Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

Published: September 16, 2014 doi: 10.3791/51873
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

التقنيات التقليدية لتصنيع بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي تحتوي على تحقيقات الفلورسنت تتضمن يقحم هلام بين سطح ملتصقة وشريحة زجاجية. هنا، وتبين لنا أن هذه الشريحة مع طلاء بولي-D-يسين (PDL) وتحقيقات الفلورسنت يموضع تحقيقات في حدود 1.6 ميكرون من سطح هلام.

Abstract

ولطالما استخدمت المواد الهلامية السلطة الفلسطينية كمنصة لدراسة قوات الجر الخلية بسبب سهولة تصنيع والقدرة على ضبط خصائصها المرنة. عند الركيزة المغلفة مع بروتين المصفوفة خارج الخلية، وخلايا تلتزم جل وتنطبق القوات، مما تسبب في هلام لتشويه. تشوه يعتمد على الجر الخلية وخصائص المرونة من هلام. إذا كان من المعروف مجال تشوه السطح، سطح الجر يمكن حسابها باستخدام نظرية مرونة. يتم قياس هلام تشوه عادة عن طريق دمج الخرز علامة فلوري بشكل موحد في هلام. تحقيقات تهجير ويشوه هلام. يتم تعقب تحقيقات بالقرب من سطح هلام. تعتبر النزوح التي أبلغ عنها هذه التحقيقات والتشريد السطح. يتم تجاهل أعماقها من السطح. يقدم هذا الافتراض خطأ في التقييمات قوة الجر. لقياس الدقيق للقوات خلية، من المهم جدا للموقع من الخرز ليكون معروفا. طورناوهي تقنية تستخدم الكيمياء بسيط لحصر الخرز علامة فلوري، 0.1 و 1 ميكرون في القطر، والمواد الهلامية في السلطة الفلسطينية، ضمن 1.6 ميكرون من السطح. نحن معطف ساترة مع بولي-D-يسين (PDL) والخرز الفلورسنت. ثم محصورة بين السلطة الفلسطينية حل هلام ساترة وسطح ملتصقة. نقل حبات الفلورسنت إلى حل خلال هلام علاج. بعد البلمرة، PA هلام يحتوي على حبات الفلورسنت على مقربة الطائرة إلى سطح هلام.

Introduction

وعادة يتم دراستها التفاعل الميكانيكي للخلية الحية مع البيئة المحلية في استخدام المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. هذه تعتمد على ركائز بسيط، بروتوكول جيدا اتسم أنشأها ديمبو وانغ في عام 1997 1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه ركائز هو أن صلابة بهم يمكن ضبطها عن طريق تعديل تركيزات مكونات محددة من الحل هلام. وهذا يوفر منصة مرغوبة لدراسة تفاعل الخلايا مع بيئات مختلفة من الجمود. عندما المواد الهلامية المغلفة السلطة الفلسطينية مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات، والخلايا التمسك بها، وتوليد القوة. نتيجة لقوة الخلية، وهلام يشوه كهيئة مرن. هذا التشوه يعتمد على مقدار القوة التي تطبقها الخلايا وخصائص المرونة من هلام. وقد استخدمت العديد من الدراسات والمواد الهلامية السلطة الفلسطينية للتحقيق في قوات الجر الخلوية.

الاختلاف في واحدة من السلطة الفلسطينية هلام تلفيق، هي جزء لا يتجزأ المجهرية الفلورسنت (الخرز) رالاحجار الكريمه هلام لقياس قوات الجر خلية في المواد الهلامية من الجمود مختلفة 2. بناء على طلب قوة الخلية، وحبات تهجير من موقع الأولي في أعقاب هلام تشوه. يتم قياس مجال تشوه من التشريد حبة الفردية. ويستخدم هذا المجال تشوه مع نظرية المرونة وخصائص المرونة من هلام لحساب القوات الجر. توفر هذه القياسات فكرة عن كيفية الخلايا ميكانيكيا الشعور والتفاعل مع المكروية المحلية 3.

في العديد من بروتوكولات السلطة الفلسطينية هلام تلفيق المستخدمة على نطاق واسع، واختلطت حبات في جميع أنحاء هلام السلطة الفلسطينية في السائل، وحالته unpolymerized. جل بلمرة تماما PA يحتوي على حبات الفلورسنت طوال حجمه. عند حساب قوى الجر الخلية، ويتم مراقبة الخرز الأكثر بالقرب من سطح هلام (واجهة الخلية الركيزة). ويفترض أن النزوح من هذه الخرز تحدث على سطح خلية للثقافة البساطة في calculatio القوةن. وتجاهل الموقع الفعلي من الخرز داخل عمق هلام. ومع ذلك، في وسيلة مرنة (مثل هلام PA)، حبة أقرب إلى نقطة تطبيق القوة ستتحرك أكثر من حبة وهذا هو أبعد من هذه النقطة. وبالتالي، علاج تشريد نقطة (في الموقع حبة) البعيدة من السطح كما انه في نتائج السطحية في التقليل من tractions الخلوية. درجة الخطأ تعتمد على المسافة من حبة من السطح. لا يمكن تقدير الخطأ من دون معرفة مكان وجود حبة.

