Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

Published: September 16, 2014 doi: 10.3791/51873
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

טכניקות מסורתיות לבודת ג'ל polyacrylamide (PA) המכיל בדיקות ניאון כרוכות הרבדה ג'ל בין משטח חסיד ושקופיות זכוכית. כאן, אנו מראים כי ציפוי שקופית זו עם פולי-D-ליזין (PDL) ובדיקות ניאון מתאים את הבדיקות לבתוך 1.6 מיקרומטר ממשטח ג'ל.

Abstract

ג'לי הרשות הפלסטינית כבר מזמן משמש כפלטפורמה ללימודי כוחות מתיחת תא בשל הקלות של זיוף ואת היכולת לכוון תכונות האלסטיות שלהם. כאשר המצע מצופה בחלבון מטריצת החוץ תאי, תאים לדבוק בג'ל ולהחיל כוחות, גורמים לג'ל כדי לעוות. העיוות תלויה במתיחת התא ותכונות אלסטיות של ג'ל. אם שדה העיוות של פני השטח ידוע, מתיחת פני השטח יכולה להיות מחושבת באמצעות תיאורית הגמישות. עיוות ג'ל נמדדה בדרך כלל על ידי הטבעת חרוזים סמן פלואורסצנטי אחיד לתוך הג'ל. הבדיקות לעקור כג'ל מעווה. הבדיקות סמוך לפני השטח של ג'ל מתבצעות מעקב. ההתקות שדווחו על ידי בדיקות אלה נחשבות התקות משטח. מעמקיהם מפני השטח הם התעלמו. הנחה זו מציגה שגיאה בהערכות כוח המתיחה. למדידה מדויקת של כוחות התא, זה קריטי למיקומו של חרוזים להיות ידוע. פיתחנוטכניקה המשתמשת בכימיה פשוטה להגביל את חרוזים סמן פלואורסצנטי, 0.1 ו1 מיקרומטר בקוטר, בג'לים הרשות הפלסטינית, תוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. אנו מעיל coverslip עם פולי-D-ליזין (PDL) וחרוזי ניאון. פתרון ג'ל הרשות הפלסטינית הוא דחוק אז בין coverslip ומשטח חסיד. חרוזי הניאון להעביר לפתרון ג'ל במהלך ריפוי. לאחר פילמור, ג'ל הרשות הפלסטינית מכיל חרוזי ניאון בקרבת מטוס אל פני השטח ג'ל.

Introduction

האינטראקציה המכנית של תא חי עם הסביבה המקומית שלה בדרך כלל נחקרה באמצעות ג'לים הרשות הפלסטינית. מצעים אלה מסתמכים על פרוטוקול פשוט, מאופיין היטב שהוקם על ידי דמבו וואנג ב -1997 1. אחד היתרונות העיקריים של מצעים אלו הוא שהנוקשות שלהם עשויות להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוזים של רכיבים ספציפיים של פתרון ג'ל. זה מספק פלטפורמה רצויה ללמוד אינטראקציה של תאים עם סביבה של קשיחויות שונות. כאשר ג'לי הרשות מצופה במטריצה ​​תאית חלבונים (ECM), תאים לדבוק, יצירת כוח. כתוצאה מכוח התא, ג'ל מעווה כגוף אלסטי. עיוות זה תלויה בגודלו של הכח המופעל על ידי התאים ותכונות אלסטיות של ג'ל. מחקרים שונים מועסקים ג'לי הרשות הפלסטינית לחקור כוחות מתיחה סלולריים.

בוריאציה אחת של ייצור ג'ל הרשות הפלסטינית, microspheres ניאון (חרוזים) מוטבע throughout ג'ל לכמת כוחות מתיחת תא על ג'לים של קשיחויות שונות 2. במועד יישום כוח התא, חרוזים לעקור מהמיקום הראשוני שלהם בעקבות עיוות ג'ל. שדה העיוות נמדד מהתקות חרוז בודדות. שדה עיוות זה מנוצל עם תיאורית הגמישות ותכונות האלסטיות של ג'ל כדי לחשב את כוחות המתיחה. מדידות אלה מספקים תובנה לגבי הדרך בה התאים באופן מכאני לחוש וליצור אינטראקציה עם microenvironment המקומי שלהם 3.

בפרוטוקולים של הרשות הפלסטינית בשימוש נרחב הרבה ייצור ג'ל, חרוזים מתערבבים לאורך ג'ל הרשות הפלסטינית במצב הנוזלי, unpolymerized. ג'ל רשות polymerized מלא מכיל חרוזי ניאון לאורך כל הנפח שלה. בחישוב כוחות מתיחת תא, חרוזים ביותר בקרבת פני השטח ג'ל (ממשק תא מצע) נמצאים תחת פיקוח. ההתקות של חרוזים אלה הניחו להתרחש על פני השטח תרבית תאים לפשטות בcalculatio הכוחn. המיקום בפועל של חרוזים בתוך העומק של ג'ל התעלם. עם זאת, במדיום אלסטי (כגון ג'ל הרשות הפלסטינית), חרוז קרוב יותר לנקודה של הפעלת כוח יהיה להעביר יותר מחרוז שהוא רחוק יותר מהנקודה. לפיכך, טיפול בתזוזה של נקודה (במיקום חרוז) דיסטלי מפני שטח שכבתוצאות המשטח בהערכה נמוכה מדי של tractions הסלולרי. מידת השגיאה תלויה במרחק של חרוז מהמשטח. השגיאה לא ניתנת לביצוע ללא הידיעה של המיקום של חרוז.

