פוטנציאל פעולה. התא הראה אופייני הסתגלות תדירות ספייק לנוירונים פירמידליים. ב ') הקלטה הנוכחית מהדק רציפהמאותו תא העצב בקורלציה עם הפעילות של תנועה העכבר "(שמוצגת בורוד מעל העקבות). פעילות ספונטנית נציג של נוירון שכבה 2/3 בתקופות של מנוחה של העכבר (C) והפעלה (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. אובדן בעלי חיים במשקל ופעילות של תנועה של עכברי head-fixed/non-fixed במהלך אימונים בhomecage הנייד. א) במשקל בבעלי חיים (ממוצע + SD,%) לפני אימונים. שים לב שירידה במשקל היא הפוכה באופן מלא על ידי אימון 7-8 ה. ב ') מסלולו של העכבר אופקי תנועה ביחס לhomecage הנייד,שלהסיק מתנועת המעקב של homecage הנייד במהלך אימון -8 תנועות מעקב. C) של עכבר קבוע שאינו הראש לחקור את הכלוב העגול במהלך אימון 8 ה. ד) משך קבוע בראש (העיגול) ו תנועה שאינה קבוע (משולש) עכברים במהלך 1-4 יום ה אימונים (ממוצע + SD,%). שים לב, ביום 4, עכברים קבוע בראש להציג לא הקפאה (כמו ביום 1) ולא פעילות של תנועה מוגזמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כדי להבין את הפיסיולוגיה של המוח והפתולוגיה טוב יותר, מחקר חייב להתבצע במגוון רחב של רמות מורכבות הכנה, תוך ניצול הטכניקות המתאימות ביותר עבור כל הכנה. כיום, מגוון רחב של מתודולוגיות מדעי המוח (מגוף מלא fMRI למיקרוסקופיה STED תת אברון) מיושם בקלות לבעלי חיים מורדמים, ואילו ניסויים בבעלי חיים ער ומתנהגים ייצגו אתגר מתודולוגיים משמעותי.
כאן, גישה חדשנית מתוארת בי בעלי חיים במעבדה, למרות היותו בחוזקה בראש קבוע, יכולים לנוע homecage הנייד הרים את האוויר ולחקור את סביבתה המוחשית בתנאים ללא מתח. הכנת בעלי החיים מתנהגים קבוע הראש המוצגת כאן מספקת מספר היתרונות חשובים. ראשית, נתונים אלקטרו או הדמיה המתקבלים בשיטה זו הם ללא פשרות לא על ידי הרדמה ולא על ידי לחץ-Induced אילוץ. מיקום של העכבר לביתו הניידכלוב הוא מהיר ואינו דורש הרדמה של בעלי החיים אפילו transiently. שנית, homecage-הרים האוויר מבטיח יציבות מכאנית שצריך כדי לכמת שינויים במורפולוגיה עצבית עדינה ולהקליט פעילות אלקטרו תא בודד בחיות ערה. לבסוף, העיצוב של homecage הנייד קומפקטי יותר בהשוואה להליכון הכדורי, ובכך מאפשר מיצוב homecage הנייד תחת מיקרוסקופ הזקוף סטנדרטי עבור הדמיה שני פוטונים או הקלטת התיקון-clamp במוחו של העכבר ער.
קיבוע ראש המשרד בhomecage הנייד דורש השתלה של בעל מתכת ארבע כנפיים שתוכנן במיוחד, עם פתח עגול במרכז לגישה אופטית או חשמלית לאזור במוח המשמש כבסיס. מחזיקי מתכת אלה מחוברים לגולגולת באמצעות שילוב של דבק, מלט שיניים וברגים קטנים מוברגים לתוך עצם הגולגולת. הליך כירורגים זה פותח על בסיס מספר גדול של העברפורסם נהלים, ונמצא לגרום לחלון הכנת גולגולת יציבה ושחזור. לin vivo ניסויי אלקטרו, חלון בצורת ירח 34, פתיחת גולגולת קטנה בגודל (פחות מ 0.5 מ"מ) 32, והכנה מכוסה זכוכית קדחה 35 כבר נוצל. הנה, החלון גולגולתי "ההפוך" היה מושתל עם או (בקוטר 3.5 מ"מ) גדול או פתיחת גולגולת קטנה (פחות מ 0.5 מ"מ קוטר). צמצום תנועה במוח הוא קריטי להקלטות תא בודדות יציבים, ולכן מומלץ לבצע craniotomies גודל הקטן לניסויי אלקטרו. לאחר ההשתלה של החלון גולגולתי לניסויי הדמיה אופטית, בעלי החיים מותר לשחזר לפחות 2 או 3 שבועות, ובתקופה זו החלון הראשון transiently מאבד את שקיפותה ולאחר מכן חוזר בו (עם תשואת 50-70%, בהתאם הרקע הגנטי של זן העכבר). שקיפות של החלון וstabil הגולגולתity של "הכובע" של הדבק דנטלי המחובר לגולגולת ניתן לאמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל משקפת ובדיקה גופנית בזמן טיפול בבעלי חיים. בסוף תקופת ההחלמה 2-3 בשבוע, אותם בעלי חיים שמפגינים כל סימנים של דלקת שלאחר תפעולית שייר או ליקויים מכאניים במלט השיניים צריכים להיות מחוץ הניסויים והופסקו.