لقد تم تناول الحاجة إلى طريقة بسيطة لحصر الخرز جدا بالقرب من سطح خلية ثقافة ببضعة التقنيات. طريقة واحدة هي زيادة كثافة الخرز طوال هلام كله مثل أن هناك عددا كافيا من الخرز في الطائرة التنسيق العليا لقياس الحركة قريبة جدا من السطح. أسلوب آخر ينطوي على بناء غرفة التصوير مبائر للتصوير الخلايا الحية بحيث الضوء منفقط حبات في الطائرة العلوي الأكثر الوصل يتم جمع 4. يتضمن طريقة مختلفة تتراكب طبقة رقيقة جدا من هلام السلطة الفلسطينية تحتوي على الخرز على رأس هلام بلمرة بالفعل دون الخرز 5. والعيب كل من هذه التقنيات هو أن الموقع الدقيق من الخرز داخل هلام غير معروف. هذا الخطأ يدخل في حساب مجال النزوح من الخرز، وبالتالي حساب القوات الخلية. أسلوب آخر ينطوي على الاقتران من الخرز إلى السطح العلوي من هلام السلطة الفلسطينية بلمرة بالفعل باستخدام سلفو-SANPAH 6. هذا الأسلوب يضمن الخرز هي في الواقع إلا على الجزء العلوي من هلام السلطة الفلسطينية، ولكن إلى أي مدى هي جزء لا يتجزأ في عمق هلام غير معروف. هذا يحتمل أن إنشاء الطبوغرافيا المحلية للخلايا، والتي يمكن أن تغير سلوك الخلية، كما اقترح العمل قبل أن الخلايا يمكن الشعور بالقوة عدة ميكرون بعيدا 7. مؤخرا، وهي تقنية لالزخرفة المواد الهلامية السلطة الفلسطينية مع 1 ميكرون القطر وتأسست luorescent فبرونيكتين نقطة علامات في مجموعة وقننت 8. في هذه الحالة، وعمق من علامات الفلورسنت هو معروف، وأساسا الصفر، كما تتم طباعة نمط فبرونيكتين غير مباشرة على سطح هلام. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا توفر بيئة مستمرة على الخلايا التي يمكن أن نعلق، والبروتين ECM يقتصر على 1 ميكرومتر النقاط القطر. لم يتم بعد تأسيس طريقة لدمج الخرز بالكامل تعقب المواد الهلامية داخل السلطة الفلسطينية وقصر بعضها إلى موقع معروف جدا بالقرب من السطح.

هنا، ونحن نطور تقنية لتقييد ميكرون الفرعي إلى قطرها ميكرون الخرز الفلورسنت إلى المستوى البؤري جدا بالقرب من سطح الثقافة خلية داخل هلام السلطة الفلسطينية. عادة يتم الشفاء جل بواسطة يقحم unpolymerized حل هلام السائل بين لوحين من الزجاج. واحدة من لوحات وبين functionalized بحيث هلام تتمسك بشدة لذلك. والآخر هو unfunctionalized وتتم إزالة بعد علاج هلام. نقوم بتعديل هذا الزجاج قابل للإزالة سوrface بواسطة طلاء بطبقة من الخرز. على يقحم الجل السائل بين بين functionalized وحبة المغلفة سطح الزجاج، ونقل الخرز إلى هلام في حين أنه هو علاج. وهذا يحد من مسافة التكامل الخرز "في هلام في 1.6 ميكرون من السطح. تستخدم الأطباق الزجاجية القاع بيتري على سطح ملتصقة الذي يتم علاجه هلام. لتشكيل السطح العلوي هلام شقة خلال البلمرة، يتم استخدام غطاء زجاجي دائري زلة لشطيرة هلام مع طبق بتري الزجاج السفلي. قبل تلفيق هلام، وهي مغلفة زجاج الغطاء العلوي زلة مع بولي-D-يسين (PDL)، مما أسفر عن تهمة سطح إيجابي. نفخ في PDL قبالة مع الهواء المضغوط، ويترسب حل من الخرز في الماء على زلات الغطاء. نحن نستخدم بلي الفلورسنت carboxylated، التي تحمل شحنة سالبة، والتفاعل مع سطح موجبة الشحنة التي أنشأتها العلاج مع PDL. بعد تهب الحل حبة قبالة ساترة مع الهواء المضغوط، وطبقة واحدة منحبات تبقى مقرونة كهربية لتغطية زلة الجاف. طلاء PDL لا يؤثر على الإلتصاق من الزجاج على سطح هلام، والشرائح الزجاجية غير تالفة وإزالتها من هلام PA سليمة تماما.

مصنوعة من الزجاج أطباق بتري السفلي ملتصقة عن طريق العلاج مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysliane و 0.5٪ غلوتارالدهيد. يتم إنشاء المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من الجمود المطلوب عن طريق خلط تركيزات مناسبة من bisacrylamide والأكريلاميد عن طريق الإجراء القياسي 9. وpipetted قطرات من الحل الهلام على طبق بتري الزجاج السفلي. يتم استخدام زلة غطاء زجاجي يحتوي على حبات لشطيرة الجل مع طبق بيتري. عندما يتم الشفاء هلام، يتم إزالة الغطاء العلوي زلة تاركا جزءا لا يتجزأ من الخرز في هلام داخل السلطة الفلسطينية 1.6 ميكرون من السطح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

افتعال وfunctionalizing المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من التصلب مع المجهرية الفلورسنت المدمجة بالقرب من سطح خلية ثقافة مختلفة.

