Summary
Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir.
Abstract
Pensilvanya jeller uzun imalat ve nağme elastik özelliklerini yeteneği kolaylığı nedeniyle hücre çekiş kuvvetleri incelemek için bir platform olarak kullanılmıştır. Alt-tabaka, bir hücre dışı matris proteini ile kaplanmıştır zaman hücreler, jele yapışmayan ve jel deforme neden kuvvetler uygulanır. Bu deformasyon, hücre çekiş ve jelin elastik özelliklerine bağlıdır. Yüzeyinin deformasyonu alanı biliniyorsa, yüzey çekme esnekliği teorisi kullanılarak hesaplanabilir. Jel deformasyon genellikle homojen jel içine fluoresan işaretleyici boncuklar içine gömülmesiyle ölçülür. Jel deforme olarak probları değiştirmesine neden olmaktadır. Jel yüzeyine yakın sondalar izlenir. Bu problar tarafından bildirilen değiştirmeler yüzey değiştirmeler olarak kabul edilir. Yüzeyden Bunların derinlikleri göz ardı edilir. Bu varsayım çekiş kuvveti değerlendirmelerde hata tanıtır. Boncukların yer bilinmesi için hücre güçlerinin hassas ölçümü için, bu önemlidir. Biz geliştirdikyüzeyinin 1.6 um olan PA jellerinde, floresan markörü boncuklar, çapı 0.1 ile 1 um sınırlandırmak için basit kimyası kullanan bir teknik sunmaktır. Bu kat, poli-D-lisin (PDL) flüoresan boncuklar ile bir lamel. PA jel çözeltisi, sonra da lamel ve yapışkan bir yüzeyi arasında yer alır. Floresan boncuk kür sırasında jel çözeltisine transfer. Polimerizasyondan sonra, PA jel jel yüzeyine yakın bir düzlem üzerinde floresan boncuklar içerir.
Introduction
Yerel çevre ile yaşayan hücrenin mekanik etkileşim yaygın Pensilvanya jeller kullanılarak incelenmiştir. Bu alt-tabakalar, bu alt-tabakaların en önemli avantajlarından 1. Biri 1997 yılında Dembo ve Wang tarafından kurulan basit, iyi karakterize edilmiş protokolüne dayanan kendi sertliği jel solüsyonunun özel bileşenlerin konsantrasyonlarını değiştirerek ayarlanabilir olmasıdır. Bu, farklı katılıklarla ortamlarda hücrelerin etkileşimi incelemek için bir arzu platform sağlar. PA jeller, hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile kaplanmış olduğunu zaman, hücreler kuvveti oluşturarak, bunlara yapışır. Hücre kuvvetin sonucu olarak, jel elastik bir gövde olarak deforme eder. Bu deformasyon, hücrelerin ve jelin elastik özellikleri tarafından uygulanan kuvvetin büyüklüğüne bağlıdır. Çeşitli çalışmalarda hücresel çekiş kuvvetleri araştırmak PA jelleri istihdam var.
PA jel imalat Bir varyasyonda, floresan mikrosferler (boncuk) t gömülürfarklı bükülmezliklerde 2 jelleri üzerinde çekme kuvvetlerinin hücre miktarını belirlemek için jel hroughout. Hücre kuvvet başvuru üzerine, boncuk jel izleyen deformasyon onların ilk konumdan yerinden. Deformasyon alan tek tek kordonların ölçülür. Bu deformasyon alan esneklik teorisi ile çekme kuvvetlerinin hesaplanması için jelin elastik özellikleri kullanılmaktadır. Bu ölçümler hücreler mekanik duygusu ve kendi yerel mikroçevresinin 3 ile etkileşim olarak nasıl fikir verir.
Yaygın olarak kullanılan bir çok Pensilvanya jel üretim protokolleri, haplar, sıvı, polimerize edilmemiş halde PA, jel boyunca birbirine karıştırılır. Tam polimerleştirilmiş jel, Pensilvanya hacmi boyunca flüoresan boncuklar içerir. Hücre çekme kuvvetlerinin işlem olduğunda, jel yüzeyi (hücre alt-tabaka arayüzü) yakınındaki en boncuklar izlenir. Bu tür boncukların değiştirmeler kuvvet calculatio basitlik için hücre kültürü yüzeyinde meydana varsayılmaktadırn. Jelin derinliğinde boncukların gerçek konumu göz ardı edilir. Bununla birlikte, elastik bir ortamda (örneğin, Pensilvanya jel gibi), bir kuvvet tatbiki bir noktaya yakın bir kordon daha uzak bir noktadan bir boncuk daha hareket eder. Böylece, hücresel traksiyonların düşük hesaplanmasına yüzey sonuçlara edilene yüzeyden uzak (boncuk yerde) bir noktanın yer değiştirmesi muamele edilmesini içerir. Hatanın derecesi yüzeyinden kordonun uzaklığa bağlıdır. Hata kordonun konumu bilgisi olmadan tahmin edilemez.