הצורך בשיטה פשוטה להגביל את חרוזים מאוד קרובים לפני שטח תרבית תאים טופל על ידי כמה טכניקות. דרך אחת היא להגדיל את הצפיפות של חרוזים לאורך כל ג'ל כזה שיש מספר מספיק של חרוזים במישור המוקד העליון למדוד תנועה מאוד קרוב לפני השטח. טכניקה נוספת כרוכה בבניית חדר הדמיה confocal הדמיה תא חי, כך שהאור מרק חרוזים במטוס העליון ביותר מוקדי נאספו 4. שיטה אחרת כרוכה כיסתה שכבה דקה מאוד של ג'ל הרשות הפלסטינית המכיל חרוזים על גבי ג'ל polymerized כבר בלי חרוזים 5. חסרון של כל אחד מטכניקות אלה הוא כי המיקום המדויק של חרוזים בתוך הג'ל אינו ידוע. זה מציג שגיאה בחישוב של שדה התזוזה של חרוזים, ובכך החישוב של כוחות התא. טכניקה נוספת כרוכה נטיה של חרוזים למשטח העליון של ג'ל הרשות הפלסטינית כבר polymerized באמצעות Sulfo-SANPAH 6. טכניקה זו מבטיחה את חרוזים הם אכן רק על החלק העליון של ג'ל הרשות הפלסטינית, אך שבה הם משובצים בעומק של ג'ל המידה אינה ידועה. זה עלול ליצור טופוגרפיה מקומית לתאים, אשר יכול לשנות את התנהגות תא, כמו עבודות קודמות הציעו כי תאים יכולים לחוש כמה מיקרונים כוח משם 7. לאחרונה, טכניקה עבור דפוסי ג'לי הרשות הפלסטינית בקוטר 1 מיקרומטר fסמני נקודת פיברונקטין luorescent במערך מוסדר הוקם 8. במקרה זה, את העומק של סמני הניאון ידוע, והוא במהות אפס, כדפוס פיברונקטין מודפס בעקיפין על פני השטח ג'ל. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת סביבה מתמשכת שבו תאים יכולים לצרף, כחלבון ECM מוגבל ל1 מיקרומטר נקודות קוטר. שיטה לשילוב מלא של חרוזים גשש בתוך ג'לי הרשות הפלסטינית ורתק אותם למיקום ידוע מאוד קרובים לפני השטח עדיין לא הוקמה.

כאן, אנו מפתחים טכניקה להגבלה תת מיקרומטר לחרוזי ניאון קוטר מיקרומטר למישור מוקד מאוד קרוב לפני שטח תרבית תאים בתוך ג'ל הרשות הפלסטינית. ג'ל הוא נרפא בדרך כלל על ידי הרבדה פתרון ג'ל הנוזלי unpolymerized בין שני לוחות זכוכית. אחד מהלוחות הוא פונקציונליות, כך שג'ל חזק דבק בו. האחרים הוא unfunctionalized והוא הוסר לאחר ריפוי ג'ל. אנו לשנות זכוכית נשלפת זה surface על ידי ציפויה בשכבה של חרוזים. על הרבדה ג'ל הנוזלי בין פונקציונליות ומשטח זכוכית חרוז מצופה, העברת חרוזים לג'ל בזמן שהוא הריפוי. זה מגביל את המרחק של האינטגרציה "חרוזים לתוך הג'ל בתוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. הזכוכית תחתון מנות פטרי משמשות כמשטח חסיד שבג'ל הוא נרפא. כדי ליצור משטח ג'ל עליון שטוח במהלך פילמור, להחליק את מכסה זכוכית עגולה משמש לכריך ג'ל עם צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. לפני ייצור ג'ל, להחליק את מכסה זכוכית העליון מצופה בפולי-D-ליזין (PDL), מניב תשלום משטח חיובי. PDL הוא התפוצץ עם אוויר דחוס, ופתרון של חרוזים במים מופקד על המכסה מחליק. אנו מנצלים microbeads ניאון carboxylated, אשר נושא מטען שלילי, וליצור אינטראקציה עם משטח מטען החשמלי החיובי שנוצר על ידי טיפול עם PDL. לאחר פיצוץ פתרון חרוז את coverslip עם אוויר דחוס, שכבה יחידה שלחרוזים נשאר יחד אלקטרוסטטי ללהחליק את המכסה היבשה. ציפוי PDL אינו משפיע על הדביקות של הזכוכית על פני השטח ג'ל, כמו שקופיות הזכוכית אינן פגומות והוסר מג'ל הרשות הפלסטינית שלם באופן מלא.

צלחות פטרי הזכוכית תחתונה עשויות חסיד על ידי טיפול עם 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane וglutaraldehyde 0.5%. ג'לים של הרשות הפלסטינית קשיחויות הרצויות נוצרים על ידי ערבוב ריכוזים מתאימים של bisacrylamide וacrylamide באמצעות הליך סטנדרטי 9. טיפה של פתרון ג'ל היא pipetted על צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. להחליק את מכסה זכוכית המכילים חרוזים משמש לכריך ג'ל עם צלחת פטרי. כאשר ג'ל הוא נרפא, להחליק את המכסה העליון הוסר עוזב את חרוזים משובצים בג'ל הרשות הפלסטינית בתוך 1.6 מיקרומטר מהמשטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בודה וfunctionalizing ג'לי הרשות הפלסטינית בדרגות שונות של stiffnesses עם microspheres הניאון המוטבע קרוב לפני שטח תרבית תאים.