1. Functionalizing غطاء زجاج الأعلى الزلات

  1. نظيفة زلات غطاء زجاجي (# 1.0، بقطر 12 ملم.) بالصابون والماء، تليها الإيثانول لإزالة الغبار دخيلة.
  2. مكان غطاء زجاجي ينزلق على سطح المبشور (أي حامل ماصة تلميح) بحيث أنها لا لمس لتسهيل سهولة التفاعل مع لل coverslips.
  3. معطف كامل سطح غطاء ينزلق مع بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة (الشكل 1A).
  4. خلال هذا الوقت، إجراء 1: 10،000 التخفيف من الحل الغروانية من 0.1 ميكرون القطر، والمجهرية الفلورسنت الحمراء مع منزوع الأيونات (DI) المياه للحصول على كثافة الجسيمات من حوالي 1 المكروية في 20 ميكرون 2 على سطح هلام. انظر الشكل رقم (2) لنتائج مختلف التخفيفات. هذا dilutioيمكن تعديل ن لتلبية الحاجة من تجارب محددة.
  5. وضع محلول مخفف في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
  6. بعد 1 ساعة، استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة زلات غطاء الجافة على سطح المبشور.
  7. إزالة حل الغروي المخفف من حمام بالموجات فوق الصوتية وماصة 150 ميكرولتر على كل زلة غطاء. يترك لمدة 10 دقيقة (الشكل 1B).
  8. استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة غطاء الجاف ينزلق إلى السطح المبشور وتخزينها في الظلام حتى جاهزة للاستخدام.

2. إعداد السلطة الفلسطينية جل مباشرة على الزجاج أطباق بتري القاع

  1. موقد سخن الى 100 درجة مئوية.
  2. وضع من العدد المرغوب فيه من أسفل الزجاج أطباق بتري (35 ملم 14 ملم مع طبق الصغيرة جيدا، # 1.0) على سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. تغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري الصغيرة بشكل جيد مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysليان (3 APTES) لمدة 7 دقائق لتنشيط الكيميائي. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من APTES-3 إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البوليسترين.
  4. بعد 7 دقائق، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات.
  5. كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف.
  6. إزالة أطباق بتري من طبق ساخن والعودة إلى سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي.
  7. في غطاء الدخان الكيميائية، وجعل حل من 0.5٪ غلوتارالدهيد وتغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري جيدا مع الحل لمدة 30 دقيقة. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من غلوتارالدهيد إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البلاستيك.
  8. بعد 30 دقيقة، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات لشطف وإزالة glutaraldehyde.
  9. كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف.
  10. قبل خلط مكونات الحل هلام السلطة الفلسطينية، نقل الشرائح الزجاجية بين functionalized في غطاء الدخان الكيميائية بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة، مما يسمح للالحصر سريعة من هلام مع أسفل الزجاج أطباق بتري بعد خلط الحل هلام.
  11. في 15 مل أنبوب الطرد المركزي، خلط 40٪ bisacrylamide، 2٪ الأكريلاميد، وحمض الاكريليك على التوالي فورية في تركيزات المدرجة في الجدول 1 (مقتبس من البروتوكول نشرت 10) لتحقيق مرونة مصفوفة المطلوب.
  12. إضافة 100 ملي HEPES، بيرسلفات الأمونيوم 10٪، وTEMED بكميات المدرجة في الجدول 1 الموافق المطلوب مرونة مصفوفة لاستكمال حل هلام.
  13. ماصة على الفور 15 ميكرولتر من الحل الهلام على مركز للجزء الزجاجمن أطباق بتري.
  14. اختيار فورا حتى بين functionalized الزجاج غطاء زلة مع ملاقط.
    1. الوجه زلة غطاء زجاجي على مثل حبات الفلورسنت التي هي على اتصال صنع جنب مع حل هلام.
    2. وضع انزلاق الغطاء بلطف على أعلى من هلام السلطة الفلسطينية الآن السائلة مثل أن الجانب بين functionalized في اتصال مع هلام (الشكل 1C). ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ينصح الشخص الثاني لدور مضيفا انزلاق الغطاء من أجل تجنب إمكانية البلمرة الجزئية pipetting لحين حل السائل هلام السلطة الفلسطينية على أطباق بتري متعددة.
  15. الوجه كل أطباق بتري على للمساعدة في تجنب آثار الجاذبية على جزيئات الفلورسنت البلمرة إلى مستويات أدنى من هلام السلطة الفلسطينية.
  16. الانتظار لمدة 35 دقيقة على الأقل، أو حتى بلمرة المحلول من هلام السلطة الفلسطينية بشكل واضح في أنبوب الطرد المركزي لها.
  17. الوجه أطباق بتري إلى أكثر من وملئها PBS للمساعدة في إزالة انزلاق الغطاء.
  18. جعل بعناية اتصال مع جزء من الزجاج طبق بيتري والخطوط العريضة للانزلاق الغطاء، وذلك باستخدام ملاقط لتتخلص من محيط من انزلاق الغطاء. أداء عدة دورات حتى يتم فكها انزلاق الغطاء. إزالة الغطاء زلة والتصرف في حاوية النفايات الحادة المناسبة.
  19. بعد إزالة الغطاء عن زلات، سيكون قد نقل حبات الفلورسنت إلى هلام (الشكل 1D). تغطية المواد الهلامية السلطة الفلسطينية تماما مع برنامج تلفزيوني، ضع غطاء طبق بتري على كل طبق، وتخزينها في 4 درجة مئوية.