Çok hücre kültürü yüzeye yakın boncuk sınırlandırmak için basit bir yönteme ihtiyaç birkaç teknikleri ile ele alınmıştır. Araçlardan biri, çok yüzeye yakın hareketini ölçmek için üst odak düzlemi boncuk yeterli sayıda olacak şekilde bütün jel boyunca boncuk yoğunluğunu artırmaktır. Bir başka teknik, ışık o canlı hücre görüntüleme için bir konfokal görüntüleme odası inşa içerirüst en odak düzlemi sadece boncuk 4 toplanır. Farklı bir yöntem taneleri 5 olmayan bir önceden polimerize edilmiş jelinin üzerine boncuklar içeren PA jel son derece ince bir katmanı üzerinde içerir. Bu tekniklerin bir dezavantajı, her birinin, jel içindeki boncukların hassas konum bilinmemektedir olmasıdır. Bu boncuklar yer değiştirme alanı ve bu yüzden, hücre kuvvetlerin hesaplanması hesaplamaya dahil hata olarak yansır. Bir başka teknik, Sülfo-SANPAH 6 kullanılarak hali hazırda polimerize PA jel üst yüzeyine boncuk konjugasyon içerir. Bu teknik, tek taneler PA jel üzerinde gerçekten de sağlar, fakat jelin derinlikte gömülü ne ölçüde bilinmemektedir. Önce iş hücreleri gücü birkaç mikron uzaklıkta 7 hissedebiliyorum önerdi gibi bu potansiyel, hücre davranışını değiştirebilir hücreler, bir yerel topografya oluşturabilirsiniz. Son zamanlarda, 1 mikron çaplı f PA jeller desenlendirme için bir tekniktirdüzenlilestirilmis dizi luorescent fibronektin nokta belirteçler 8 kurulmuştur. Bu durumda, flüoresan işaretler derinliği bilinir ve fibronektin model dolaylı jel yüzey üzerine baskı gibi, esas olarak sıfırdır. Bununla birlikte, bu yöntem, ECM protein 1 mikron çaplı noktalar, olduğu gibi hücreler, ekleyebilir üzerinde sürekli bir ortam sağlamaz. Tamamen yüzeye çok yakın bilinen bir konuma Pensilvanya jeller içinde izci boncuk entegre ve hapsedilmesini için bir yöntem henüz kurulamamıştır.
Burada, biz çok Pensilvanya jel içindeki hücre kültürü yüzeye yakın bir odak düzlemine mikron çaplı floresan boncuk alt-mikron sınırlamak için bir yöntem geliştirmek. Bir jel, genellikle, iki cam levha arasında polimerize edilmemiş sıvı jel çözeltisi sandöviç muamele edilmektedir. Jel şiddetle bağlıdır, böylece plakaların bir işlevlendirilmektedir. Diğer fonksiyonelleştirilmemiş ve jel sertleşmeden sonra çıkartılır. Biz bu çıkarılabilir cam su değiştirmekboncuklar bir tabaka ile kaplamak suretiyle rface. Fonksiyonalize ve boncuk kaplı cam yüzeyi arasındaki sıvı jel sandviçleyerek sonra, jel boncukları transfer işleminin sertleştirme sırasında. Bu yüzey 1.6 um olan jel içine Tanelerin entegrasyon mesafeyi sınırlar. Cam alt Petri kapları jel tedavi edildiği yapışık yüzeyi olarak kullanılır. Polimerizasyon sırasında düz bir üst yüzey jel oluşturmak için, bir dairesel cam lamel sandviç etmek için, cam alt-Petri kabı ile jel kullanılır. Jel üretiminden önce, üst cam kapak kayma bir yüzey yükü, sonuçta poli-D-lisin (PDL) ile kaplanır. PDL basınçlı hava ile üflenerek uzaklaştırıldı edilir ve su içinde boncuk çözeltisi kapak slipleri üzerinde bırakılır. Bu, negatif bir yük taşıyan karboksile floresan, mikro-boncuklar, uygulanması ve PDL ile işlenerek oluşturulan pozitif yüklü yüzey ile etkileşime girer. Basınçlı hava, tek bir tabaka ile lamel kapalı boncuk çözeltisi üfleme sonraboncuklar elektrostatik kuru kapak kayma birleştiğinde kalır. Cam slaytlar, hasarsız ve tamamen sağlam PA jelden çıkarıldı olarak PDL kaplama, jel yüzeyine camın yapışkanlığını etkilemez.
Cam alt Petri kutuları 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane ve% 0.5 glutaraldehid ile işlenerek yapışkan yapılır. İstenen katılıklarının Pensilvanya jeller standart bir prosedür ile 9 bisakrilamid akrilamid uygun konsantrasyonlarda karıştırılmasıyla oluşturulur. Jel çözeltisinin bir damlacık cam alt Petri kabı üzerine pipetlenir. Boncuklar ihtiva eden bir cam kapak kılıfı sandviç etmek için Petri kabı ile jel kullanılır. Jel tedavi edildiğinde, üst kapak kayma yüzeyinden 1.6 um olan PA jel gömülü boncuk bırakarak kaldırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Imalatı ve hücre kültürü yüzeye yakın fluoresan gömülü mikrosferler ile katılıkları değişen PA jeller fonksiyonalize.
1. Üst cam kapak slipleri işlevselleştirici
- Temiz cam kapak slipleri (# 1.0, 12 mm çap.) Sabun ve su ile, ardından da etanol ile yabancı tozunu alın.