.1 Functionalizing החלקות המכסה העליון הזכוכית

  1. התלושים נקיים כיסוי זכוכית (# 1.0, קוטר מ"מ 12.) עם מים וסבון, ואחריו אתנול כדי להסיר אבק זר.
  2. כיסוי זכוכית מקום מחליק על משטח מגורד (כלומר בעל קצה פיפטה) באופן שהם לא נוגעים כדי להקל על קלות של אינטראקציה עם coverslips.
  3. מעיל כל פני השטח של תלושי לכסות עם פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל) במשך שעה 1 (איור 1 א).
  4. במהלך הזמן הזה, לבצע דילול 1: 10,000 מפתרון קולואיד של 0.1 מיקרומטר קוטר, microspheres ניאון אדום עם deionized מים (DI) כדי להשיג צפיפות חלקיקים של כ microsphere 1 לכל 20 מיקרומטר 2 על פני השטח ג'ל. ראה איור 2 לתוצאות של דילולים שונים. dilutio זהn יכול להיות שונה כדי לענות על הצורך של ניסויים ספציפיים.
  5. מניחים את הפתרון המדולל באמבט מים קולי ל30 דקות.
  6. אחרי שעה 1, להשתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות כל פיסת כיסוי ומכה יבשה עם אוויר. החזר את המכסה מחליק היבשה על פני השטח צהובה מגוררת.
  7. הסר את פתרון קולואיד המדולל מהאמבטיה ופיפטה 150 μl קולי על גבי כל אחד להחליק את המכסה. השאר למשך 10 דקות (איור 1).
  8. להשתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות כל פיסת כיסוי ומכה יבשה עם אוויר. החזר את הכיסוי היבש מחליק על פני השטח והחנות מגורדים בחושך עד מוכן לשימוש.

.2 הכנת הרשות ג'ל ישירות על צלחות פטרי זכוכית תחתונה

  1. פלטה חשמלית מחממים 100 C °.
  2. להוציא את המספר הרצוי של צלחות פטרי זכוכית תחתונה (מנה מ"מ 35 עם 14 מ"מ מיקרו היטב, # 1.0) על משטח שטוח במנדף הכימי.
  3. כסה את חלק הזכוכית של כל מיקרו גם צלחת פטרי עם 97% 3-aminopropyl-trimethoxysליאן (3-APTES) במשך 7 דקות להפעלה כימית. קח זהירות כדי למנוע טפטוף מכוון של 3-APTES אל פני השטח של הפלסטיק בצלחת פטרי, כדי למנוע השפלה של הקלקר.
  4. לאחר 7 דקות, למלא את צלחת פטרי עם מים די ולהשליך לתוך מיכל פסולת.
  5. חזור על שלב 2.4 3x עבור כל מנה, ולאחר מכן ללחוץ את צלחת פטרי כדי להסיר מים נוספים. מניחים את צלחות פטרי על הצלחת החמה עד חלק הזכוכית הוא יבש.
  6. הסר את צלחות פטרי מהצלחת החמה ולחזור למשטח שטוח במנדף כימי.
  7. במנדף הכימי, להפוך את הפתרון של 0.5 glutaraldehyde% ולכסות את חלק הזכוכית של כל צלחת פטרי היטב עם הפתרון ל30 דקות. קח זהירות כדי למנוע טפטוף מכוון של glutaraldehyde אל פני השטח של הפלסטיק בצלחת פטרי, כדי למנוע השפלה של הפלסטיק.
  8. לאחר 30 דקות, למלא את צלחת פטרי עם מים די ולהשליך לתוך מיכל הפסולת לשטוף ולהסיר את glutaraldehyde.
  9. חזור על שלב 2.4 3x עבור כל מנה, ולאחר מכן ללחוץ את צלחת פטרי כדי להסיר מים נוספים. מניחים את צלחות פטרי על הצלחת החמה עד חלק הזכוכית הוא יבש.
  10. לפני ערבוב הרכיבים של פתרון ג'ל הרשות הפלסטינית, להעביר שקופיות הזכוכית פונקציונליות למנדף הכימי כך שהם נגישים בקלות, ומאפשר לרבדה מהירה של הג'ל עם תחתית זכוכית צלחות פטרי לאחר ערבוב פתרון ג'ל.
  11. בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל, לערבב bisacrylamide 40%, 2% acrylamide, וחומצה אקרילית ברציפות מיידית בריכוזים המפורטים בטבלה 1 (מותאם מפרוטוקול שפורסם 10) כדי להשיג את גמישות המטריצה ​​הרצויה.
  12. הוסף 100 HEPES מ"מ, 10% persulfate אמוניום, וTEMED בכמויות מפורטות בטבלה 1 המקביל לגמישות מטריצה ​​רצויה כדי להשלים את פתרון ג'ל.
  13. מייד פיפטה 15 μl של פתרון ג'ל על גבי במרכז חלק הזכוכיתשל צלחות פטרי.
  14. מייד להרים לכסות להחליק זכוכית פונקציונליות עם פינצטה.
    1. הפוך את כיסוי הזכוכית להחליק על כך שחרוזי הניאון נמצאים בקשר צד עשייה עם פתרון ג'ל.
    2. הנח להחליק את המכסה בעדינות על גבי ג'ל הרשות הפלסטינית כעת הנוזלי כך שהצד פונקציונליות הוא במגע עם ג'ל (איור 1 ג). הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אדם שני מומלץ לתפקיד של הוספה להחליק את המכסה על מנת למנוע אפשרות של פילמור החלקי תוך pipetting פתרון ג'ל רשות נוזלי על גבי צלחות פטרי מרובות.
  15. פליפ כל צלחות פטרי על מנת לסייע במניעת השפעות כוח הכבידה על חלקיקי ניאון polymerizing לרמות נמוכות יותר של ג'ל הרשות הפלסטינית.
  16. לחכות לפחות 35 דקות, או עד שפתרון המניות של ג'ל הרשות polymerized בעליל בצינור צנטריפוגות.
  17. הפוך את צלחות פטרי בחזרה שוב ולמלא אותם עם PBS על מנת לסייע בהסרה להחליק את המכסה.
  18. להפוך בזהירות במגע עם חלק הזכוכית של צלחת פטרי ואת קווי המתאר של להחליק את המכסה, באמצעות פינצטה כדי לגרד את ההיקף להחליק את המכסה. לבצע כמה מחזורים עד להחליק את המכסה נעקר ממקומה. הסר להחליק את המכסה ולהיפטר במכל פסולת החדה נכון.
  19. לאחר הסרת כל המכסה מחליק, חרוזי ניאון יהיו העבירו לג'ל (1D איור). כסה ג'לי הרשות הפלסטינית עם לחלוטין PBS, למקם את המכסה צלחת פטרי על כל מנה, ולאחסן ב 4 ° C.