3. Functionalizing هلام السلطة الفلسطينية مع فيبرونكتين]

  1. إعداد الحلول خلط التالية كما هو موضح في بروتوكول إنشاء 11: نقع حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5٪ (V / V) الجلسرين) و2X عازلة الاقتران (0.2 M 2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، 10 ٪ (ت / ت) الجلسرين، ودرجة الحموضة 4.5).
  2. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة كافة PBS من الأطباق الزجاجية القاع التي تحتوي على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية.
  3. الماصةنقع الشركة المصرية للاتصالات على حل كل هلام مثل أن الجل هي غارقة تماما. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  4. دافئ 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN -hydroxysulfosuccinimide (NHS) إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. مزيج 10X حلول EDC (150 ملم، 19 ملغ / مل في الماء DI) وNHS (250 مم، 29 ملغ / مل في الماء DI).
  6. مزيج 1 جزء 10X EDC، 1 جزء 10X NHS، 3 أجزاء من الماء DI، و 5 أجزاء 2X عازلة الاقتران.
  7. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة الحل نقع. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام.
  8. إضافة ما يكفي من الحل NHS / EDC لتغطية سطح هلام وملء البئر من الزجاج السفلي من طبق بتري (150-250 ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  9. فبرونيكتين ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، ومزيج الماء المعقم DI إلى إنشاء 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين.
  10. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة SOLU NHS / EDCنشوئها. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام.
  11. إضافة 150 ميكرولتر من الحل فبرونيكتين على كل هلام. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة للسماح لمرفق من فبرونيكتين.
  12. بعد 35 دقيقة، إضافة PBS إلى كل طبق بتري وتخزينها في 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع.

4. تجارب قوة الجر

  1. خلية الإعلام الدافئة، PBS، والتربسين إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. شطف المواد الهلامية 5X مع برنامج تلفزيوني العقيمة، الشفط في برنامج تلفزيوني بين يشطف، وتترك مغطاة في غطاء محرك السيارة.
  3. إضافة 1 مل التربسين لكل 25 سم 2 إلى الخلايا التي تحتوي على قارورة. بعد أن يتم رفع الخلايا من القارورة، يخفف من التربسين مع وسائل الإعلام خلية وعدد الخلايا. بناء على مساحة هلام، وتحديد عدد الخلايا المطلوبة لكل هلام النهائية لكثافة البذر خلية من 3،000 خلية / سم 2. تمييع أو التركيز تعليق مثل أن 150 ميكرولتر من الخليط خلية الإعلام ويتضمن هذا العدد من الخلايا. قسامة 150 ميكرولتر من الخلايا suspensأيون إلى كل هلام.
  4. وضع أطباق بتري تحتوي على خلايا في حاضنة لمدة 30 دقيقة. ثم، وإزالة بعناية أطباق بتري وملء ما تبقى من طبق بيتري مع وسائل الإعلام (حوالي 2 مل) بحيث سطح الطبق هي غارقة تماما.
  5. وضع أطباق بتري مرة أخرى في الحاضنة حتى الحصول على الصور.
  6. إعداد المجهر ونظام الحصول على البيانات للتصوير: إدراج الهدف الغمر 40X المياه، إدراج التباين التدخل التفاضلية (DIC) المنشور، اختر mCherry أو مرشح الفلورسنت يعادل، وتشغيل غرفة البيئية.
  7. عندما أعدت للتصوير، وإزالة واحدة طبق بيتري من الحاضنة ووضعه برفق على المسرح المجهر. إزالة غطاء طبق بتري لمدينة دبي للإنترنت التصوير.
  8. حدد خلية واحدة والتقاط صورة ثابتة واحدة من الخلية في مدينة دبي للإنترنت.
  9. دون تحريك المسرح المجهر، تشغيل وضع التصوير لمضان. التركيز على المجهرية الفلورسنت وتفصيلأورد صورة من المجهرية.
  10. إزالة بعناية وسائل الإعلام خلية من طبق بيتري مع ماصة وإضافة 0.05٪ التربسين-EDTA.
  11. صورة وفصل المجهرية تحت الخلية بعد الخلايا.
  12. استخدام الجسيمات الصور velocimetry (التعريف الشخصية) تحليل في ImageJ 12 لحساب مجال النزوح بسبب القوات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم التصوير متحد البؤر لتحديد أن كانت حبات الواقع تحت سطح هلام وتحديد موقعها بالضبط داخل عمق هلام. وسمح الخرز الفلورسنت من طول موجة مختلفة عن تلك داخل هلام ليستقر على السطح، وحساب المسافة بين جزيئات الفلورسنت المدمجة وتلك التي على السطح باستخدام خوارزمية تحديد النقطه الوسطى. موقع حبة على سطح هلام بمثابة مرجعية للسطح العلوي من تنطبق خلايا تفرض عليها الالتزام سطح حيث هلام. ويرد التخطيطي من السيناريوهين يعتبر (حبات خضراء في هلام مع الخرز الأحمر على السطح، والعكس بالعكس) في الشكل 3. الخوارزمية interpolates ض أوج موقع النقطه الوسطى ثلاثي الأبعاد. كررنا هذه العملية لمدة ثلاثة صلابة المواد الهلامية (1، 10، و 40 كيلو باسكال) واثنين من حجم (قطر) الخرز الفلورسنت (0.1 ميكرومتر 1 ميكرومتر الأحمر والأصفر والأخضر). المسافةبين حبة داخل هلام وأقرب جار له من الطول الموجي مختلفة تم تحديدها استنادا إلى النقطه الوسطى لها ثلاثية الأبعاد. الشكل 4 يبين التوزيع المكاني من الخرز (على السطح العلوي وجزءا لا يتجزأ) والنظرة المتوقعة على الطائرة YZ. يوفر هذا الأخير أعماق كل حبات من سطح هلام.