הגיל האופטימלי להתחלת אימוני העכברים הוא 2-4 חודשים (המקביל למשקל הגוף של 20-40 גר '). בבעלי חיים צעירים, עיגון של "הכובע" מלט שיניים לגולגולת יכול להיות לא אמין, שעלול להפחית את עמידותו מפני הלחץ המכני שהוטל על ידי תנועה של העכבר קבוע בראש בhomecage הנייד. למרות שעכברי זכרים ונקבה מופיעים מוכנים באותה מידה כדי לנווט בhomecage הנייד, יש נטייה כדי להשיג אחוז טוב יותר של חלונות גולגולת שהשיב את השקיפות שלהם בנקבות עכברים (מידע לא מוצג). לפיכך, לא על מנתo להבטיח תמהיל מאוזן של מינים בקבוצה של בעלי חיים שנבחרו עבור הדמיה, השתלת חלונות גולגולת בכ 30% עכברי זכרים יותר מומלץ. אינטראקציות חברתיות ידועות כדי לשפר את רווחתם של בעלי החיים ולהפחית את הלחץ, ולכן רצוי כי להמלטה הם פעלו והתאמנה במקביל והמשיכה יחד בכלובי קבוצת דיור.
בניגוד לנהלים שפורסמו להכנת הליכון הכדורית 13, שיטת ניצול homecage הנייד אינה דורשת הרדמת העכבר ברגע קיבוע הראש. הבדל זה הוא חשוב משום שהוא מאפשר כדי לשלול כל השפעה שיורית כי גם קצר ופרק הרדמה "אור" סביר להניח שתהיינה במדידות הפיזיולוגיות המתקבלות לאחר זמן קצר. ואכן, למרות שבמחקרים שבם קיבוע הראש נעשה בהרדמה והניסויים בפועל שהחלו לאחר תקופת המתנה קצרה 13, לא אחד יכוללכלול השפעות ארוכות טווח אפשריות של פרק הרדמה הקצר על נתונים הניסיוניים. מחקרים אחרים יש לסמוך על חסך מים להתרגלות שיטתית של בעלי החיים בראש הקיבעון ומשמשים גמול מים כאמצעי להנעת החיה להישאר נייח 36. עם זאת, שיטת קיבוע הראש מבוסס התגמול מגבילה את הבחירה של מבחנים התנהגותיים רלוונטיים, חשוב, תופסת אחת מעמותות תמריצים לתגמול המבוססות היטב. לעומת זאת, בשיטה של התרגלות עכבר לראש הקיבעון בhomecage הנייד אינה דורשת חסך מים וגמול שלאחר מכן.
השלמת homecage הסלולרי עם מערכת אספקת מים מומלץ לניסויים ארוכים טווח. אימונים וניסויים בבעלי חיים המוצגים כאן נעשו בשעתי יום (08:00-18:00), אשר תואם את התקופה מבחינה פיזיולוגית הפסיבית עבור אלה עכברים שנשמרים תחת סטנדרטי לוח הזמנים אור 12-HR (lights בשעת 6 בבוקר ואת בשעה 6 בערב). מאז צריכת המים קשורה באופן ישיר לפעילותו של העכבר, בעכברי תקופה פסיביים אינו דורש אספקת מים אם משך אימון / הדמיה / הקלטה אינו עולה על 2 שעות. בנוסף לעיתוי ומשך האימונים, צריך להתייחס לנושא של המספר האופטימלי של הפעלות הנדרשות להרגלת בעלי החיים לhomecage הנייד. לשם כך, שני קריטריונים המשמשים להערכת מתח המושרה על ידי נהלי ראש קיבוע: i) ירידה במשקל, וii) ברמת הפעילות של תנועה. כפי שניתן לראות באיור 6, ירידה במשקל מגיעה לרמה הממוצעת של 6% ביום אימונים 2, ומתהפכת לגמרי ביום אימונים 4 (איור 6 א). באופן עקבי עם הדינמיקה לשקול, רמת הפעילות של תנועה של בעלי חיים קבוע בראש הוא דיכא ביום הראשון של אימונים, אבל מתייצבת ביום אימונים 4 (איור 6 ד '). בהתבסס על המדידות הללו, אנו suggesלא כי המשך המינימלי של תקופת אימוני עכבר על homecage הנייד הוא 4 ימים, כפי שתואר בפרוטוקול בזאת.