.3 Functionalizing ג'ל הרשות הפלסטינית עם פיברונקטין

  1. הכן את הפתרונות מעורבבים מראש הבאים כפי שתואר בפרוטוקול הוקם 11: משרים פתרון (137 mM NaCl, 5% (v / v) גליצרול) וחיץ 2x נטיה (0.2 M 2 (-morpholino N) חומצת ethanesulfonic (MES), 10 גליצרול% (v / v), pH 4.5).
  2. השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את כל PBS מהזכוכית תחתונה המנות המכילות ג'ל הרשות הפלסטינית.
  3. Pipette לספוג פתרון על כל ג'ל כזה שג'ל הוא שקוע לחלוטין. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1.
  4. -3-1 אתיל [3 dimethylaminopropyl-] carbodiimide hydrochloride החם (EDC) ו-hydroxysulfosuccinimide N (NHS) לטמפרטורת חדר.
  5. מערבבים 10x פתרונות של EDC (150 מ"מ, 19 מ"ג / מ"ל ​​במי DI) ושירותי בריאות (250 מ"מ, 29 מ"ג / מ"ל ​​במי DI).
  6. מערבבים חלק 1 10x EDC, חלק 1 10x NHS, 3 חלקי מים די, ו -5 חלקים 2x חיץ הצמידה.
  7. השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את הפתרון לספוג. ודא שכל הנוזלים הוא להסיר את פני השטח ג'ל.
  8. הוסף פתרון NHS / EDC מספיק כדי לכסות את פני השטח ג'ל ולמלא גם הזכוכית התחתונה של צלחת פטרי (150-250 μl). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות בחושך.
  9. פיברונקטין הפשרה בטמפרטורת חדר. מופשר פעם, לערבב מים די סטרילי כדי ליצור / פתרון פיברונקטין מ"ל 50 מיקרוגרם.
  10. השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את solu NHS / EDCtion. ודא שכל הנוזלים הוא להסיר את פני השטח ג'ל.
  11. הוסף 150 μl של פתרון פיברונקטין לכל ג'ל. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 35 דקות, כדי לאפשר התקשרות של פיברונקטין.
  12. לאחר 35 דקות, להוסיף PBS על כל צלחת פטרי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.

.4 ניסויי גרירה חיל

  1. תקשורת חמה תא, PBS, וטריפסין ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. יש לשטוף את ג'לי 5x עם PBS סטרילי, aspirating PBS בין שטיפות, ולהשאיר מכוסה בברדס.
  3. הוסף 1 מ"ל טריפסין ל25 2 סנטימטר לתאי בקבוק המכיל. לאחר התאים הרימו מבקבוק, לדלל את טריפסין עם תקשורת סלולארי ולספור את התאים. בהתבסס על שטח פן ג'ל, לקבוע את מספרם של התאים הנדרשים לג'ל לצפיפות זריעת תא סופית של 3,000 תאים / 2 סנטימטר. לדלל או לרכז את ההשעיה באופן ש150 μl של תערובת תאי התקשורת מכילה מספר זה של תאים. 150 μl Aliquot של suspens התאיון בזה לזה ג'ל.
  4. מניחים את צלחות פטרי המכילות תאים באינקובטור במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר בזהירות את צלחות פטרי ולמלא את שאר צלחת פטרי עם תקשורת (כ 2 מ"ל) באופן שעל פני השטח של הצלחת הוא שקועים לחלוטין.
  5. מניחים את צלחות פטרי בחזרה בחממה עד לרכישת תמונה.
  6. הכן את מערכת רכישת מיקרוסקופ ונתונים להדמיה: הכנס את מטרת טבילת 40x מים, להכניס פריזמה התערבות הפרש לעומת זאת (DIC), בחר בmCherry או מסנן ניאון שווה ערך, ולהפעיל את התא הסביבתי.
  7. כאשר התכוננו להדמיה, להסיר אחד צלחת פטרי מהחממה ולמקם אותו בעדינות על הבמה מיקרוסקופ. הסר את המכסה צלחת פטרי להדמית דסק"ש.
  8. אתר תא בודד וללכוד תמונת סטילס יחידה של התא בדסק"ש.
  9. מבלי להזיז את הבמה מיקרוסקופ, לעבור את מצב ההדמיה כדי הקרינה. להתמקד בmicrospheres וrec הניאוןORD תמונה של microspheres.
  10. מוציא בזהירות תקשורת סלולארי מצלחת פטרי עם טפטפת ולהוסיף 0.05% טריפסין-EDTA.
  11. תמונה המיקרוסקופית מתחת לתא לאחר שהתאים מנותקים.
  12. velocimetry תמונת ניתוח חלקיקי שימוש (PIV) ב12 ImageJ כדי לחשב את שדה העקירה בשל כוחות סלולריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההדמיה confocal שימשה כדי לקבוע שהחרוזים אכן היו מתחת לפני שטח ג'ל ולכמת את מיקומם המדויק בתוך עומק ג'ל. חרוזי ניאון של אורך גל שונה מאלה שבתוך הג'ל הורשו להתיישב על פני השטח, ואת המרחק בין חלקיקי ניאון המשובצים ואלה על פני השטח היה מחושב באמצעות אלגוריתם זיהוי centroid. המיקום של חרוז על פני השטח ג'ל משמש כנקודת התייחסות למשטח העליון של תאים להפעיל כוח על דבקות אל פני השטח שבו ג'ל. סכמטי של שני התרחישים נחשבים (חרוזים ירוקים בג'ל עם חרוזים אדומים על פני השטח, ולהיפך) מוצג באיור 3. אלגוריתם אינטרפולציה z-הגובה של המיקום תלת ממדי centroid. חזרנו על התהליך הזה במשך שלושה ג'לים נוקשות (1, 10, ו40 kPa) ושני חרוזים גודל (קוטר) ניאון (0.1 מיקרומטר אדום ו1 מיקרומטר צהוב ירוק). המרחקבין חרוז בתוך הג'ל והשכן של אורך גל שונה הקרוב ביותר שלו נקבע על פי centroid תלת ממדי שלה. איור 4 מציג את ההתפלגות המרחבית של חרוזים (על פני השטח העליונים ומשובצים) והנוף המוקרן על מטוס YZ. האחרון מספק מעמקי את כל החרוזים מפני שטח של ג'ל.