متوسط ​​عمق 0.1 ميكرون الخرز هو 619 نانومتر و 467 نانومتر، 278 نانومتر عن المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من صلابة 1، 10، و 40 كيلو باسكال، على التوالي (الشكل 5A). أعماق المقابلة ل1 ميكرومتر الخرز قطر هي -20 نانومتر المواد الهلامية في 40 كيلو باسكال، 12 نانومتر في المواد الهلامية 10 كيلو باسكال، و1،255 نانومتر في 1 كيلو باسكال المواد الهلامية (الشكل 5B). تم إجراء التصوير متحد البؤر أيضا على المواد الهلامية مع حبات متناثرة في جميع أنحاء هلام كما كان يستخدم تقليديا لالهلام السلطة الفلسطينية المعدة للدراسات المجهري قوة الجر. تم قياس عمق حبات متناثرة في جميع أنحاء هلام السلطة الفلسطينية باستخدام نفس الخوارزمية التي سبق وصفها، وبالمقارنة مع دepths باستخدام تقنية نقدم هنا. الشكل 6 يوضح تباين حبة التشتت داخل عمق هلام السلطة الفلسطينية باستخدام أساليب التصنيع التقليدية.

الخلايا الليفية نعلق على سطح هلام السلطة الفلسطينية عندما بين functionalized مع فبرونيكتين. وترد مجال النزوح للخلية الليفية والمقابلة الخرز الفلورسنت طبقة في الشكل 7. الخرز بالقرب من محيط الصورة تظهر قليلا من التركيز. هذا ليس عيبا الميكانيكي على جزء من هلام، ويبقى الزجاج سليمة بالكامل عند إزالة من هلام. وإنما هو نتيجة لتأثير بصري بسبب الهدف غمر المياه المستخدمة في هذه التجربة. على إضافة التربسين إلى المتوسطة، يتم تحرير الخلايا من السطح، مما أدى إلى عودة السلطة الفلسطينية مشوه سطح هلام إلى حالته الأصلية. تم استخدام خوارزمية عبر الارتباط لحساب الحقل تشوه استنادا نزوح 10 حبة. وتوضح خريطة التشرد الاستقطاب السائد للقوات الجر خلية في ص الاتجاه.

الشكل 1
الرقم 1. توضيحات من عملية functionalization لكبار غطاء زجاجي ينزلق مع PDL والخرز الفلورسنت. يتم تحضين زلات (A) غطاء زجاج (الأزرق) مع 0.1 ملغ / مل PDL (البرتقال) لمدة 1 ساعة. يستخدم الهواء المضغوط لتفجير غطاء ينزلق الجاف وإزالة PDL. يتم تحضين قسائم (B) غطاء الزجاج بمحلول مكون من 100 نانومتر قطر الخرز الفلورسنت لمدة 5-10 دقائق، ثم إزالتها عن طريق تطبيق الهواء المضغوط. طبقة واحدة من الخرز يبقى كهربية بالإضافة إلى ساترة. (C) Coverslips بين functionalized مع الخرز تستخدم لهلام السلطة الفلسطينية شطيرة مع سطح الزجاج المنشط. (D) عند إزالة الغطاء العلوي زلة التالية PA هلام polymerizatالأيوني، وتقع حبات داخل وجدا بالقرب من سطح هلام. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. PA جل السطحية تحتوي على 0.1 ميكرومتر قطر نيون الخرز وقبل طلاء PDL المعاملة الزجاج الغطاء العلوي زلة مع الخرز، تم تخفيفه الحل حبة (A) 10،000 أضعاف (3.64 × 10 8 حبات / مل) و (B) 20،000 أضعاف (1.82 × 10 8 حبات / مل). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3 الرقم اجهة 3. الخلوي الركيزة مع الخرز موضعية بالقرب من سطح هلام. التخطيطي اثنين من السيناريوهات التي تم كميا موقع حبة داخل هلام السلطة الفلسطينية باستخدام المجهر متحد البؤر وخوارزمية تحديد النقطه الوسطى. ويظهر السيناريو الأول في (A) الحمراء 100 نانومتر حبات القطر داخل هلام والأخضر 1 ميكرومتر الخرز قطرها على السطح، والثانية في (B) حبات خضراء 1 ميكرون القطر داخل هلام والخرز الحمراء 100 نانومتر في قطر السطح. (C) والتوضيح الكرتون خلية (أصفر) انضمت إلى مادة هلامية (الازرق) مع الخرز الأحمر المحلية داخل هلام قرب سطحه وحبة الخضراء يجلس على سطحه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. شريحة متحد البؤر (XY، وسط) والمرافق YZ (يسار) مشاهدة إسقاط هلام مع 0.1 ميكرومتر الخرز الحمراء جزءا لا يتجزأ من هلام و 1 ميكرومتر الخرز على السطح. وحدات لجميع محاور هم في نانومتر. ويعزى حدوث عرضية من الخرز الأحمر أعلاه، أو في نفس الطائرة مع حبات خضراء لتداخل طفيف في أطياف الانبعاثات مضان لأحمر (mCherry) والأخضر (GFP). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
5. الرقم المدرج الإحصائي عمق من الخرز تقتصر بالقرب من السطح العلوي من هلام السلطة الفلسطينية. التصلب 1 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، و 40وتتمثل كيلو باسكال من الأزرق والأحمر، والأسود، على التوالي. وقد تناسب منحنى جاوس لكل مجموعة البيانات ويتم تفسير س القيمة المقابلة لمدى اتساع هذه الظاهرة حيث بلغ متوسط ​​عمق من الخرز. تم اختبار سيناريوهين: (A) 0.1 ميكرومتر الخرز داخل هلام مع 1 ميكرومتر الخرز على السطح، و (B) 1 ميكرومتر الخرز داخل هلام مع 0.1 ميكرومتر الخرز على سطح يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
6. الرقم المدرج الإحصائي عمق من الخرز جزءا لا يتجزأ من جميع أنحاء تعسفا هلام السلطة الفلسطينية باستخدام طريقة تصنيع التقليدي (الأسود) والخرز موضعية بالقرب من الطبقة العليا من هلام السلطة الفلسطينية باستخدام هذه التقنية (أحمر) لالهلام السلطة الفلسطينية من تصلب A) 1 كيلو باسكال، B) 10 كيلو باسكال، وC) 40 كيلو باسكال. أقحم يظهر عمق من الخرز في كلا النوعين هلام داخل العلوي أكثر 10 ميكرون من هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم الحقل بسبب الجر خلية 7. المهجرين. (A) المرحلة صورة النقيض من الخلايا الليفية على 10 كيلو باسكال هلام (B) الحقل النزوح الناتجة عن الجر التي تولدها الخلايا الليفية. يشير شريط اللون النزوح حبة في نانومتر (C) الإسفار صورة 0.1 ميكرومتر الخرز قطرها تحت خلية قبل trypsinization. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الرقم 8
الرقم 8. توضيحات من موقع متوسط ​​من الخرز داخل هلام النسبي إلى حبة مختلفة الحجم / الطول الموجي يجلس على سطح هلام. وصلابة النقص هلام السلطة الفلسطينية من اليسار إلى اليمين (40 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، 1 كيلو باسكال). (A) الحمراء 0.1 ميكرومتر الخرز قطرها داخل هلام والأخضر 1 ميكرومتر الخرز قطرها على السطح. (B) الأخضر الخرز قطرها 1 ميكرومتر داخل هلام والأحمر 0.1 ميكرون الخرز قطرها على السطح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .

الرقم 9
الرقم 9. ديstribution القيم النظرية لτ / μ بناء على أعماق مختلفة حبة. الخرز 0.1 ميكرون في القطر إما فرقت بشكل موحد أو محلية بالقرب من السطح في (A) 1 كيلو باسكال المواد الهلامية، (B) 10 كيلو باسكال المواد الهلامية، و(C) 40 كيلو باسكال الهلام . السهم الذهب يشير إلى قيمة τ / μ لض = 0 الحالة، التي هي حبات على سطح هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

115px؛ "> 4122.5 1PX؛ "> 500
E (كيلو باسكال) 40٪ الأكريلاميد (ميكرولتر) BIS (تركيز) 2٪ BIS (ميكرولتر) 100 ملي HEPES (ميكرولتر) 0.1 625 0.00009 22.5 4225
0.25 625 0.0001 25 4222.5
0.5 625 0.00011 27.5 4220
0.75 > 625 0.0002 50 4197.5
1 625 0.0003 75 4172.5
1.5 625 0.0004 100 4147.5
2 625 0.0005 125
2.5 625 0.0006 150 4097.5
3 625 0.0008 200 4047.5
3.5 625 0.0009 225 4022.5
4 0.001 250 3997.5
4.5 625 0.0012 300 3947.5
5 625 0.0014 350 3897.5
5.5 625 0.0016 400
6 625 0.0018 450 3797.5
6.5 625 0.002 500 3747.5
7 625 0.0022 550 3697.5
7.5 < / td> 625 0.0024 600 3647.5
8 1000 0.001 250 3622.5
10 1000 0.0013 325 3547.5
15 1000 0.002 3372.5
20 1000 0.0027 675 3197.5
30 1000 0.0037 925 2947.5
40 1000 0.0048 1200 2672.5

الجدول1. PA جل التركيزات الكيميائية على أساس معامل يونغ. للاطلاع على المطلوب هلام السلطة الفلسطينية معامل المرونة، وينبغي أن يستكمل تركيزات المدرجة من الأكريلاميد، bisacrylamide، وعازلة HEPES مع 5 ميكرولتر حمض الاكريليك، 25 ميكرولتر 10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)، و 2.5 ميكرولتر TEMED.

7PT "العرض =" 62 "> 5
ض (ميكرومتر) ش العاشر ((τ / μ) ميكرون)
0 0.750
0.394
1 0.237
1.5 0.164
2 0.124
2.5 0.100
3 0.083
3.5 0.071
4 0.062
4.5 0.056
0.050

الجدول 2. نزوح بوصفها وظيفة من τ / μ الموافق العمق، ض، من الخرز من سطح هلام على أساس نظرية Boussinesq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند استخدام هذه التقنية، فمن الضروري أن الحل حبة وتضعف بشكل صحيح ويتم اختيار حبات بناء على القطر المطلوب، PA هلام الركيزة وصلابة، وحجم حجم الظواهر التي تم استكشافها في التجربة المطلوبة.