שימוש ב, homecage הנייד השטוח מרוצף-הרים האוויר מאפשר הוספת משימות מורכבות (הסנסורית, תפישתית, וקוגניטיבית) לפרדיגמות אימון לעכברים שקבועים בראש. במחקר הנוכחי שני פרוטוקולים של בדיקות התנהגותיות מוצגים. שני פרוטוקולים לנצל רמזי ריח ויכולים להיות משולבים עם הדמיה / הקלטות אורך בקליפת מוח העכבר. למרות homecage הנייד מיוצר מחומרים בלתי סופגים, אחד עדיין צריכה לקחת בחשבון הפרעות אפשריות בין הריח של המכשיר וריח מבחן (ים). גורם נוסף שעלולים להפריע לרמזים חזותיים / מישוש של ניסוי התנהגותי הוא הצומת בין הקיר ולהוסיף, שאינו חלק ועשויים, אפוא, להיתפס על ידי בעלי החיים כנקודת ציון. זה שווה לשים לב כאן כי, על מנת למזער את המצוקה של בעלי החיים במהלך Inte כזהrventions כמיקום של כותנה הצגת ריח לקיר homecage הנייד, בניסויים צריכים להתאמן כדי לבצע התערבויות כאלה מהר ככל האפשר ולהימנע מטיפול ממושך בכלוב פחמן. אסטרטגיות אלטרנטיביים למצגת ריח / אובייקט רומן הן על הדעת, למשל, הצבת פתרון מבוסס הידרוג'ל טיפות או אובייקטים (כגון שבבי מזון) על גבי מדפים קטנים המחוברת למשטח הפנימי של קיר כלוב פחמן בשיא בקנה אחד עם מיצוב הראש של החיה.
homecage הנייד מאפשר לבעלי חיים קבוע בראש כדי לבצע מגוון רחב של תנועות דו ממדים הכוללים תנועה אופקית, situp, טיפוח, טאטאתי, מלקק, האף לחטט, תנועות כף קדמיות מיומנת, וקיר נוגע ללב עם forelimbs, כפי שמודגם במחקר הנוכחי . שימוש homecage נייד והפרוטוקולים שהוצגו כאן, חוקרים יכולים ללמוד את המערכת העצבית הסנסורית עם רמה גבוהה של שליטה על שניהם את מצב הגירויים וקריאת פסקי התנהגותיות. יתר על כן, מחקרים של יכולות קוגניטיביות בעכברים ער יכולים להתבצע באוויר, ניווט במרחב ובמשימות קבלת החלטות.
ישנן מספר מגבלות מעשיות של שיטה זו. ראשית, יש צורך בכמות משמעותית של אוויר בלחץ כדי להשיג את כוח הרמת homecage ולבצע ניסויים ארוכים טווח. שנית, homecage הנייד ביישום הנוכחי שלה הוא רק 18 סנטימטר קוטר, ולכן מספק מרחב קטן יחסית ופשוט בהשוואה למציאות וירטואלית, שבו סביבה ניסיונית מורכבת יכולה להיות מתוכננת ללא כל מגבלות במרחב. שלישית, במהלך גירוי זיף וניסויים מבוססי תגמול שהוצגו כאן, מכשיר היה בשימוש שמגביל את האפשרות קיר המגע לעכבר. תוספת של ערוץ חיצוני חזותי או גירוי חושי (כגון מקרן אור מכוון העין) תדרוש עיצוב מכשיר יותר ארגונומי וקומפקטי בהשוואה להפתרונות מרובה מסך או כיפת הקרנה שהיה בשימוש בניסויים הליכון הכדורי.
לסיכום, השימוש בעכברים שהקבוע בראש נעו בhomecage הנייד הרים את האוויר מאוד מקל על המחקרים המשלבים רמות תאיות, מולקולריות והתנהגותיות של התבוננות ומניפולציה בניסוי יחיד. יישומים ספציפיים המאוירים כאן כוללים שני פוטונים הדמיה מיקרוסקופית, הדמיה אות אופטי פנימית והקלטות התיקון-clamp בעכברים שאינן מתנהג בהרדמה. צפוי כי גישה זו תפתח אופקים חדשים בניסויים בעכבר ער, מתנהג ולשמש ככלי שימושי עבור שניהם פיתוח תרופות ומחקר בסיסי של תפקוד המוח.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לפרופ 'Eero Castren להערות המועילות שלו על כתב היד. העבודה נתמכת על ידי מענקים מהאקדמיה של פינלנד, המרכז לניידות בינלאומית של פינלנד, ובית הספר פיני בוגר מדעי המוח (מוח ואת נפש תכנית דוקטורט).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