העומק הממוצע של 0.1 מיקרומטר חרוזים הוא 619 ננומטר, 467 ננומטר, 278 ננומטר לג'לי הרשות הפלסטינית של קשיחות 1, 10, ו40 kPa, בהתאמה (איור 5 א). העומקים המתאימים ל1 מיקרומטר חרוזים קוטר הם -20 ננומטר ב40 ג'לי kPa, 12 ננומטר ב10 ג'לי kPa, ו1,255 ננומטר ב1 ג'לי kPa (איור 5). ההדמיה confocal גם ביצעה על ג'לי עם חרוזים המפוזרים בג'ל כפי שכבר משמש באופן מסורתי לג'לי הרשות הפלסטינית המיועדים למחקרים במיקרוסקופ כוח המתיחה. העומק של חרוזים המפוזרים בג'ל הרשות נמדד תוך שימוש באותו האלגוריתם שתואר קודם לכן, והוא לעומת דepths באמצעות הטכניקה אנו מציגים כאן. איור 6 ממחיש את השונות של פיזור חרוז בתוך העומק של ג'ל הרשות הפלסטינית תוך שימוש בשיטות ייצור מסורתיות.

Fibroblasts לצרף אל פני השטח ג'ל הרשות הפלסטינית כאשר פונקציונליות עם פיברונקטין. שדה העקירה לתא פיברובלסטים ושכבת חרוזי ניאון המקביל מוצג באיור 7. חרוזים ליד הפריפריה של התמונה מופיעים קצת מחוץ לפוקוס. זה לא פגם מכאני בחלק מג'ל, כמו הזכוכית נותרה בשלמותה באופן מלא עם ההסרה מג'ל. במקום זאת, היא התוצאה של אפקט אופטי בשל מטרת הטבילה במים המשמשת בניסוי זה. עם התוספת של טריפסין למדיום, התא משתחרר מהמשטח, וכתוצאה מכך התשואה של משטח ג'ל הרשות הפלסטינית המעוות למצבו המקורי. אלגוריתם מתאם צולב נוצל כדי לחשב את שדה העיוות מבוסס על התקות חרוז 10.תזוזת המפה ממחישה קיטוב דומיננטי של כוחות מתיחת התא בy-הכיוון.