وينبغي اتخاذ الحذر عند تمييع الحل حبة قبل functionalizing أعلى زلات غطاء زجاجي. التباعد بين الخرز على سطح هلام يمكن تغييرها عن طريق تغيير عامل التخفيف من الحل الغروانية. سوف تمييع الحل كثيرا تقليل عدد حبات أن الزوجين لانزلاق الغطاء ويخفض في النهاية عدد من الخرز في هلام. يمكن تمييع الحل القليل جدا تسفر عالية جدا كثافة من الخرز في هلام مثل أنهم على اتصال ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. بينما غالبا ما يكون من المستحيل تجنب تماما وجود جسيمات متناهية الصغر تجميع، وتطبيق الموجات فوق الصوتية إلى محلول مخفف يقلل نان فعالتجميع oparticle. لقد وجدنا أن تخفيف 10،000 أضعاف من الحل الغروانية المستخدمة في هذا البروتوكول يعطي تركيز حبة من 3.64 × 10 8 حبات / مل، وينتج كثافة الجسيمات مرغوب فيه من 0.05 الخرز / 2 ميكرون ل0.1 ميكرون حبات القطر. و1: 20،000 التخفيف (1.82 × 10 8 حبات / مل) ينتج في المتوسط ​​52 ميكرون الجسيمات 2 في الشكل 2 يظهر صورا لسطح الهلام مع التخفيفات مختلفة. تجدر الإشارة إلى أن هناك تقلب في عدد من الخرز التي تنقل إلى هلام. ويرجع ذلك إلى التقلبات المرتبطة إزالة الحل حبة من انزلاق الغطاء مع الهواء المضغوط أثناء functionalization. بشكل عام، وجدنا أن زيادة عامل التخفيف على الأقل عامل من اثنين ينتج باستمرار في ما لا يقل عن زيادة بمقدار الضعف في المساحة لكل حبة.

ومن الأهمية بمكان أيضا لاختيار حجم حبة (قطر) التي من شأنها أن تؤدي إلى الانغماس الكامل رانه حبة داخل الجل على السلطة الفلسطينية البلمرة. تؤثر هلام صلابة الموقع من الخرز كما هو مبين في الشكل 5A. ل0.1 ميكرومتر الخرز قطر، وعمق يزيد حبة مع تناقص صلابة. هذا يمكن أن يكون نتيجة للعلاقة عكسية بين حجم المسام والسلطة الفلسطينية هلام صلابة 13. لجميع المواد الهلامية صلابة ثلاثة اختبار، يتم ترجمة حبات باستمرار داخل هلام، وحدود 1 ميكرون من سطح الجل كما هو موضح في الشكل 8A. في موقع متوسط ​​من 1 ميكرومتر الخرز داخل هلام يختلف أيضا مع صلابة. هي جزء لا يتجزأ أنها أعمق (حوالي 1.25 ميكرون) في 1 كيلو باسكال المواد الهلامية. ل10 و 40 كيلو باسكال المواد الهلامية، وموقع أعلى من 1 ميكرومتر الخرز قطرها يتراوح بين حوالي 0.5 ميكرومتر إلى 0.5 ميكرومتر فوق تحت هلام (الشكل 5) السطح، مما يعني حبات تبرز أحيانا من خلال الجزء العلوي من هلام (الشكل 8B). هذا هو ضار لأنه يدخل topograومن المعروف فيز للخلايا، والتضاريس تؤثر على التفاعلات خلية الركيزة 14. وبالتالي، فمن الضروري أن تضع في اعتبارها اختيار حبات لهذه التقنية عند إعداد المواد الهلامية على صلابة محددة. اثنين من أحجام حبة تستخدم لوصف هذه الطريقة، 0.1 ميكرون قطر يثبت الحجم الأمثل. قد تكون استخدمت أحجام حبة أخرى في مع هذه التقنية، ولكن ينبغي معايرة باستخدام متحد البؤر المجهري كما وصفنا هنا، لفهم عمق الدقيق الذي يتم ترجمة الخرز هلام خلال البلمرة.

هذه التقنية يحسن القرار المكانية من الخرز في هلام السلطة الفلسطينية من خلال زيادة عدد الجسيمات مميزة داخل مجال الرؤية. إضفاء الطابع المحلي على حبات لطبقة بالقرب من أعلى هلام لا تؤثر تأثيرا كبيرا على صلابة المركبة من هلام. ويستخدم Isostress نظرية المركبة لحساب معامل المرونة مركب، E ج، فقط طبقة 1 ميكرون سميكة من هلام يحتوي على BEAس و

المعادلة 1

حيث E و هي معامل مرونة من الخرز البوليسترين (3 جيد جدا)، E m هو معامل المرونة من المصفوفة هلام (10 كيلو باسكال)، والخامس والخامس م و هي الكسور حجم الخرز وهلام مصفوفة، على التوالي. لأن حبات تشمل فقط 0.03٪ من حجم، E ج = 10.0025 كيلو باسكال لا يختلف كثيرا عن معامل مرونة من هلام الخواص من الصلابة 10 كيلو باسكال. طريقة الموضوعة لافتعال المواد الهلامية PA يقلل من الوقت البلمرة إلى 30 ثانية، وبالتالي التقليل من تأثير الجاذبية على توزيع حبات خلال البلمرة 15. يعتمد اسلوبنا على أطول (~ 30 دقيقة) وقت البلمرة لحبات لتتبلمر في هلامبحيث أنها لا تبرز على سطح هلام. لإضفاء الطابع المحلي على حبات لطبقة واحدة لا يؤثر بشكل كبير على صلابة هلام مركب، وأطول البلمرة الوقت يساعد على نقل حبات في مصفوفة هلام، نحن لا تتضمن أي إجراء للحد من الوقت البلمرة في أسلوبنا.