- Yer cam kapak onlar lamelleri ile etkileşim kolaylığı kolaylaştırmak için değmiyor böyle bir rendelenmiş yüzey (yani pipet tutucu) üzerinde kayıyor.
- Kat, kapağın tüm yüzey poli-D-Lizin 1 saat (Şekil 1A) (0.1 mg / ml) ile kayar.
- Bu süre sırasında, 1 gerçekleştirmek: 0.1 um çaplı kolloid solüsyonu 10,000 seyreltme, deiyonize (Dİ) su ile mikro-kırmızı flöresanlı jel yüzeyi üzerinde 20 mikron 2 başına yaklaşık 1 mikro-partikül yoğunluğu elde edildi. Çeşitli dilüsyonları sonuçları için Şekil 2'ye bakınız. Bu dilution Özel deneylerin ihtiyacını karşılamak üzere değiştirilebilir.
- 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosu içinde seyreltilmiş çözelti yerleştirin.
- 1 saat sonra, dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Rendelenmiş yüzeye kuru bir örtü fişleri dönün.
- Her kapak kayma üzerine ultrasonik banyo ve pipetle 150 ul gelen seyreltilmiş kolloid çözüm çıkarın. 10 dakika (Şekil 1B) için bırakın.
- Dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Kullanıma hazır olana kadar kuru bir örtü karanlıkta rendelenmiş yüzey ve mağaza fişleri dönün.
Doğrudan Glass Bottom Petri Yemekleri PA Jel hazırlanması 2.
- 100 ° C'ye kadar ön ısıtma ocak gözü.
- Cam alt Petri yemekleri istenilen sayıda yatırın (14 mm ile 35 mm çanak mikro-iyi, # 1.0), bir kimyasal davlumbaz düz bir yüzeye yerleştirin.
- % 97 3-aminopropil-trimethoxys her Petri kabı, mikro oyuk cam bölümünü kapsarliane kimyasal aktivasyon için 7 dakika boyunca (3-APTES'le). Polistiren zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine 3-APTES yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz.
- 7 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve atık kabı içine atın.
- Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin.
- Sıcak plakadan Petri kapları çıkarın ve kimyasal bir davlumbaz olarak düz bir yüzeye döner.
- Kimyasal bir davlumbaz olarak,% 0.5 glutaraldehid ile bir çözelti yapmak ve de 30 dakika için çözelti ile her bir Petri kabı cam bölümünü kapsar. Plastik zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine glutaraldehit yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz.
- 30 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve durulayın atık kabına atın ve glutarald çıkarınehyde.
- Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin.
- PA jel solüsyonunun bileşenlerin karıştırılması önce, cam alt ile jel hızlı sandviçlenmesine yönelik sağlayan, kolaylıkla ulaşılabilir olacak şekilde kimyasal bir davlumbaz içine fonksiyonalize cam slaytlar hareket jel çözelti karıştırıldıktan sonra Petri kapları.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpü, Tablo 1 de listelenen konsantrasyonlarda hemen arka arkaya% 40 bisakrilamid, 2% akrilamid ve akrilik asit karışımı, istenen matris esnekliğini elde etmek için (10 yayınlanan bir protokolün uyarlanmıştır).
- Jel tamamlamak üzere solüsyon arzu edilen matris elastiklik tekabül eden Tablo 1'de belirtilen miktarlarda, 100 mM HEPES,% 10 amonyum persülfat ve TEMED ilave edin.
- Hemen cam kısmın merkezi üzerine jel solüsyonu 15 ul pipetpetri kutularının.
- Hemen cımbız ile bir fonksiyonlaşmış cam kapak kayma pick up.
- Floresan boncuk jel çözeltisi ile yan yapma temas olduğu gibi üzerinde cam kapak kayma çevirin.
- Yavaşça fonksiyonalize yan jel (Şekil 1C) ile temas içinde olduğu şekilde, artık sıvı PA jelinin üzerine kapak kayma yerleştirin. Not: En iyi sonuçlar için, ikinci bir kişi birden fazla Petri kapları üzerine sıvı Pensilvanya jel çözüm pipetleme ise kısmi polimerizasyon olasılığını önlemek için kapak kayma ekleme rolü için tavsiye edilir.
- PA jel düşük seviyelerine polimerleştirerek floresan nano partiküller yerçekimi etkileri kaçınarak yardımcı olmak için tüm Petri kapları ters çevirin.
- PA jel stok çözelti görsel olarak santrifüj tüpü içinde polimerize en az 35 dakika boyunca, ya da kadar bekleyin.
- Üzerinde geri Petri yemekleri Flip ve kapak kayma kaldırılması ile yardımcı olmak için PBS ile onları doldurmak.
- Dikkatle kapak kayma çevresini kazımak için cımbız kullanarak, Petri kabı cam kısmı ve kapak kayma hatları ile temas. Kapak kayma yerinden kadar birkaç çevrimi gerçekleştirin. Kapak kayma çıkarın ve uygun bir kavuz çöp bidonuna atın.
- Tüm kapak slipi üzerinde ayrılmasından sonra, floresan boncuk jel (Şekil 1D) transfer olacaktır. Tamamen PBS ile PA jeller Kapak her yemeğin Petri kabı kapağı yerleştirin ve 4 ° C'de saklayın.
3. Fibronektin PA jel işlevselleştirilmesi
- Kurulu bir protokol 11'de tarif edildiği gibi, aşağıdaki önceden hazırlanmış solüsyon hazırlayın: solüsyonu ıslatın (137 mM NaCI,% 5 (h / h) gliserol) ile karıştırılır ve 2 x konjugasyon tamponu (0.2 M 2-(N-morfolino) etansülfonik asit (MES), 10 % (h / h) gliserol, pH 4.5).
- PA jelleri içeren cam-alt yemekler tüm PBS kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır.
- Pipetleyinte jel tamamen daldırılır şekilde, her jeli üzerine çözelti ıslatın. En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- Sıcak 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) ve oda sıcaklığında N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) içerir.
- EDC 10x çözeltileri (150 mM deiyonize suda 19 mg / ml) ve NHS (250 mM deiyonize suda 29 mg / ml) ile karıştırın.
- 1 bölümü 10x EDC, 1 kısım 10x NHS, 3 parça DI su ve 5 parça 2x konjugasyon tampon karıştırın.
- Emmek çözeltinin çıkarılması için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun.
- Jel yüzeyini kaplayan ve Petri kabına (150-250 ul) cam alt kuyu doldurmak için yeterli NHS / EDC çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Oda sıcaklığında erimeye fibronektin. Çözüldükten sonra, 50 ug / ml fibronektin çözüm oluşturmak için steril distile su karıştırın.
- NHS / EDC Solu kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanınyon. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun.
- Her jel için fibronektin çözeltisi 150 ul ilave edin. Fibronektin bağlanmasına olanak sağlamak için 35 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 35 dakika sonra, 2 haftaya kadar 4 ° C 'de her bir Petri kabı ve saklamak için PBS ekleyin.
4. Çekiş Kuvveti Deneyleri
- Bir su banyosunda ılık bir ortam hücre PBS ve 37 ° C tripsin.
- Jeller durular arasında PBS aspire, steril PBS ile 5 kata, ve kaputun kaplı bırakın durulayın.
- Şişe içeren hücrelere 1 ml tripsin 2 cm başına 25 ekleyin. Hücreler şişe kaldırdı sonra, hücre medya ile tripsin sulandırmak ve hücreleri saymak. Jel yüzey alanına bağlı olarak, / cm2 3000 hücrelerinin bir nihai hücre yoğunluğu için tohumlama jel başına gerekli olan hücre sayısının belirlenmesi. Seyreltik veya hücreye ortam karışımından 150 ul hücre, bu sayı içerir şekilde süspansiyon konsantre edilir. Hücre Suspens alikosu 150 ulHer jel üzerine iyon.
- 30 dakika için bir kuluçka makinesi içinde hücreleri içeren Petri kapları yerleştirin. Daha sonra dikkatli bir şekilde Petri kapları kaldırmak ve çanak şeklinde ve yüzeyleri tamamen batırılır ortam (yaklaşık 2 mi) ile Petri kabı kalan doldurun.
- Görüntü alımı kadar inkübatör Petri kapları geri yerleştirin.
- , Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) prizma takın, 40x suya daldırma hedefi eklemek mCherry veya eşdeğer floresan filtreyi seçin ve çevre odasında açın: görüntüleme için mikroskop ve veri toplama sistemi hazırlayın.
- Görüntüleme için hazırlandığı zaman, inkübatör bir Petri kabı çıkarın ve mikroskop sahnede yavaşça yerleştirin. DIC görüntüleme için Petri kabı kapağını çıkarın.
- Tek bir hücre bulmak ve DIC hücrenin tek bir hareketsiz görüntü yakalamak.
- Mikroskop sahne hareket ettirmeden, floresan görüntüleme moduna geçiş. Floresan-küreler ve rec odaklanmaMikro-kürelerin, bir görüntü Kat.
- Dikkatlice bir pipet ile Petri kabı, hücre ortamını çıkarın ve% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
- Görüntü sonra hücreler hücre altında mikro-müstakil.
- ImageJ 12 Kullanım parçacık görüntü velosimetri (PIV) analizi nedeniyle hücresel kuvvetleri deplasman alanını hesaplamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konfokal görüntüleme boncuklar, jel yüzeyinin altına gerçekten olduğunu tespit etmek ve jel derinliği içindeki tam yerini belirlemek için kullanıldı. Jelin içindeki edilenlerden daha farklı bir dalga boyunda floresan taneler yüzeyinde yerleşmeye bırakıldı ve gömülü floresan, nanopartiküller ve yüzeyi üzerinde bu arasındaki mesafenin bir ağırlık merkezi tanıma algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Jel yüzeyi üzerindeki kordonun konumu jel-hücrelerinin yüzeyine yapışması üzerinde kuvvet uygulamak üst yüzey için bir referans olarak hizmet etmektedir. (Kırmızı yüzeyde boncuk ve bunların tam tersi jel yeşil taneler) olarak iki senaryonun bir şeması, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Algoritması üç boyutlu ağırlık merkezi konumunun z yüksekliği interpole eder. Üç sertlik jeller (1, 10, ve 40 kPa) ve iki boyutu (çapı) flüoresan boncuklar için bu işlem tekrarlanır (0.1 ila 1 mikron ve kırmızı-sarı-yeşil). Mesafebir jel içinde boncuk ve belli bir dalga boyunda en yakın komşusu ile belirlenen üç boyutlu geometrik merkezinden dayandırılmıştır. 4 boncuk uzaysal dağılımını göstermektedir (üst yüzeyi üzerinde ve gömülü) ve YZ düzleminde yansıtılan görünüşüdür Şekil. İkinci jel yüzeyinin tüm boncukların derinliği sağlar.
0.1 mikron boncuk ortalama derinliği 619 nm, 467 nm, sertlik 1, 10 Pensilvanya jeller için 278 nm ve 40 kPa, sırasıyla (Şekil 5A) 'dir. 1 mikron çapında boncuklar için mukabil derinlikleri 40 -20 kPa jeller, 10 kPa jelleri içinde 12 nm ve 1 kPa jeller (Şekil 5B) 1.255 nm nm. Geleneksel olarak, çekiş kuvveti mikroskop çalışmaları için amaçlanan PA jeller için kullanılmıştır olarak Konfokal görüntüleme de, jel boyunca dağılmış tanecikleri ile jeller üzerinde gerçekleştirilmiştir. PA, jel boyunca dağılmış boncuk derinliği, daha önce tarif edilen aynı algoritma kullanılarak ölçülmüştür ve d karşılaştırılırSunduğumuz tekniği kullanılarak epths. 6, geleneksel üretim metotları kullanılarak PA jel derinliğinde boncuk dağılımının değişkenliğini göstermektedir Şekil.
Fibronektinle fonksiyonlandırılmış zaman fibroblastlar PA jel yüzeyine tutunur. Bir fibroblast hücre ve karşılık gelen flüoresan boncuklar tabaka için yer değiştirme alanı, Şekil 7 'de gösterilmiştir. Görüntünün çevre yakınında Boncuk odak biraz dışarı görünür. Cam jelden uzaklaştırılması üzerine tamamen sağlam kalır Bu, jelin kısmında mekanik bir kusur değildir. Bunun yerine, bunun nedeni, bu deneyde kullanılan su batırma objektifi bir optik etki bir sonucudur. Ortama tripsin ilave edilmesi üzerine, hücre orijinal haline deforme PA jel yüzeyinin geri sonuçlanan yüzeyinden salınır. Çapraz-bağıntı algoritması kordonların 10 göre deformasyon alanını hesaplamak için kullanılmıştır.yer değiştirme harita y-yönünde hücre çekiş güçleri baskın kutuplaşma göstermektedir.
Üst cam kapak için fonksiyonlandırmalar süreci Şekil 1. İllüstrasyon PDL ve floresan boncuklar ile kayıyor. (A), cam kapak slipleri (mavi), 1 saat boyunca 0.1 mg / ml 'PDL (turuncu) ile inkübe edilir. Basınçlı hava kapağı, kuru fişleri darbe ve PDL çıkarmak için kullanılır. (B), cam kapak slipleri basınçlı havanın uygulanmasıyla 5-10 dakika süreyle, 100 nm çapında floresan boncuk çözeltisi ile inkübe edilir ve daha sonra çıkartılır. Küreciklerin bir tabaka elektrostatik olarak lamel bağlanmış olarak kalır. (C), bir aktive edilmiş bir cam yüzeye sahip sandviç Pensilvanya jel kullanılmaktadır boncuklar ile işlevselleştirilmiş lamelleri. (B), üst kapak kayma uzaklaştırıldıktan sonra, Pensilvanya jel polimerleştirme alttakiiyon, boncuklar içinde yer almaktadır ve çok jel yüzeyine yakın. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
0.1 mikron çapında tane içeren Floresan Şekil 2. PA Jel Yüzey. Boncuklar ile muamele edilmiş PDL üst cam kapak slip kaplama öncesinde, boncuk çözeltisi (A), 10,000 kat (3.64 cm x 10 8 boncuk / ml) ve (B) ile seyreltildi 20.000 kat (1.82 x 10 8 boncuk / ml). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
![Şekil 3,]("/files/ftp_upload/51873/51873fig3highres.jpg")
Jel yüzeyine yakın olarak lokalize boncuklar ile Şekil 3. Hücre alt-tabaka bir arayüz. PA jel içinde yer kordon konfokal mikroskopi ve ağırlık merkezi tanıma algoritması kullanılarak nicelleştirilmiştir iki senaryo şematik. Birinci senaryo (A) 'da gösterilen, jel ve yüzeyde yeşil 1 mikron çapında boncuklar, jel ve kırmızı 100 nm çapında boncuklar içinde (B), Yeşil 1 mikron çapında boncuklar olarak ikinci iç Kırmızı 100 nm çapında boncuklar yüzey. (C) bir hücrenin yüzeyine yakın jel ve yüzeyi üzerinde oturan yeşil boncuk içi yerleşimli kırmızı boncuklar ile bir jel (mavi) yapıştırılır (sarı) bir illüstrasyon karikatür. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.
Şekil 4. Eşodaklı dilim (XY, merkezi) ve beraberindeki YZ kırmızı jel gömülü 0.1 mikron boncuk ve yüzeyde 1 mikron boncuklar ile bir jel (sol) projeksiyon bakıldı. Tüm eksenler için birimler nanometre. Yukarıda veya yeşil boncuk gibi aynı düzlemde kırmızı boncuk Arasıra oluşumları hafif kırmızı için floresans emisyon spektrumları örtüşme (mCherry) ve yeşil (GFP) atfedilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. PA jel üst yüzeyine yakın sınırlı boncuk derinliğinin Histogramlar. Sertlikteki yaylar 1 kPa, 10 kPa, 40kPa sırasıyla, mavi, kırmızı ve siyah ile temsil edilmektedir. Bir Gauss eğrisi, her veri seti ve genlik karşılık x-değeri boncuk ortalama derinliği olarak yorumlanır sığacak edildi. Iki senaryo test edilmiştir: (A). 1 um yüzeyinde taneler, ve (B) yüzeyinde 0.1 um boncuklar, jel içine 1 um boncuklar, jel içine 0.1 um boncuk burada tıklayın bu daha büyük bir versiyonu görüntülemek için rakam.
Şekil, geleneksel bir üretim metodu (siyah) ile PA, jel boyunca keyfi gömülü boncuk derinliğinin 6. Histogramlar ve sertliği A PA jeller) 1 kPa için, bu teknik (kırmızı) ile PA jel üst tabakasının yakın olarak lokalize boncuklar, B) 10 kPave C) 40 kPa. Ankastre jel en üst 10 mikron içinde hem de jel tip boncukların derinliğini gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hücre çekiş nedeniyle Şekil 7. Hacmi alanı. 10 kPa jel üzerinde fibroblast (A) faz kontrast görüntüsü. (B) tarafından oluşturulan fibroblast çekme ile oluşturulan değiştirme alanı. Renk çubuğu nanometre boncuk değiştirmeyi gösterir. Tripsinizasyon önce bir hücrenin altında 0.1 mikron çapında boncuk (C) Floresan görüntü. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Jel yüzey üzerinde duran farklı bir boyut / dalga boyu boncuk jel boncukları içine nisbetle ortalama konumu Şekil 8. görünümü. Sağa doğru (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa) sol PA jel azalırsa sertliği (A). yüzeyinde jel ve yeşil 1 mikron çapında boncuk kırmızı iç 0.1 mikron çapında boncuk. (B) yüzeyinde jel ve kırmızı 0.1 mikron çapında boncuk içindeki Yeşil 1 mikron çapında boncuk. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 9. Diτ için teorik değer stribution /. çeşitli derinliklerde boncuk göre μ boncuklar çap olarak 0.1 um ya da homojen olarak dağılmış veya (A) 1 kPa jeller, (B), 10 kPa jeller ve (C) 40 kPa jeller yüzeye yakın olarak lokalize edilmiş . Altın ok boncuk jel yüzeyinde olduğu z = 0 durumunda, için τ / μ değerini gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| E (kPa) | % 40 akrilamid (ul) | BİS (konsantrasyon) | % 2 BİS (ul) | 100 mM HEPES (ul) | 0.1 | 625 | 0.00009 | 22.5 | 4225 |
| 0.25 | 625 | 0.0001 | 25 | 4222,5 | |||||
| 0.5 | 625 | 0.00011 | 27.5 | 4220 | |||||
| 0.75 | > 625 | 0.0002 | 50 | 4197,5 | |||||
| 1 | 625 | 0.0003 | 75 | 4172,5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0.0004 | 100 | 4147,5 | |||||
| 2 | 625 | 0.0005 | 125 | 115px; "> 4122,5||||||
| 2.5 | 625 | 0.0006 | 150 | 4097,5 | |||||
| 3 | 625 | 0.0008 | 200 | 4047,5 | |||||
| 3.5 | 625 | 0.0009 | 225 | 4022,5 | |||||
| 4 | 0.001 | 250 | 3997,5 | ||||||
| 4,5 | 625 | 0.0012 | 300 | 3947,5 | |||||
| 5 | 625 | 0,0014 | 350 | 3897,5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0.0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0.0018 | 450 | 3797,5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0.002 | 500 | 3747,5 | |||||
| 7 | 625 | 0.0022 | 550 | 3697,5 | |||||
| 7.5 < / Td> | 625 | 0.0024 | 600 | 3647,5 | |||||
| 8 | 1000 | 0.001 | 250 | 3622,5 | |||||
| 10 | 1000 | 0.0013 | 325 | 3547,5 | |||||
| 15 | 1000 | 0.002 | 1px; "> 5003372,5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0.0027 | 675 | 3197,5 | |||||
| 30 | 1000 | 0.0037 | 925 | 2947,5 | |||||
| 40 | 1000 | 0.0048 | 1200 | 2672,5 |
TabloYoung Modülünden göre 1. Pensilvanya jeli, ister kimyasal konsantrasyonlar. Arzu edilen bir PA jel esneme modülü için, akrilamit, bisakrilamid ve HEPES tamponunun belirtilen konsantrasyonları 25 ul% 10 amonyum persülfat (APS), 5 ul akrilik asit ile takviye edilmelidir 2.5 ul TEMED.
| z (um) | u x ((τ / μ) mikron) |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0.237 |
| 1.5 | 0.164 |
| 2 | 0.124 |
| 2.5 | 0.100 |
| 3 | 0.083 |
| 3.5 | 0.071 |
| 4 | 0.062 |
| 4,5 | 0.056 |
| 0.050 |
Tablo Boussinesq teorisine dayanan jel yüzeyinden boncuk derinliği, z, karşılık gelen τ / μ bir fonksiyonu olarak 2. değiştirmeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik kullanıldığında, bu çözelti, uygun şekilde seyreltilmiş boncuk ve tanecikler arzu edilen çapına göre seçilir esastır, Pensilvanya jel tabaka sertliği ve arzu edilen deneyde incelenmektedir fenomenlerin boyut ölçeği.
Üst cam kapak slipi üzerinde karıştırılmıştır fonksiyonalize önce boncuk seyreltilmesi zaman dikkatli alınmalıdır. Jel yüzeyinde halkalar arasında aralık koloit çözelti seyreltme faktörü değiştirerek değiştirilebilir. Çok fazla seyreltilmesi kapak kayma o çift boncuk sayısının azaltılması ve nihai olarak jel boncukları sayısını azaltacaktır. Çok az çözeltisinin, temas halinde ve birbirinden ayırt edilemez şekilde jel içinde tanelerin çok yüksek bir yoğunluk sağlayabilir. Tamamen nanoparçacık toplanmasının yok etmek için çoğu zaman olanaksız olsa da, seyreltilmiş çözeltiye ultrasonik dalgaların uygulaması etkili nan minimizeoparticle birikmesi de bulunmaktadır. Bu protokolde kullanılan kolloid solüsyonu 10,000 kat seyreltme 3.64 x 10 8 boncuk / ml 'lik bir boncuk konsantrasyonunu gösterir, ve 0.1 mikron çapında boncuklar 0.05 boncuk / um 2'nin bir arzu edilen parçacık yoğunluğu elde edilir bulmuşlardır. Bir 1: 20,000 seyreltme (1.82 x 10 8 boncuk / mi) 52 mikron parçacık başına 2 ortalama verir 2 farklı seyreltileri ile jellerin yüzeyin görüntülerini göstermektedir.. Bu jel transfer boncuk sayısında değişkenlik olduğu not edilmelidir. Bu işlevsellik sırasında sıkıştırılmış hava ile kapak kayma gelen boncuk çözeltisi kaldırılması ile ilgili olarak değişkenlik kaynaklanmaktadır. Genel olarak, en az iki faktörü ile seyreltme faktörünü artırmaları sürekli boncuk başına alanda en az iki kat artışa neden olduğunu bulduk.
Bu t tam daldırma sonuçlanacak bir boncuk boyutu (çap) seçmek için de önemlidiro PA polimerizasyonundan sonra, jel içine boncuk. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, sertlik Jel boncukların yerini etkiler. 0.1 mikron çapında boncuk için, takviye kanadının derinliği sertliği azaldıkça artar. Bu gözenek büyüklüğüne ve PA jel sertliği 13 arasındaki ters ilişkinin bir sonucu olabilir. Test edilen üç jellerin sertliği tüm için, boncuklar, jel içine sürekli olarak lokalize edilir ve jel yüzeyinin 1 um olan Şekil 8A'da gösterildiği gibi. Jel içinde 1 um ortalama boncuk sertliği konumu da değişir. Onlar 1 kPa jeller derinliklerine (yaklaşık 1.25 mikron) gömülürler. Boncuklar zaman jelin üst kısmından çıkıntı anlamına 10 ve 40 kPa jeller için, 1 mikron çapında boncukların üst konumu jel altında 0.5 um üzerinde yaklaşık 0,5 um arasında değişmektedir (Şekil 5) yüzey (Şekil 8B). Bu topogra tanıtır, bu zararlı olduğuhücreler için PHY ve topografya hücre alt-tabaka 14 etkileşimlerini etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle, belirli bir katılık jellerin hazırlanması bu teknikte için boncuk seçme dikkatli olmak gerekmektedir. Bu yöntemi karakterize etmek için kullanılan iki topuk kısmı boyutlarının, 0.1 mikron çapında optimum boyut göstermektedir. Diğer boncuk büyüklükleri bu teknikle kullanılabilen, ancak burada açıklandığı gibi, boncukların jel polimerizasyon esnasında konumlandırıldığı için kesin derinliğini anlamak için, konfokal mikroskopi kullanılarak kalibre edilmelidir.
Bu teknik görüş alanı içinde ayırt parçacıkların sayısını artırarak Pensilvanya jel boncuk uzaysal çözünürlüğü artırır. Jelin en yakın bir katmana boncukların lokalize önemli jel karma sertliğe etkilemez. Isostress bileşik teori jel içeren BEA sadece 1 um-kalınlıkta tabaka, bileşik bir elastik modülü E c hesaplamak için kullanılırDS ile
Ef polistiren boncuklar (3 GPa) olduğu elastik modülü, E, m, jel matrisin (10 kPa) de elastik modül olup, V F ve v, m, sırasıyla, boncuk ve jel matrisinin hacim oranında bulunmaktadır. Boncuklar hacminin sadece% 0.03 içermektedir için, E, C = 10,0025 kPa sertlik 10 kPa'lık bir izotropik jel elastik modülü önemli ölçüde farklı değildir. PA jelleri imal edilmesi için kullanılan bir metod, böylece polimerizasyon esnasında 15 boncuk dağılımına yer çekiminin etkisini en aza indirmek, 30 sn için, polimerizasyon süresini azaltır. Boncuklar, jel içine polimerize etmek için yöntem olup, daha uzun süre (~ 30 dakika) polimerizasyon süresinden dayanırbu jel yüzeyine çıkıntı yapmaz;. Tek bir tabakaya boncukların lokalize önemli kompozit sertliği jel ve jel matris içine boncukları transferinde daha uzun polimerizasyon süresi yardımı etkilemez, çünkü, bizim tekniğinde polimerizasyon süresini azaltmak için bir ölçü içermemektedir.
Bizim teknik alt-tabaka deformasyon ölçüm ve böylece de, hücre çekiş güçleri hesaplamasını iyileştirir PA jelin içindeki bilinen bir derinliğe boncuk lokalize gösterilmiştir. Hücresel çekiş güçleri ölçmek için bir teorik yaklaşım daha önce 16,17 bildirilmiştir. Bu yaklaşım, esnek, yarı sonsuz bir yarı-sonsuz bir katı olarak alt-tabaka jeli davranır. Boussinesq çözüm deplasman alandan çekiş kuvvetlerini hesaplama ters sorununu çözmek için kullanılır. Biz nedeniyle jel s den uzak boncuk deplasman ölçümünde hatayı ölçmek için Boussinesq ayrılmaz bir basitleştirilmiş versiyonu istihdamsert bir yere 18. , Uygulanan kesme geriliminin dayalı olarak belirli bir yönde değiştirmesi için denklemi, τ, belirli bir yarıçapı R üzerinde verilir
U x x yönünde yer değiştirme miktarıdır, μ kesme modülü ve z jel yüzeyinden boncukların derinliğidir. Jelin derinliği boyunca boncuk çeşitli konumlar için, karşılık gelen bir yer değiştirme Tablo 2'de gösterilmiştir.
Burada gösterilen durumda, çapı 1 um arasında bir ortalama boyutu fokal yapışma olduğu tahmin edilmektedir. Boncuklar hücrelerle (z = 0) ile eş-düzlemli olduğu varsayılır ise, yer değiştirme 0.75 τ / μ ile verilir. Boncuklar, sadece 1 um jel yüzeyi altında ise, yer değiştirme 0.24 τ / μ ile verilir. Bu1 mikron altında bir konuma yüzeyi ile aynı düzlemde bir kordon gelen yer değiştirme üç kat daha büyük azalma göstermektedir. Bu, hassas bir jel içinde yer bilinmemektedir gömülü boncuk harekete göre yüzey çekiş güçleri hesaplanmasında hata olarak yansır. Önerilen ve geleneksel üretim yöntemlerinin her ikisi için de jelde boncukların derinliğinin bir fonksiyonu olarak τ / μ tarafından tanımlanan çekiş varyasyon önemlidir. Şekil 9, güçlerin dağılımını gösterir (bu oran τ verilen / μ) esaslı Boussinesq teori boncuklar eşit olarak dağıtılır ve jel yüzeyine yakın olarak lokalize zaman alan optik derinliğinde boncuk kalınlıklarını, z dağılımını kullanılarak hesaplamanın sonucu olduğu. Boncuklar hücreleri, z = 0 ve τ / μ = 0,0133 olarak aynı uçakta olsaydı hücre kuvvetin en doğru ölçüm neden olur. 118 Bu durumda, τ / μ artar karşılaştırıldığında,% 80 ve% 1 kPa, 10 kPa, 40 kPa ve jeller,% 50, sırasıyla, boncuk önerdiğimiz tekniği kullanılarak yüzeye yakın olarak lokalize olduğunda. Boncuklar eşit jel derinliği boyunca dağıtılmış zaman, τ / μ sırasıyla 1 kPa, 10 kPa, 40 kPa ve jeller için, yüzeye yakın boncuk lokalize ile uyarılan artışı ötesinde ek bir% 60,% 80 ve% 150 arttırır. Boncuklar jel derinliği boyunca dağıtılan bu çekiş hesaplamalarda yaklaşık% 200 bir hata toplam temsil eder. Böylece, jelin içindeki bilinen bir derinliğe kadar boncuk lokalize değiştirme ölçümlerine ve hücre çekiş güçleriyle doğruluğunu artırır.
Burada açıklanan tekniği boncuklar jel yüzeyine yakın lokalize olduğu gibi çekiş kuvveti mikroskopi uygulamaları PA jel malzemenin hazırlanması için yeni bir yol sunuyor. PA jel içinde bilinen bir derinliğe boncuk hapsetmesi am oluşturarak, hücre kuvvet uygulaması üzerine boncuk gerçek deplasman ilgili yeni bilgiler sağlarhücreler altta yatan madde deforme nasıl doğru resmini cevher.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Disiplinlerarası İnovasyon Girişimi Programı, Illinois Üniversitesi kabul etmek istiyorum, 12.035 hibe. SK Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Hibe dan UIUC finanse edildi 0965918 IGERT: Hücresel ve Moleküler Mekaniği ve Biyonanoteknoloji içinde Araştırmacıları Nesil eğitilmesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).