איור 1
איור 1 איור של תהליך functionalization לכיסוי זכוכית עליון מחליק עם PDL וחרוזי ניאון. התלושים () כיסוי זכוכית (כחול) מודגרת עם 0.1 מ"ג / מ"ל PDL (כתום) במשך שעה 1. אוויר דחוס משמש לפוצץ תלושי לכסות יבש ולהסיר את PDL. התלושים לכסות זכוכית (הבוקר) הודגרו עם פתרון של חרוזי ניאון 100 קוטר ננומטר ל5-10 דקות, ולאחר מכן הוסרו על ידי יישום אוויר דחוס. שכבה אחת של חרוזים נשארה יחד אלקטרוסטטי לcoverslip. (C) coverslips פונקציונליות עם חרוזים משמשים לג'ל רשות כריך עם משטח זכוכית הופעל. (ד ') לאחר ההסרה של להחליק את המכסה העליון הבאה polymerizat ג'ל הרשות הפלסטיניתיון, חרוזים נמצאים בתוך וקרובים מאוד לפני השטח של ג'ל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור Surface 2 הרשות ג'ל המכיל 0.1 מיקרומטר קוטר חרוזי ניאון. לפני הציפוי להחליק לכסות זכוכית העליונה שטופל PDL עם חרוזים, פתרון חרוז היה מדולל () 10,000 קיפול (3.64 x 10 8 חרוזים / ml) ו (ב) 20,000 קיפול (1.82 x 10 8 חרוזים / ml). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 ממשק איור 3 Cell-מצע עם חרוזים המקומיים סמוך לפני השטח של ג'ל. סכמטי של שני תרחישים שבהם מיקום חרוז בתוך ג'ל הרשות הפלסטינית היה לכמת באמצעות מיקרוסקופיה confocal ואלגוריתם זיהוי centroid. התרחיש הראשון מוצג ב() 100 חרוזים בקוטר ננומטר אדומים בתוך הג'ל וחרוזים בקוטר ירוק 1 מיקרומטר על פני השטח, והשנייה בחרוזים (B) ירוקים 1 מיקרומטר בקוטר בתוך הג'ל ו100 חרוזים בקוטר ננומטר אדומים על פני השטח. (C) איור קריקטורה של תא (צהוב) דבק ג'ל (כחול) עם חרוזים אדומים המקומיים בתוך הג'ל ליד פני השטח שלו וחרוז ירוק יושב על פני השטח שלו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4
YZ איור 4 פרוסת Confocal (XY, מרכז) וליווי (משמאל) צפיות בהקרנה של ג'ל עם 0.1 מיקרומטר חרוזים אדומים משובצים בג'ל ו1 מיקרומטר חרוזים על פני השטח. יחידות לכל הצירים נמצאים בננומטרים. מופעים מזדמנים של חרוזים אדומים מעל או באותו המישור כמו חרוזים ירוקים מיוחסים לחפיפה קלה בספקטרום פליטת הקרינה לאדום (mCherry) וירוק (GFP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5 היסטוגרמות של העומק של חרוזים מרותקים ליד המשטח העליון של ג'ל הרשות הפלסטינית. Stiffnesses 1 kPa, 10 kPa, ו40kPa מיוצג על ידי כחול, ושחור אדומים, בהתאמה. עקומת גאוס הייתה להתאים לכל הנתונים שנקבעו וx-הערך המתאים למשרעת שלה מתפרש כעומק הממוצע של חרוזים. שני תרחישים נבדקו:. () 0.1 מיקרומטר חרוזים בתוך הג'ל עם 1 מיקרומטר חרוזים על פני השטח, ו (ב) 1 מיקרומטר חרוזים בתוך הג'ל עם 0.1 מיקרומטר חרוזים על פני השטח אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 6
איור 6 היסטוגרמות של העומק של חרוזים המשובצים באופן שרירותי ברחבי ג'ל הרשות הפלסטינית באמצעות שיטת ייצור מסורתית (שחורה) וחרוזים מקומיים ליד השכבה העליונה של ג'ל הרשות הפלסטינית באמצעות טכניקה זו (אדום) לג'לי הרשות הפלסטינית של קשיחות) 1 kPa, B) 10 kPa, וC) 40 kPa. הבלעה מראה את העומק של חרוזים בשני סוגי ג'ל בתוך 10 העליונים ביותר מיקרומטר של ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור שדה .7 עקירה בשל מתיחת תא. תמונת שלב () הניגודיות של פיברובלסטים ב10 ג'ל kPa. שדה עקירה שנוצר על ידי מתיחה שנוצרה על ידי פיברובלסטים (B). בר צבע מציין תזוזת חרוז בננומטרים. (C) פלואורסצנטי תמונה של 0.1 מיקרומטר חרוזים קוטר מתחת תא לפני trypsinization. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 8
איור איור 8 של מיקום הממוצע של חרוזים בתוך יחסי ג'ל לחרוז גודל / אורך גל שונה יושב על משטח ג'ל. הנוקשות של ירידות ג'ל הרשות הפלסטינית משמאל לימין (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). () 0.1 מיקרומטר חרוזים אדומים קוטר פנימי ג'ל וחרוזים בקוטר ירוק 1 מיקרומטר על פני השטח. (B) חרוזים קוטר ירוקים 1 מיקרומטר בתוך הג'ל ו0.1 מיקרומטר חרוזים קוטר אדומים על פני השטח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 9
איור 9 Distribution של ערכים התיאורטי לτ / μ מבוסס על מעמקי חרוז שונים. חרוזים 0.1 מיקרומטר בקוטר היו או מפוזרים או מקומי קרוב לפני השטח ב() 1 ג 'לים kPa, 10 ג'לי kPa (B), ו40 ג'לי kPa (C) באופן אחיד . חץ הזהב מציין את הערך של τ / μ לz = 0 המקרה, שבו חרוזים הם על פני השטח ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

115px; "> 4,122.5 1px; "> 500
E (kPa) 40% Acrylamide (μl) BIS (ריכוז) 2% BIS (μl) 100 HEPES מ"מ (μl) 0.1 625 .00009 22.5 4225
0.25 625 0.0001 25 4,222.5
0.5 625 .00011 27.5 4220
0.75 > 625 0.0002 50 4,197.5
1 625 0.0003 75 4,172.5
1.5 625 0.0004 100 4,147.5
2 625 0.0005 125
2.5 625 0.0006 150 4,097.5
3 625 0.0008 200 4,047.5
3.5 625 0.0009 225 4,022.5
4 0.001 250 3,997.5
4.5 625 0.0012 300 3,947.5
5 625 0.0014 350 3,897.5
5.5 625 0.0016 400
6 625 0.0018 450 3,797.5
6.5 625 0.002 500 3,747.5
7 625 0.0022 550 3,697.5
7.5 < / Td> 625 0.0024 600 3,647.5
8 1,000 0.001 250 3,622.5
10 1,000 0.0013 325 3,547.5
15 1,000 0.002 3,372.5
20 1,000 0.0027 675 3,197.5
30 1,000 .0037 925 2,947.5
40 1,000 .0048 1,200 2,672.5

שולחן.1 ריכוזי רשות ג'ל כימיים המבוססים על מודול יאנג. למודולוס אלסטיות ג'ל הרשות הפלסטינית רצוי, הריכוזים הרשומים של acrylamide, bisacrylamide, וחיץ HEPES צריכים להיות בתוספת חומצה אקרילית 5 μl, 25 μl 10% persulfate אמוניום (APS), ו 2.5 μl TEMED.

"Width =" 7pt 62 "> 5
z (מיקרומטר) u x ((τ / μ) מיקרומטר)
0 0.750
0.394
1 0.237
1.5 0.164
2 0.124
2.5 0.100
3 0.083
3.5 0.071
4 0.062
4.5 0.056
0.050

לוח 2: התקות כפונקציה של τ / μ המתאים לעומק, z, חרוזים ממשטח ג'ל המבוסס על תיאורית Boussinesq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעת שימוש בטכניקה זו, הוא חיוני, כי פתרון חרוז מדולל כראוי והחרוזים נבחרים על בסיס קוטר רצוי, נוקשות הרשות הפלסטינית מצע ג'ל, והגודל בקנה המידה של התופעות שנחקרו בניסוי הרצוי.