توضح أسلوبنا كيفية توطين حبات على عمق المعروف داخل هلام السلطة الفلسطينية، مما يحسن من قياس الركيزة تشوه، وبالتالي حساب القوات الجر الخلية. نهج النظري لقياس قوى الجر الخلوية ذكرت سابقا 16،17. هذا النهج يعامل باعتباره الركيزة هلام شبه الصلبة في الفضاء اللامتناهي نصف مرن. ويستخدم الحل Boussinesq لحل المشكلة العكسية حساب القوات الجر من حقل النزوح. نحن توظيف نسخة مبسطة من Boussinesq جزءا لا يتجزأ من تحديد الخطأ في قياس النزوح بسبب الخرز البعيدة من ق هلامurface 18. المعادلة للنزوح في اتجاه معين على أساس تطبيق إجهاد القص، τ، على مدى نصف قطرها معينة، R، تعطى من قبل

المعادلة 2

حيث ش x هو النزوح في اتجاه x، μ هي معامل القص، و z هي عمق حبات من سطح هلام. لمواقع مختلفة من الخرز طوال عمق هلام، وتظهر نزوح المناظرة في الجدول 2.

للقضية هو موضح هنا، ويقدر نصف قطرها الى أن يكون متوسط ​​حجم التصاق البؤري من 1 ميكرون. إذا يفترض أن حبات متحد المستوى مع الخلايا (ض = 0)، وتعطى تشريد بنسبة 0.75 τ / μ. إذا كانت حبات فقط 1 ميكرون تحت سطح هلام، وتعطى تشريد بنسبة 0.24 τ / μ. هذايمثل انخفاضا أكبر من ثلاثة أضعاف في النزوح من متحد المستوى حبة مع السطح إلى موقع 1 ميكرومتر أدناه. يقدم هذا الخطأ في حساب القوات الجر سطح بناء على اقتراح من الخرز جزءا لا يتجزأ من الذي لا يعرف مواقع داخل هلام دقيق. الاختلاف في الجر التي يحددها τ / μ، بوصفها وظيفة من عمق الخرز في هلام لكل من طرق التصنيع التقليدية المقترحة ومهم. ويبين الشكل 9 توزيع القوات (التي قدمها لنسبة τ / μ) على على نظرية Boussinesq التي تنتج عن استخدام حساب توزيع أعماق حبة، ض، داخل العمق البصري من الحقل عند توزع حبات موحد في هلام ومحلية بالقرب من السطح. ان قياس أدق للقوة الخلية يؤدي إذا كانت حبات على نفس الطائرة والخلايا، حيث ض = 0 و τ / μ = 0.0133. عند مقارنة هذه الحالة، τ / μ الزيادات 118٪، 80٪، و 50٪ لل1 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، والمواد الهلامية 40 كيلو باسكال، على التوالي، عندما يتم ترجمة الخرز بالقرب من السطح باستخدام تقنية نقترح. عندما توزع حبات موحد في جميع أنحاء عمق هلام، τ / μ يزيد إضافي 60٪، 80٪، و 150٪ وراء الزيادة الناجمة عن توطين الخرز بالقرب من السطح، ل1 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، والمواد الهلامية 40 كيلو باسكال، على التوالي. هذا يمثل ما مجموعه تقريبا 200٪ خطأ في الحسابات الجر عندما توزع حبات طوال عمق هلام. وبالتالي، إضفاء الطابع المحلي على حبات على عمق المعروف داخل هلام يحسن الدقة في القياسات النزوح وقوات الجر الخلية.

تقنية الموضحة هنا تقدم طريقة جديدة لإعداد السلطة الفلسطينية ركائز هلام لتطبيقات قوة الجر المجهري مثل هذه أن يتم ترجمة الخرز بالقرب من سطح هلام. حصر حبات على عمق المعروفة داخل هلام السلطة الفلسطينية يقدم معلومات جديدة حول النزوح الفعلي من الخرز بناء على طلب قوة الخلية، وخلق صباحاخام صورة دقيقة عن كيفية الخلايا تشويه الركيزة التي تقوم عليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن نعترف برنامج مبادرة التخصصات الابتكار، جامعة إلينوي، منح 12035. وقد تم تمويل SK في UIUC من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة 0965918 IGERT: تدريب الجيل القادم من الباحثين في الخلوية والجزيئية وميكانيكا BioNanotechnology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) Sigma-Aldrich 281778
70% Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 111-30-8
1 M HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
40% Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
2% Bisacrylamide Sigma-Aldrich M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) Invitrogen F8801
Fibronectin, Human, 1 mg BD Biosciences 354008
Ammonium persulfate Bio-RAD 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-RAD 161-0801
Poly-D-lysine Millipore A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)  Thermo Scientific 22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) Thermo Scientific 24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Life Technologies 25300-054
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Acrylic acid  Sigma-Aldrich 147230
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass In Vitro Scientific D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam. Ted Pella, Inc. 26023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  3. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
  4. Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
  5. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  6. Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
  7. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
  8. Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
  10. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16 (2010).
  11. Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
  12. Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  13. Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
  14. Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
  15. Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
  16. Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
  17. Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
  18. Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 91، الميكانيكا الخلية، بولي أكريلاميد (PA) هلام، قوة الجر المجهري، والخرز الفلورسنت، وبولي-D-يسين (PDL)، سطح خلية ثقافة
طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M.… More

Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51873, doi:10.3791/51873 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter