En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

Summary

Traditionelle teknikker til fremstilling af polyacrylamid (PA), geler, der indeholder fluorescerende prober indebærer sandwiching en gel mellem en Tilhænger overflade og en glasplade. Her viser vi, at overtrække denne objektglas med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende prober lokaliserer prober inden for 1,6 um fra geloverfladen.

Abstract

PA geler har længe været anvendt som en platform til at studere celle trækkræfter på grund af lethed af fabrikation og evnen til at tune deres elastiske egenskaber. Når substratet er coatet med et ekstracellulært matrixprotein celler klæbe til gelen og anvende kræfter, der forårsager gelen deformeres. Deformationen afhænger cellen trækkraft og de elastiske egenskaber af gelen. Hvis deformation på overfladen er kendt, kan overfladen trækkraft beregnes ved hjælp af elasticitet teori. Gel deformation måles normalt ved at indlejre fluorescerende markør perler ensartet ind i gelen. Proberne fortrænge som gelen deformeres. Proberne nær overfladen af ​​gelen spores. De forskydninger rapporteret af disse prober betragtes som overfladeaktive forskydninger. Deres dybder fra overfladen ignoreres. Denne antagelse introducerer fejl i trækkraft evalueringer. Til præcis måling af celle-kræfter, er det afgørende for placeringen af ​​perlerne kendt. Vi har udvikleten teknik, der udnytter simpel kemi at begrænse fluorescerende markør perler, 0,1 og 1 um i diameter, i PA geler inden for 1,6 um af overfladen. Vi pels et dækglas med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende perler. PA gelopløsning derefter indlagt mellem dækglasset og en klæbende overflade. De fluorescerende perler overføre gelen opløsningen under hærdning. Efter polymerisering PA gel indeholder fluorescerende perler på et plan tæt geloverfladen.

Introduction

Den mekaniske vekselvirkning af en levende celle med sin lokale miljø er ofte blevet undersøgt ved hjælp af PA geler. Disse substrater er afhængige af en enkel, velkarakteriseret protokol er fastlagt af Dembo og Wang i 1997 ^1. En af de vigtigste fordele ved disse substrater er, at deres stivhed kan indstilles ved at ændre koncentrationen af bestemte komponenter i gelopløsningen. Dette giver en ønskelig platform at undersøge cellers interaktion med miljøer af forskellige stivheder. Når PA geler belagt med ekstracellulær matrix (ECM) proteiner, celler klæbe til dem, genererer kraft. Som et resultat af celle kraft gelen deformeres som et elastisk legeme. Denne deformation afhænger af størrelsen af ​​den kraft, der påføres af cellerne, og de elastiske egenskaber af gelen. Forskellige undersøgelser har beskæftiget PA geler til at undersøge cellulære trækkræfter.

I en variation af PA-gel fabrikation, er fluorescerende mikrosfærer (perler) indlejret throughout gelen at kvantificere celle trækkræfter på geler af forskellige stivheder ^2. Ved celle kraftpåvirkning, perlerne fortrænge fra deres oprindelige placering efter gel deformation. Deformationen felt er målt fra de enkelte perle forskydninger. Denne deformation felt anvendes med elasticitet teori og de elastiske egenskaber af gelen at beregne trækkræfterne. Disse målinger giver indsigt i, hvordan celler mekanisk sanse og interagere med deres lokale mikromiljø ^3.

I mange udbredte PA-gel fabrikation protokoller perlerne blandes hele PA-gel i flydende, upolymeriseret tilstand. En fuldt polymeriseret PA gel indeholder fluorescerende kugler i hele dens volumen. Ved opgørelse celle trækkræfter, er perler fleste nær geloverfladen (celle-substrat interface) overvåges. Forskydningerne af disse perler er antaget at forekomme på cellekultur overflade til enkelhed i kraft calculation. Den faktiske placering af perlerne i dybden af ​​gelen bort. Men i en elastisk (såsom PA-gel), en vulst tættere til et punkt kraftpåvirkning vil bevæge sig mere end en perle, der er længere væk fra det punkt. Således behandling af forskydning af et punkt (på perlen placering) distalt fra overfladen som på resultaterne overflade i en undervurdering af cellulære traktioner. Graden af ​​fejl afhænger af afstanden af ​​vulsten fra overfladen. Fejlen kan ikke beregnes uden kendskab til placeringen af ​​perlen.

Behovet for en simpel metode til at begrænse perler meget nær cellekultur overflade er blevet behandlet med et par teknikker. En måde er at øge tætheden af ​​perler hele gelen sådan, at der er et tilstrækkeligt antal af perler i den øverste brændplanet for at måle bevægelser meget nær overfladen. En anden teknik indebærer etablering af en konfokal billeddannelse kammer levende celler, således at lyset frakun de perler i det øverste mest fokalplan indsamles ^4. En anden fremgangsmåde involverer at overlejre et ekstremt tyndt lag af PA gel indeholdende perler på toppen af en allerede polymeriseret gel uden perler ^5. En ulempe ved hver af disse teknikker er, at den præcise placering af perlerne i gelen ikke er kendt. Dette indfører fejl i beregningen af ​​feltet forskydning af perlerne og dermed beregningen af ​​celle kræfter. En anden teknik involverer konjugering af perler til den øverste overflade af en allerede polymeriseret PA under anvendelse af Sulfo-SANPAH ^6. Denne teknik sikrer perlerne er faktisk kun på toppen af ​​PA-gel, men i hvilket omfang de er indlejret i dybden af ​​gelen er ukendt. Dette kunne skabe en lokal topografi for cellerne, der kunne ændre celle adfærd, som tidligere arbejde har antydet, at celler kan fornemme kraft flere mikron væk ^7. For nylig, en teknik til mønstring PA geler med 1 um diameter fluorescent fibronektin dot markører i en legaliseret opstilling blev etableret ^8. I dette tilfælde, er dybden af ​​fluorescerende markører er kendt, og er i det væsentlige nul, som fibronectin mønster indirekte er trykt på geloverfladen. Men denne metode ikke giver en kontinuerlig miljø, hvor cellerne kan vedhæfte, som ECM proteinet er begrænset til 1 um prikker diameter. Er endnu ikke etableret en metode til fuldt at integrere tracker perler indenfor PA geler og begrænse dem til en kendt placering meget tæt på overfladen.

Her udvikler vi en teknik til at begrænse under-um til um diameter fluorescerende kugler til en fokalplan meget nær cellekultur overflade i PA-gel. En gel er typisk hærdes ved sandwich upolymeriseret flydende gelopløsning mellem to glasplader. En af pladerne er funktionaliseret således, at gelen kraftigt klæber til det. Den anden er funktionaliseret og fjernes efter gel helbredelsesmetoder. Vi ændrer på dette flytbare glas surface ved at belægge den med et lag af perler. Ved sandwiching flydende gel mellem funktionaliserede og perlen overtrukket glasoverflade, perlerne overført til gelen, mens den hærder. Dette begrænser afstand af perlerne integration i gelen inden 1,6 um af overfladen. Glas-bund petriskåle anvendes som den klæbende overflade, på hvilken gelen er hærdet. For at danne en flad top gel overflade under polymerisationen, er et cirkulært dækglas anvendes til sandwich gelen med glasbund petriskål. Forud for gelen fabrikation, bliver det øverste dækglas coatet med poly-D-lysin (PDL), hvilket gav en positiv overfladeladning. PDL blæses med trykluft, og en opløsning af perler i vand er deponeret på dækglassene. Vi udnytter carboxylerede fluorescerende mikrokugler, som bærer en negativ ladning, og interagere med positivt ladede overflade skabt af behandling med PDL. Efter blæser perleopløsning fra dækglasset med trykluft, et enkelt lag afperler forbliver elektrostatisk koblet til den tørre dækglas. PDL belægning påvirker ikke klæbeevne af glasset til geloverfladen, da objektglas er ubeskadigede og fjernet fra PA gelen helt intakt.

Glas-bund petriskåle gøres klæbende ved behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane og 0,5% glutaraldehyd. PA geler af ønskede stivheder er skabt ved at blande passende koncentrationer af bisacrylamid og acrylamid via en standard procedure ^9. En dråbe af gelen opløsningen pipetteres på glasbund petriskål. Den dækglas indeholder perlerne anvendes til sandwich gelen med petriskålen. Når gelen er hærdet, bliver det øverste dækglas fjernes forlader perler indlejret i PA-gel inden for 1,6 um fra overfladen.

Protocol

Bearbejdning og funktionalisering PA geler af forskellige stivheder med fluorescerende mikrosfærer indlejret nær cellekultur overflade.

1. funktionalisere Top dækglas

1. Ren dækglas (# 1.0, 12 mm diam.) Med sæbe og vand, efterfulgt af ethanol for at fjerne uvedkommende støv.
2. Placer dækglas på en revet overflade (dvs. pipettespids indehaver), således at de ikke rører for at lette nem interaktion med dækglas.
3. Belæg hele overfladen af dækglas med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) i 1 time (figur 1A).
4. I løbet af denne tid, udføre en 1: 10.000 fortynding af kolloid opløsning af 0,1 um i diameter, til røde fluorescerende mikrosfærer med deioniseret (DI) vand opnå en partikel massefylde på ca 1 mikrosfære pr 20 um ² på geloverfladen. Se Figur 2 for resultaterne af de forskellige fortyndinger. Denne dilution kan ændres for at opfylde behovet for særlige forsøg.
5. Anbring den fortyndede opløsning i et ultrasonisk vandbad i 30 minutter.
6. Efter 1 time, skal du bruge en pincet til at forsigtigt løfte hver dækglas og blæse tør med luft. Retur de tørre dækglas til revet overflade.
7. Tag den fortyndede kolloidopløsning fra ultralydsbadet og pipette 150 ul på hver dækglas. Lad i 10 min (Figur 1B).
8. Brug en pincet til at forsigtigt løfte hver dækglas og blæse tør med luft. Retur tørre dækglas til revet overflade og opbevar i mørke, indtil klar til brug.

2. Forberedelse PA Gel Direkte på Glass Bottom Petriskåle

1. Forvarm varmeplade til 100 ° C.
2. Udlæg det ønskede antal glasbund petriskåle (35 mm skål med 14 mm mikro-godt, # 1.0) på en flad overflade i et stinkskab.
3. Dæk glasset del af hver petriskål mikro-godt med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysLiane (3-APTES) i 7 minutter til kemisk aktivering. Tag forsigtighed for at undgå utilsigtet drypper af 3-APTES på overfladen af ​​plastmaterialet i petriskålen for at undgå nedbrydning af polystyren.
4. Efter 7 min, fyld petriskål med DI-vand og bortskaffe i affaldsbeholder.
5. Gentag trin 2.4 3x for hver skål, og derefter ryste petriskålen for at fjerne ekstra vand. Placer petriskåle på varmepladen, indtil glasset del er tør.
6. Fjern petriskåle fra varmepladen og vende tilbage til en flad overflade i et stinkskab.
7. I stinkskab, gøre en opløsning af 0,5% glutaraldehyd og dækker glasset del af hver petriskål godt med opløsningen i 30 minutter. Tag forsigtighed for at undgå utilsigtet drypper af glutaraldehyd til overfladen af ​​plasten i petriskålen for at undgå nedbrydning af plast.
8. Efter 30 minutter fylde petriskål med DI-vand og bortskaffe i affaldsbeholder at skylle og fjern glutaraldehyde.
9. Gentag trin 2.4 3x for hver skål, og derefter ryste petriskålen for at fjerne ekstra vand. Placer petriskåle på varmepladen, indtil glasset del er tør.
10. Før blande bestanddelene af PA-gel løsning, flytte funktionaliserede objektglas i kemisk stinkskab, således at de er let tilgængelige, der giver mulighed for hurtig Sandwiching af gelen med glasbund petriskåle efter blanding af gel løsning.
11. I et 15 ml centrifugerør, blandes 40% bisacrylamid, 2% acrylamid og acrylsyre umiddelbart efter hinanden i de koncentrationer, der er anført i tabel 1 (tilpasset fra publicerede protokol ¹⁰⁾ for at opnå den ønskede matrix elasticitet.
12. Tilsæt 100 mM HEPES, 10% ammoniumpersulfat og TEMED i mængder, der er anført i tabel 1, der svarer til den ønskede matrix elasticitet for at fuldføre gelopløsning.
13. Umiddelbart pipette 15 pi gelopløsning på midten af ​​glasset delaf petriskåle.
14. Straks afhente en funktionaliseret dækglas med en pincet.
    1. Vend dækglas over så at de fluorescerende perler er på den side får kontakt med gel løsning.
    2. Læg dækglasset forsigtigt på toppen af den nu flydende PA-gel, således at den funktionaliserede side er i kontakt med gelen (figur 1C). Bemærk: For at opnå de bedste resultater, er en anden person, der anbefales til den rolle, tilføjer dækglasset for at undgå muligheden for delvis polymerisation mens pipettering flydende PA-gel løsning på flere petriskåle.
15. Flip alle petriskåle over til at hjælpe med at undgå tyngdekraft effekter på fluorescerende nanopartikler polymerisering i lavere niveauer af PA-gel.
16. Vent i mindst 35 minutter, eller indtil stamopløsningen af ​​PA gelen er synligt polymeriseret i sin centrifugerør.
17. Flip petriskåle tilbage over og fylde dem med PBS til at hjælpe med at fjerne dækglasset.
18. Gøre forsigtigt kontakt med glasset del af petriskålen og omridset af dækglasset ved hjælp af en pincet til at skrabe omkredsen af ​​dækglasset. Udfør flere cykler, indtil dækglasset løsnes. Fjern dækslet slip og bortskaffes i en ordentlig skarpe genstande affaldsbeholder.
19. Efter at have fjernet alle dækglas, vil fluorescerende kugler har overført til gel (figur 1D). Dæk PA geler helt med PBS, anbringes petriskålen låget på hver skål, og opbevares ved 4 ° C.

3. funktionalisering PA gel med fibronectin

1. Klargør følgende forblandede opløsninger som beskrevet i en etableret protokol ^11: Soak opløsning (137 mM NaCI, 5% (v / v) glycerol) og 2x konjugation puffer (0,2 M 2-(N -morpholino) ethansulfonsyre (MES), 10 % (v / v) glycerol, pH 4,5).
2. Brug en vakuumpumpe i en biologisk hætte for at fjerne al PBS fra glasbund skåle indeholdende PA geler.
3. Pipettete iblødsætningsopløsning på hver gel, således at gelen er helt neddykket. Inkuber ved stuetemperatur i mindst 1 time.
4. Varm 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) og N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) til stuetemperatur.
5. Bland 10x opløsninger af EDC (150 mm, 19 mg / ml i DI vand) og NHS (250 mm, 29 mg / ml i destilleret vand).
6. Bland 1 del 10x EDC, 1 del 10x NHS, 3 dele DI vand, og 5 dele 2x konjugation buffer.
7. Brug en vakuumpumpe i en biologisk hætte for at fjerne iblødsætningsopløsningen. Sørg for at alt væsken er fjernet fra gelen overflade.
8. Tilføj nok NHS / EDC løsning til at dække geloverfladen og fylde glas-bund godt af petriskålen (150-250 ul). Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
9. Tø fibronectin ved stuetemperatur. Efter optøning blandes sterilt deioniseret vand for at skabe en 50 ug / ml fibronectin opløsning.
10. Brug en vakuumpumpe i en biologisk hætte at fjerne NHS / EDC Solution. Sørg for at alt væsken er fjernet fra gelen overflade.
11. Tilføj 150 ul fibronektin opløsning til hver gel. Inkuber ved stuetemperatur i 35 min for at tillade binding af fibronectin.
12. Efter 35 min tilsættes PBS til hver petriskål, og opbevar ved 4 ° C i op til 2 uger.

4. Trækkraft Eksperimenter

1. Varm cellemedier PBS, og trypsin til 37 ° C i et vandbad.
2. Skyl geler 5x med sterilt PBS, opsugning PBS i mellem skylninger, og lade den være dækket i hætten.
3. Tilsæt 1 ml trypsin pr 25 cm ² til kolbe indeholdende celler. Efter cellerne er løftet fra kolben, fortyndes trypsin med celle medier og tælle cellerne. Baseret på gel overfladeareal, bestemme antallet af celler, der kræves pr gel til en endelig cellepodning densitet på 3.000 celler / ^cm2. Fortynde eller koncentrere suspensionen således, at 150 pi af cellen medier blanding indeholder dette antal celler. Alikvote 150 pi celle suspension på hver gel.
4. Placer petriskåle indeholdende celler i en inkubator i 30 minutter. Derefter fjernes forsigtigt petriskåle og fyld resten af ​​petriskålen med medier (ca. 2 ml), således at overfladen af ​​skålen er helt neddykket.
5. Placer petriskåle tilbage i inkubatoren indtil billedet erhvervelse.
6. Forbered mikroskop og datafangst system til billeddannelse: indsæt 40x nedsænkning i vand mål indsætte Differential Interference Contrast (DIC) prisme, skal du vælge mCherry eller tilsvarende fluorescerende filter, og tænd den miljømæssige kammer.
7. Når forberedt til billedbehandling, fjerne en petriskål fra rugemaskinen, og læg den forsigtigt på mikroskop scenen. Fjern petriskål låg til DIC billeddannelse.
8. Find en enkelt celle og tage et enkelt stillbillede af cellen i DIC.
9. Uden at flytte mikroskopbordet, skifte billedbehandlingstype til fluorescens. Fokus på de fluorescerende mikrosfærer og recOrd et billede af mikrosfærerne.
10. Fjern forsigtigt cellemedier fra petriskålen med en pipette, og der tilsættes 0,05% trypsin-EDTA.
11. Billede mikrosfærerne under cellen efter cellerne er fritliggende.
12. Brug partikel billede Velocimetri (PIV) analyse i ImageJ ¹² til at beregne forskydningen felt på grund af cellulære kræfter.

Representative Results

Konfokal afbildning anvendes til at bestemme, at perlerne var faktisk under geloverfladen og kvantificere deres nøjagtige placering i gelen dybde. Fluorescerende perler af en anden bølgelængde end inde i gelen fik lov at slå sig ned på overfladen, og afstanden mellem de indlejrede fluorescerende nanopartikler og de på overfladen blev beregnet ved hjælp af en centroid identifikation algoritme. Placeringen af ​​vulst på geloverfladen tjener som reference for den øverste overflade af gelen, hvor celler gælder kraft ved tilslutning til overfladen. En skematisk gengivelse af de to scenarier (grønne kugler i gelen med røde perler på overfladen, og omvendt) er vist i figur 3. Algoritmen interpolerer z-højden af den tredimensionale tyngdepunkt placering. Vi gentog denne proces tre stivhed geler (1, 10, og 40 kPa) og to størrelse (diameter) fluorescerende kugler (0,1 um røde og 1 um gul-grøn). Afstandenmellem en stribe inden for gel og dets nærmeste nabo en anden bølgelængde blev bestemt på grundlag af sin tre-dimensionelle tyngdepunkt. Figur 4 viser den rumlige fordeling af perler (på oversiden og indlejret), og den forventede syn på YZ-planet. Sidstnævnte giver dybder alle perlerne fra overfladen af ​​gelen.

Den gennemsnitlige dybde på 0,1 um perler er 619 nm, 467 nm, 278 nm for PA geler af stivhed 1, 10 og 40 kPa (figur 5A). De tilsvarende dybder for 1 um diameter perler er -20 nm i 40 kPa geler, 12 nm i 10 kPa geler og 1.255 nm i 1 kPa geler (figur 5B). Konfokal billeddannelse blev også udført på geler med perler spredt over hele gel som traditionelt har været brugt til PA geler beregnet til trækkraft mikroskopi studier. Dybden af ​​kugler dispergeret gennem PA gelen blev målt ved anvendelse af den samme algoritme som tidligere beskrevet og er i forhold til depths ved hjælp af teknik, som vi her præsenterer. Figur 6 illustrerer variationen i perlen dispersion i dybden af en PA under anvendelse af traditionelle fremstillingsmetoder.

Fibroblaster tillægger PA geloverflade når funktionaliseret med fibronectin. Vilkår for en fibroblast celle og den tilsvarende fluorescerende perler lag Forskydningen er vist i figur 7. Perler nær periferien af billedet ser lidt ude af fokus. Dette er ikke en mekanisk defekt på den del af gelen, som glasset forbliver intakt efter fjernelse fra gelen. Det er snarere et resultat af en optisk effekt på grund af nedsænkning i vand mål anvendt i dette eksperiment. Ved tilsætning af trypsin til mediet, er cellen frigøres fra overfladen, hvilket resulterer i afkastet af den deformerede PA-gel overflade til sin oprindelige tilstand. En krydskorrelationsindeks algoritme blev anvendt til at beregne deformation felt baseret på perle forskydninger ^10. Denforskydning kort illustrerer en dominerende polarisering af celle trækkræfter i y-retningen.

Figur 1. Illustration af funktionalisering proces for top dækglas med PDL og selvlysende perler. (A) dækglas (blå) inkuberes med 0,1 mg / ml PDL (orange) i 1 time. Komprimeret luft anvendes til at blæse dækglas tørre og fjerne PDL. (B) dækglas inkuberes med en opløsning af 100 nm diameter fluorescerende perler i 5-10 minutter, og derefter fjernes ved anvendelse af trykluft. Et lag af perler forbliver elektrostatisk koblet til dækglasset. (C) dækglas funktionaliseret med perler anvendes til sandwich-PA-gel med et aktiveret glasoverfladen. (D) Efter fjernelse af det øverste dækglasset efter PA-gel polymerization perlerne placeret inden og meget nær overfladen af gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. PA geloverflade indeholdende 0,1 um diameter fluorescerende kugler. Inden belægning PDL-behandlede top dækglas med perler blev perlen fortyndet (A) 10.000 gange (3,64 x 10 ⁸ perler / ml) og (B) 20.000 gange (1,82 x 10 ⁸ perler / ml). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Celle-substrat grænsefladen med perler lokaliseret nær overfladen af gelen. En skematisk af to scenarier, hvor perle placering inden for et PA-gelen blev kvantificeret ved anvendelse af konfokal mikroskopi og et tyngdepunkt identifikation algoritme. Det første scenario er vist i (A) Red 100 perler nm diameter inde i gelen og grønne 1 um diameter perler på overfladen, og den anden i (B) Grøn 1 perler um diameter inde i gelen og røde 100 nm diameter perler på overfladen. (C) En tegneserie illustration af en celle (gul) klæbet til en gel (blå) med røde perler lokaliseret inde i gelen nær dens overflade og en grøn perle sidder på overfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Konfokal skive (XY, i midten), og som ledsager YZ (venstre) projektion visninger af en gel med indlejret i gelen rød 0,1 um perler og 1 um perler på overfladen. Enhederne for alle akser er i nanometer. Lejlighedsvis forekomster af røde perler over eller i samme plan som grønne perler tilskrives mindre overlapning i fluorescensemissionsspektrer for rød (mCherry) og grøn (GFP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Histogrammer af dybden af perler begrænset nær den øverste overflade af PA-gel. Stivheder 1 kPa, 10 kPa og 40kPa er repræsenteret ved blå, rød og sort, henholdsvis. En Gaussisk kurve var egnet til hvert datasæt og x-værdi, der svarer til dens amplitude fortolkes som den gennemsnitlige dybde af perler. To scenarier blev testet:. (A) 0,1 um perler inde i gelen med 1 um perler på overfladen, og (B) 1 um perler inde i gelen med 0,1 um perler på overfladen Klik her for at se en større version af dette figur.

Figur 6. Histogrammer af dybden af perler indlejret vilkårligt hele PA under anvendelse af en traditionel fremstillingsmetode (sort) og perler lokaliseret nær det øverste lag af PA under anvendelse af denne teknik (rød) til PA geler af stivhed A) 1 kPa, B) 10 kPa,og C) 40 kPa. Indsat viser dybden af perlerne i både gel typer inden for den øvre mest 10 um af gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Displacement felt grundet celle trækkraft. (A) fase kontrast billede af en fibroblast på 10 kPa gel. (B) Fortrængning felt, der dannes ved træk genereret af fibroblast. Farve bar indikerer perle forskydning i nanometer. (C) fluorescensbillede på 0,1 um diameter perler under en celle før trypsinisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8. Illustration af gennemsnitlig placering af perler inde i gelen i forhold til en anden størrelse / bølgelængde kugle sidder på geloverfladen. Stivhed PA gel aftager fra venstre til højre (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) Rød 0,1 um diameter perler inde i gelen og grøn 1 um diameter perler på overfladen. (B) grøn 1 um diameter perler inde i gelen og røde 0,1 um diameter perler på overfladen. Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 9. Distribution af teoretiske værdier for τ / μ baseret på forskellige perle dybder. perler 0,1 um i diameter blev enten ensartet dispergeret eller lokaliseret nær overfladen i (A) 1 kPa geler, (B) 10 kPa geler, og (C) 40 kPa geler . Guldet pilen angiver værdien af τ / μ for z = 0 sag, hvor perlerne er på geloverfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.

115px; "> 4122,5 1px; "> 500

E (kPa)	40% acrylamid (ul)	BIS (koncentration)	2% BIS (ul)	100 mM HEPES (ul)	0.1	625	0,00009	22.5	4225
0.25	625	0,0001	25	4.222,5
0,5	625	0,00011	27.5	4220
0.75	> 625	0,0002	50	4.197,5
1	625	0,0003	75	4.172,5
1.5	625	0,0004	100	4.147,5
2	625	0,0005	125
2.5	625	0,0006	150	4.097,5
3	625	0,0008	200	4.047,5
3,5	625	0,0009	225	4.022,5
4		0.001	250	3.997,5
4,5	625	0,0012	300	3.947,5
5	625	0,0014	350	3.897,5
5.5	625	0,0016	400
6	625	0,0018	450	3.797,5
6.5	625	0.002	500	3.747,5
7	625	0,0022	550	3.697,5
7.5 < / Td>	625	0,0024	600	3.647,5
8	1000	0.001	250	3622,5
10	1000	0,0013	325	3.547,5
15	1000	0.002	3.372,5
20	1000	0,0027	675	3.197,5
30	1000	0,0037	925	2.947,5
40	1000	0,0048	1200	2.672,5

Tabel1. PA Gel Kemiske Koncentrationer baseret på Youngs Modulus. For en ønsket PA gel elasticitetsmodul, skal de anførte koncentrationer af acrylamid, bis-acrylamid, og HEPES puffer suppleret med 5 ul acrylsyre, 25 pi 10% ammoniumpersulfat (APS), og 2,5 pi TEMED.

7PT "width =" 62 "> 5

z (um)	U x ((τ / μ) um)
0	0.750
	0,394
1	0.237
1.5	0.164
2	0.124
2.5	0.100
3	0.083
3,5	0,071
4	0.062
4,5	0.056
0.050

Tabel 2. Forskydninger som en funktion af τ / μ svarende til dybden, z, af perler fra gelen overflade baseret på Boussinesq teori.

Discussion

Ved brug af denne teknik, er det vigtigt, at perleopløsning er korrekt fortyndet og perlerne er valgt baseret på den ønskede diameter, PA-gel substrat stivhed og størrelsen omfanget af de fænomener, der er undersøgt i den ønskede eksperiment.

Der bør udvises forsigtighed, når fortynding perlen opløsning før funktionalisering top dækglas. Afstanden mellem perler på gelen overflade kan ændres ved at ændre fortyndingsfaktoren af ​​kolloid opløsning. Fortynding af opløsningen for meget, vil reducere antallet af perler, der kobles til dækglasset og i sidste ende reducere antallet af perler i gelen. Fortynding af opløsningen for lidt kan give en for høj densitet af perler i gelen, således at de er i kontakt med og kan ikke skelnes fra hinanden. Selv om det ofte er umuligt helt at undgå tilstedeværelsen af ​​nanopartikel sammenlægning, anvendelse af ultralyd bølger til den fortyndede opløsning effektivt minimerer nanoparticle sammenlægning. Vi har fundet, at en 10.000 ganges fortynding af kolloidopløsning anvendes i denne protokol til en vulst koncentration på 3,64 x 10 ⁸ perler / ml og giver en ønskelig partikeldensitet på 0,05 perler / um ² til 0.1 um diameter perler. En 1: 20.000 fortynding (1,82 x 10 ⁸ perler / ml) giver et gennemsnit på 52 um ² pr partikel Figur 2 viser billeder af overfladen af geler med forskellige fortyndinger.. Det skal bemærkes, at der er variation i antallet af perler, der overfører til gelen. Dette skyldes, at variationen er forbundet med at fjerne perleopløsning fra dækglasset med trykluft under funktionalisering. I almindelighed har vi fundet, at forøgelse af fortyndingsfaktoren med mindst en faktor to konsekvent resulterer i mindst en fordobling af areal pr perlen.

Det er også vigtigt at vælge en perle størrelse (diameter), som vil resultere i fuld nedsænkning af than perle inde i gelen ved PA polymerisation. Gel stivhed påvirker placeringen af perlerne som vist i figur 5A. 0,1 um diameter perler, perlen dybde øges med aftagende stivhed. Dette kunne være et resultat af det omvendte forhold mellem porestørrelse og BB gel stivhed ^13. For alle de tre testede stivhed geler kuglerne konsekvent lokaliseret inde i gelen, og inden for 1 um af gelen overflade som vist i figur 8A. Den gennemsnitlige placering af en um perler i gelen varierer også med stivhed. De er indlejret dybere (ca. 1,25 um) i de 1 kPa geler. For 10 og 40 kPa geler, placeringen af toppen af en um diameter perler spænder fra cirka 0,5 um ovenfor til 0,5 um under gelen (figur 5) overflade, hvilket betyder, at perlerne undertiden rager gennem toppen af gelen (figur 8B). Det er skadeligt, fordi det introducerer topogragrafi for cellerne, og topografi er kendt for at påvirke celle-substrat-interaktioner ^14. Således er det nødvendigt at være opmærksom på at vælge perler for denne teknik, når forbereder geler af en specifik stivhed. Af de to perlestørrelser anvendes til at karakterisere denne metode, 0.1 um diameter, viser den optimale format. Andre perlestørrelser kan anvendes i denne teknik, men bør kalibreres ved hjælp af konfokal mikroskopi, som vi beskriver her, at forstå den nøjagtige dybde, i hvilken kuglerne er lokaliseret under gelpolymerisering.

Denne teknik forbedrer rumlig opløsning af perler i PA-gel ved at øge antallet af skelnelige partikler i synsfeltet. Lokalisering perlerne til et lag nær toppen af ​​gelen påvirker ikke signifikant den sammensatte stivhed af gelen. Isostress komposit teori anvendes til at beregne den sammensatte elasticitetsmodul E _c, kun 1 um tykt lag af gel indeholdende beads som

hvor E _f er elasticitetsmodulet af polystyrenperler (3 GPa), E _m er elasticitetsmodulet af gelmatrixen (10 kPa) og v _f og v _m er Volumenbrøkerne af perler og gelmatrix hhv. Da perlerne omfatte kun 0,03% af den mængde, E _c = 10,0025 kPa er ikke væsentligt anderledes end elasticitetsmodulet af en isotrop gel af stivhed 10 kPa. En etableret metode til fremstilling af PA geler reducerer polymerisationstiden til 30 sek, hvilket minimerer effekten af tyngdekraften på fordelingen af perler under polymerisation ^15. Vores metode bygger på den længere (~ 30 min) polymerisation tid for perlerne til at polymerisere i gelensåledes at de ikke rager geloverfladen. Fordi lokalisere perlerne til et enkelt lag påvirker ikke signifikant den sammensatte gel stivhed, og jo længere polymerisationstid hjælpemidler i overførslen af ​​perlerne i gelmatrixen, vi ikke indarbejde nogen foranstaltning til at reducere polymerisationstid i vores teknik.

Vor teknik viser, hvordan man lokalisere perlerne til en kendt dybde inde PA-gel, hvilket forbedrer målingen af ​​substrat deformation, og således beregningen celle trækkræfter. En teoretisk tilgang til kvantificere de cellulære trækkræfter har tidligere været rapporteret ^16,17. Denne tilgang behandler gelen substratet som en semi-uendelig faststof i elastik halvrum. Den Boussinesq opløsning anvendes til at løse det inverse problem med at beregne trækkræfterne fra et felt forskydning. Vi anvender en forenklet version af Boussinesq integreret kvantificere fejl i målingen forskydning på grund af perler distale fra gelen soverfladetransport ^18. Ligningen for forskydning i en given retning baseret på en påført forskydningsspænding, τ, over en given radius R, er givet ved

hvor u _x er forskydningen i x-retningen, μ er forskydningsmodul, og z er dybden af perlerne fra geloverfladen. Af forskellige placeringer af perler i hele dybden af gelen, er tilsvarende forskydninger vist i tabel 2.

I det tilfælde, der er vist her, er radius skønnes at være en gennemsnitlig fokal adhæsion størrelse på 1 um. Hvis der antages at være i samme plan som celler (z = 0) perlerne er forskydningen givet ved 0,75 τ / μ. Hvis perlerne er kun 1 um under geloverfladen er forskydningen givet ved 0,24 τ / μ. Detteudgør mere end en tredobbelt reduktion i forskydning fra en vulst koplanare med overfladen til et sted 1 um nedenfor. Dette indfører fejl i beregningen af ​​overfladevand trækkræfter baseret på bevægelse af indlejrede kugler, hvis præcise steder i gelen er ukendte. Variationen i trækkraft defineret ved τ / μ, som en funktion af dybden af perlerne i gelen for både foreslået og traditionelle fremstillingsmetoder er betydelig. Figur 9 viser fordelingen af kræfter (givet ved forholdet τ / μ) baseret på Boussinesq teori, der resulterer fra beregningen udnytte fordelingen af perle dybder, z, i den optiske dybdeskarphed, når perlerne er ensartet fordelt i gelen og lokaliseret nær overfladen. Den mest nøjagtige måling af celle kraft ville opstå, hvis perlerne var på samme plan som de celler, hvor z = 0 og τ / μ = 0,0133. I forhold til denne sag τ / μ stiger med 118%, 80% og 50% til 1 kPa, 10 kPa og 40 kPa geler, henholdsvis når perler er lokaliseret nær overfladen ved hjælp af den teknik, vi foreslår. Når perlerne er ensartet fordelt i hele gelen dybde, τ / μ øger yderligere 60%, 80% og 150% over stigningen induceret ved at lokalisere perler nær overfladen for 1 kPa, 10 kPa og 40 kPa geler hhv. Dette repræsenterer et samlet beløb på næsten 200% fejl i trækkraft beregninger, når perlerne er fordelt over hele gelen dybde. Således lokalisere perlerne til en kendt dybde inde i gelen forbedrer nøjagtigheden i forskydning målinger og celle trækkræfter.

Den her beskrevne teknik viser en ny måde at fremstille PA gel substrater til trækkraft mikroskopi applikationer sådanne, at perlerne er lokaliseret nær den gel-overfladen. Begrænser perlerne til en kendt dybde indenfor PA-gel giver nye oplysninger om den faktiske forskydning af perler upon celle kraftpåvirkning, skaber ammalm præcist billede af, hvordan cellerne deformerer deres underliggende substrat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023