יש לנקוט זהירות בעת דילול פתרון חרוז לפני functionalizing תלושי כיסוי זכוכית עליון. המרווח בין חרוזים על פני השטח ג'ל ניתן לשנות על ידי שינוי הגורם לדילול של פתרון קולואיד. דילול הפתרון יותר מדי יפחית את מספר חרוזים שבני זוג להחליק את המכסה וסופו של דבר לצמצם את מספר חרוזים בג'ל. דילול הפתרון מעט מדי יכול להניב גבוהה מדי צפיפות של חרוזים בג'ל כזה שהם נמצאים בקשר ולא ניתן להבחין בין זה לזה. בזמן שהוא לעתים קרובות בלתי אפשרי, כדי למנוע את נוכחותם של צבירת חלקיק לחלוטין, היישום של גלים קוליים לפתרון המדולל ביעילות ממזער נאןצבירת oparticle. מצאנו כי דילול של פי 10,000 מפתרון קולואיד מנוצל בפרוטוקול זה נותן ריכוז חרוז של 3.64 x 10 8 מ"ל / חרוזים, ומניב צפיפות חלקיקים רצויה של 0.05 חרוזים / מיקרומטר 2 ל0.1 מיקרומטר חרוזים קוטר. 1: דילול 20,000 (1.82 x 10 8 חרוזים / ml) מניב בממוצע 52 מיקרומטר 2 לחלקיקי איור 2 מראה תמונות של פני השטח של ג'לי עם דילולים שונים.. יש לציין כי קיים שונות במספר חרוזים שיעבירו לג'ל. זאת בשל ההשתנות הקשורות להסרת פתרון חרוז מהכיסוי להחליק עם אוויר דחוס במהלך functionalization. באופן כללי, מצאנו כי הגדלת גורם לדילול של לפחות פי שתיים תוצאות באופן עקבי בלפחות עלייה כפולה באזור לחרוז.

זה גם קריטי לבחירת גודל חרוז (קוטר) שיגרום לטבילה מלאה של tהוא חרוז בתוך הג'ל על פילמור הרשות הפלסטינית. ג'ל נוקשות משפיעה על המיקום של חרוזים, כפי שמוצג באיור 5 א. ל0.1 מיקרומטר חרוזים קוטר, עומק חרוז עולה עם ירידה בנוקשות. זה יכול להיות תוצאה של היחס ההפוך בין גודל הנקבובית והרשות הפלסטינית ג'ל נוקשות 13. לכל אחת משלושת ג'לים הנוקשות נבדקו, החרוזים מקומיים באופן עקבי בתוך ג'ל, ובתוך 1 מיקרומטר של משטח ג'ל כפי שמודגמים באיור 8 א. המיקום של 1 מיקרומטר חרוזים הממוצע בתוך הג'ל גם משתנה עם נוקשות. הם טבועים (כ 1.25 מיקרומטר) עמוק יותר לתוך ג'לי kPa 1. ל10 ו40 ג'לי kPa, המיקום של החלק העליון של 1 מיקרומטר חרוזים קוטר נע בין כ 0.5 מיקרומטר מעל ל0.5 מיקרומטר מתחת לג'ל (איור 5) משטח, מה שאומר שהחרוזים בולטים מדי פעם דרך החלק העליון של ג'ל (איור 8B). זה מזיק משום שהיא מציגה topograPHY לתאים, וטופוגרפיה ידועה להשפיע אינטראקציות תא מצע 14. לפיכך, יש צורך להיות מודע לבחירת חרוזים לטכניקה זו בעת הכנת ג'לים של קשיחות מסוימת. של שני גדלי חרוז מנוצלים כדי לאפיין בשיטה זו, 0.1 מיקרומטר קוטר מוכיח את הגודל האופטימלי. גדלי חרוז אחרים עשויים להיות מנוצלים בעם טכניקה זו, אך יש לכייל באמצעות מיקרוסקופ confocal כפי שאנו מתארים כאן, כדי להבין את העומק המדויק שאליו החרוזים מקומיים במהלך פילמור ג'ל.

טכניקה זו משפרת את הרזולוציה מרחבית של חרוזים בג'ל הרשות הפלסטינית על ידי הגדלת מספרם של החלקיקים להבחין בתוך שדה הראייה. לוקליזציה חרוזים לשכבה קרובה לקצה העליון של הג'ל אינו משפיעה באופן משמעותי את הנוקשות המורכבות של ג'ל. התאוריה מרוכבים Isostress מנוצלת כדי לחשב את מודולוס אלסטיות מרוכבים, E ג, של השכבה 1 מיקרומטר בעובי רק של ביה ג'ל המכילds כ

משוואת 1

שבו f E היא מודול אלסטי של חרוזי פוליסטירן (3 GPA), מ 'E הוא מודול אלסטי של מטריצת ג'ל (10 kPa), וf v ומ' נ 'הן שברי הנפח של חרוזים ומטריצת ג'ל, בהתאמה. בגלל חרוזים מהווים רק 0.03% מהנפח, E ג = 10.0025 kPa הוא לא שונה באופן משמעותי ממודולוס האלסטיות של ג'ל איזוטרופיים של קשיחות 10 kPa. שיטה הוקמה עבור בודה ג'לי הרשות מפחיתה את זמן פילמור ל30 שניות, וכך לצמצם את ההשפעה של כוח הכבידה על חלוקת חרוזים במהלך פילמור 15. השיטה שלנו מסתמכת על זמן פילמור (~ 30 דקות) הארוך יותר לחרוזים לפלמר לתוך הג'לכזה שהם לא יבלטו משטח ג'ל. בגלל לוקליזציה חרוזים לשכבה אחת אינו משפיעה על הנוקשות מרוכבים ג'ל, ועזרי זמן פילמור יותר בהעברת חרוזים לתוך מטריצת ג'ל באופן משמעותי, אנחנו לא לשלב כל אמצעי כדי להפחית את זמן פילמור בטכניקה שלנו.

הטכניקה שלנו מדגימה כיצד למקם את חרוזים לעומק ידוע בתוך ג'ל הרשות הפלסטינית, אשר משפר את המדידה לעיוות מצע, ובכך החישוב של כוחות מתיחת תא. גישה תיאורטית לכמת את כוחות המתיחה הסלולריים כבר דווחה בעבר 16,17. גישה זו מתייחסת למצע ג'ל כחצי אינסופי מוצק בשטח חצי אלסטי. פתרון Boussinesq משמש כדי לפתור את הבעיה ההפוכה של חישוב כוחות מתיחה משדה עקירה. אנו מעסיקים גרסה מפושטת של Boussinesq נפרד לכמת את השגיאה במדידת תזוזה בשל חרוזים דיסטלי משל ג'לurface 18. המשוואה לעקירה בכיוון מסוים המבוסס על מאמץ גזירה מיושם, τ, ברדיוס נתון, R, ניתנת על ידי

משוואה 2

כאשר x u הוא העקירה בכיוון x, μ הוא מודול הגזירה, וz הוא העומק של חרוזים ממשטח ג'ל. למקומות שונים של חרוזים בכל העומק של ג'ל, התקות מקבילה מוצגות בטבלה 2.

למקרה שמוצג כאן, הרדיוס מוערך גודל הידבקות מוקד ממוצע של 1 מיקרומטר. אם חרוזים יש להניח כי באותו מישור עם התאים (z = 0), העקירה ניתנת על ידי 0.75 τ / μ. אם חרוזים הם רק 1 מיקרומטר מתחת לפני שטח ג'ל, העקירה ניתנת על ידי 0.24 τ / μ. זהמייצג יותר מאשר הפחתה של פי שלוש בעקירה מcoplanar חרוז עם המשטח למיקום 1 מיקרומטר להלן. זה מציג שגיאה בחישוב של כוחות מתיחת משטח המבוססים על התנועה של חרוזים משובצים מקומות בתוך ג'ל שמדויק אינם ידועים. הווריאציה במתיחה שהוגדרה על ידי τ / μ, כפונקציה של העומק של חרוזים בג'ל לשתי שיטות ייצור המוצעות ומסורתיות היא משמעותית. איור 9 מציג את התפלגות הכוחות (שניתנה על ידי τ היחס μ /) המבוסס בתיאורית Boussinesq הנובעים מחישוב ניצול ההפצה של מעמקי חרוז, z, בתוך העומק האופטי של שדה כאשר חרוזים מפוזרים באופן אחיד בג'ל ומקומי קרובים לפני השטח. המדידה מדויקת ביותר של כוח התא תביא אם חרוזים היו באותו המישור של התאים, שבו z = 0 וτ / μ = .0133. בהשוואה למקרה, τ / μ עליות זו על ידי 118%, 80%, ו50% ל1 kPa, 10 kPa, ו40 ג'לי kPa, בהתאמה, כאשר חרוזים מקומיים קרוב לפני השטח תוך שימוש בטכניקה שאנו מציעים. כאשר חרוזים מפוזרים באופן אחיד בכל רחבי עומק ג'ל, τ / μ מגביר 60% נוספים, 80%, ו150% מעבר לעלייה הנגרמת על ידי איתור חרוזים קרובים לפני השטח, ל1 kPa, 10 kPa, ו40 ג'לי kPa, בהתאמה. זה מייצג בסך הכל שגיאה כמעט 200% בחישובי מתיחה כאשר חרוזים מופצים ברחבי עומק ג'ל. לפיכך, איתור חרוזים לעומק ידוע בתוך הג'ל משפר את הדיוק במדידות עקירה וכוחות מתיחת תא.

הטכניקה המתוארת כאן מציגה דרך חדשה להכנת מצעי ג'ל הרשות הפלסטינית עבור יישומי כוח המתיחה מיקרוסקופי כך שהחרוזים הם מקומיים קרובים לפני שטח ג'ל. כליאת חרוזים לעומק ידוע בתוך ג'ל הרשות הפלסטינית מספקת מידע חדש על העקירה בפועל של חרוזים על יישום כוח התא, יצירת בבוקרבצר תמונה מדויקת של איך תאי עיוות המצע הבסיסי שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות תכנית היוזמה הבינתחומי החדשנות, אוניברסיטת אילינוי, להעניק 12035. SK מומן בUIUC מהקרן הלאומית למדע גרנט (NSF) 0,965,918 IGERT: הכשרת הדור הבא של חוקרים בניידים ומכניקה מולקולרית וBioNanotechnology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) Sigma-Aldrich 281778
70% Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 111-30-8
1 M HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
40% Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
2% Bisacrylamide Sigma-Aldrich M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) Invitrogen F8801
Fibronectin, Human, 1 mg BD Biosciences 354008
Ammonium persulfate Bio-RAD 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-RAD 161-0801
Poly-D-lysine Millipore A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)  Thermo Scientific 22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) Thermo Scientific 24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Life Technologies 25300-054
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Acrylic acid  Sigma-Aldrich 147230
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass In Vitro Scientific D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam. Ted Pella, Inc. 26023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  3. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
  4. Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
  5. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  6. Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
  7. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
  8. Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
  10. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16 (2010).
  11. Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
  12. Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  13. Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
  14. Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
  15. Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
  16. Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
  17. Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
  18. Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).

Tags

הנדסת ביוטכנולוגיה גיליון 91 מכניקת תא polyacrylamide ג'ל (הרשות הפלסטינית) כוח המתיחה מיקרוסקופי חרוזי ניאון פולי-D-ליזין (PDL) משטח תרבית תאים
שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M.… More

Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51873, doi:10.3791/51873 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter