Summary
טכניקות הדמיה חיה קטנות מאפשרות בדיקות אבחון סדרתי והתערבויות טיפוליות in vivo. לאחרונה, היקף היישומים התרחב באופן משמעותי וכיום כולל הערכה של התפתחות גידולים במעי הגס, ריפוי פצעים וניטור של דלקת. פרוטוקול זה מדגים יישומים פוטנציאליים המגוונים אלה של אנדוסקופיה העכברית.
Abstract
מודלים עכבר נמצאים בשימוש נרחב ללמוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם ולהעריך את תהליכי אבחון, כמו גם התערבויות טיפוליות preclinically. עם זאת, הערכה תקפה של שינויים פתולוגיים לעתים קרובות מחייבת ניתוח היסטולוגית, וכאשר היא מבוצעת vivo לשעבר, מחייבת מוות של בעלי החיים. לכן בהגדרות ניסיוניות קונבנציונליות, בדיקות מעקב תוך פרט הן לעתים נדירות אפשריות. לפיכך, פיתוח של אנדוסקופיה העכברית בעכברים חיים מאפשר לחוקרים בפעם הראשונה לשניהם באופן ישיר לדמיין את רירית הקיבה ומעיים וגם לחזור על התהליך כדי לפקח על שינויים. יישומים רבים לin vivo אנדוסקופיה העכברית קיימים, כולל חקר דלקת מעיים או ריפוי פצעים, קבלת ביופסיות ריריות שוב ושוב, ולנהל באופן מקומי סוכני אבחון או טיפול באמצעות צנתרים הזרקה זעירים. מו הדמיה לאבחון לאחרונה, הדמיה מולקולרית האריכהdalities מאפשר זיהוי ספציפי של מולקולות מטרה מובחנות באמצעות photoprobes הספציפי. לסיכום, אנדוסקופיה העכברית התפתחה כטכנולוגיה חדשנית חדשנית לאבחון ניסיוני בתחום ההדמיה vivo ועלולה להשפיע באופן משמעותי על מחקר פרה קליני בתחומים שונים.
Introduction
מודלים של בעלי החיים העשירו מאוד את ההבנה של פתולוגיות במעיים רבות שלנו. עכבר המעבדה (musculus Mus) התפתח כמודל חיה ראש במחקר ביו בשל המידע הגנטי והגנומי בשפע שלה, והוא זמין בקלות בזנים מהונדסים ונוק אאוט. בנוסף לשיפור היווצרות מחלה הבנה, מודלים של בעלי החיים גם חשוב משמשים לבדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם התערבויות אבחון או טיפול פרה קליניות. עם זאת, למרות מגוון רחב של דגמי עכבר מחקה מחלות של בני אדם, הרבה אפשרויות אבחון והתערבות המשמשות באופן שיגרתי בטיפול בחולה אינן זמינות לעכברים. בהתאם לכך, אסטרטגיות מעקב כדי לפקח על מהלך המחלה עכברית או את ההשפעה של התערבויות טיפוליות לעתים קרובות מוגבלות לתצפיות עקיפות או נתיחה שלאחר מות הניתוח. בעוד שנהלים לא פולשנית קיימים לעכברי ניטור חיוניות כמו מדדי פעילות מחלה, quantification של ירידה במשקל או רווח, דם, שתן וצואת מנתח, אלה הם רק אינדיקטורים עקיפים ומוטה על ידי שונות בין פרט. בנוסף, לאחר המוות מנתח למנוע תצפיות אורך בנקודות זמן חוזר על עצמו. טכניקות הדמיה מתוחכמות כדי לעקוב אחר פעילות מחלה רק לאחרונה בעכברים הוכנסו 1,2. למרות שטכניקות הדמיה אלה מאפשרים לניתוחים חוזרים ונשנים, הם רק לספק מבט תיאורים ולעתים קרובות לא מדויק על הבטן, אינו מאפשרים הדמיה של רירית ישירה או לאפשר התערבויות אבחון או טיפול כגון רכישת ביופסיה או יישום מקומי וintramucosal של מועמדי סמים.
לאחרונה, מערכות אנדוסקופיות ברזולוציה גבוהה לשימוש בעכברים חיים פותחו 3,4. בפעם הראשונה בטכניקות אנדוסקופיות אלה מאפשרות הדמיה ישירה של פתולוגיות מחלה במעי הגס endoluminal כגון ריפוי פצעים או דלקת מעיים obj מתןמצב בזמן אמת ective, המאפשר מחקרים ארוכי טווח בבעלי החיים זהים בנקודות זמן חוזר על עצמו. מלבד המאפשר ביופסיות חוזרות ונשנות בעכבר בודד, יכולים לשמש גם מערכות אנדוסקופיות להשפיע טיפולי גידול שונה או דלקת מקומית כך שהוא מאפשר יישום ישיר של חומר לאזור של עניין. יתר על כן, כפי שחומרים טיפוליים ושליטה יכולים להיות מועברים ישירות לאזור של עניין, זה יכול להתבצע באותו העכבר, לא כולל השתנות בין פרט. מערכות אלה כעת להיות מועסקים להערכה של דלקת במעי הגס, ריפוי פצעים, ביופסיות כבד לפרוסקופי ואינדוקצית orthotopic של גידולים בכבדים 8 והתפתחות גידולים באמצעות מערכות ניקוד שונות כגון המדד אנדוסקופית העכברי של חומרת קוליטיס (MEICS) 5-7. MEICS מורכב מחמישה פרמטרים להערכת דלקת: עיבוי של דופן המעי הגס, שינויים של הדפוס של כלי הדם, נוכחות של הפיברין, גרעיניות של mucosמשטח אל, ועקביות שרפרף.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש באנדוסקופיה הנוקשה במודלים עכבריים של ריפוי פצע במעיים, דלקת וסרטן מעי גס. ראשית, אנחנו מדגימים את ההערכה אנדוסקופית של ריפוי פצעים ודלקת במעי הגס, כמו גם הערכת אורך של פעילות קוליטיס והמחקר של cancerogenesis במעי הגס העכברי. מעבר לשימוש תיאורים של אנדוסקופיה העכברית, אנו מספקים הוראות מפורטות על השימוש במכשור אנדוסקופי לקבלת ביופסיות, והיישום המקומי וintramucosal של רכיבים שונים של עניין (למשל, לתרופות או תאים סרטניים). לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש באנדוסקופיה הקרינה העכברית, שמשתמשת בטכניקות הדמיה מולקולריות מתוחכמות, בהגדרה של גידולי מעי גס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי Landesamt für נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) על פי חוק הגנה על בעלי חיים הגרמנים.
.1 חומרים והתקנה ניסיונית
- טיפול בבעלי חיים
- השתמש נשי או עכברי זכרים של כל זן במשקל 20 25 גרם ולשכן אותם על פי חקיקת טיפול בבעלי החיים מקומית.
- להאכיל את העכברים עם אוכל מיוחד למכרסמים ולהחיל צ'או ללא אספסת לפחות שלושה ימים לפני הקרינה בדיקות כדי למזער הקרינה אוטומטית endoluminal.
- לספק כרצונך מי שתיית autoclaved.
- אינדוקציה של קוליטיס-Induced DSS החריף
- הכן 3% (w / v) נתרן גופרתי dextran (DSS, משקל מולקולרי: 36,000-50,000 Da) פתרון על ידי המסת 3 גרם של DSS ב100 מ"ל autoclaved מים. להציע את הפתרון הזה כמי שתייה בלעדיים כלרצונך עכברים ולחשב 5 מ"ל של DSS-פתרון לכל עכבר / יום. המשך Feedעכברי רול עם מים autoclaved ללא כרצונך DSS 9.
- אינדוקציה של סרטן מעי גס
- לפזר azoxymethane mutagenic (AOM) (זהירות! עלול לגרום לסרטן ולנזק גנטי!) בתמיסת מלח איזוטוני סטרילי כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל. החל מנה בודדת של AOM 10 מ"ג לכל קילוגרם משקל גוף תוך peritoneally באמצעות מזרק 1 מ"ל (30 G) 10.
- עכברי אתגר (לא כולל עכברי שליטה) עם מחזורים חוזרים ונשנים של 3% (w / v) DSS מיום 0 עד 7, יום 14 עד 21, יום 28-35 ויום 42-49 לגרום cancerogenesis מעי גס דלקתי מונע. להאכיל את העכברים במי autoclaved רק בין אתגרים אלה (ראו איור 4 א ללוח זמנים מפורטים). להאכיל את עכברי שליטה במי autoclaved לאורך כל הניסוי.
- הכנת אנדוסקופיה הקרינה (FE)
- שימוש והעמסת-Isothiocyanat (FITC) - (משקל מולקולרי 70,000 Da; FITC: גלוקוז = 1: 250) dextran לdetection של אדנומה במעי הגס על ידי שיפור חזותי של תבנית כלי דם דיספלזיה קשורה.
- לנהל dextran FITC- מצומדות 60 מ"ג המדולל ב100 μl PBS הווריד 5 דקות לפני הבדיקה אנדוסקופית הקרינה.
- הרדמה
- לספק אספקת isoflurane רציפה עבור הרדמה (1.5 LO 2 / דקה; isoflurane 1.5-2 כרך% [2-כלורו-2 (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן]). השתמש בציוד הרדמה וטרינרים מיוחד עם facemask לשלוט בחוזקה הרדמה.
- הכנה של חוקן
- להחדיר 2 מ"ל של נוזל חוקן (תוכן: hydrogenphosphate Disodium 1.5% (w / v) ונתרן dihydrogenphosphate 11% (w / v)) לתוך המעי הגס אם טעינת צואה משמעותית חשודה שעלולות לטשטש את הראייה.
.2 ציוד טכני
- השתמש בתחנת עבודה אנדוסקופית וטרינרים שפותחה ואושרה לשימוש באנדוסקופיה בעלי החיים הקטן. חבר את ווrkstation ליחידת מצלמה, מקור אור קסנון, משאבת אוויר ולצג מחשב קונבנציונלי לאנדוסקופיה אור הלבנה. לאחר מכן לחבר את המצלמה וטלסקופ מיניאטורי הנוקשה (קוטר 1.9 מ"מ חיצוני, אורך סנטימטר 10; איור 5).
- השתמש בנדן אנדוסקופ עם הערוץ חוזר (איור 5D) ליישום של מלקחיים ביופסיה או צינור הזרקה. השתמש בנדן בלי לעבוד ערוץ לקולונוסקופיה אבחון.
- קבע את תצורת ההגדרות של מקור האור לאנדוסקופיה הקרינה לרגש קליעים נותבים בשימוש (לדוגמא, 490 ננומטר לdextran FITC- מצומדות). בנוסף, לשלב מסנן bandpass ראוי בין הטלסקופ והמצלמה (לדוגמא, 525 ננומטר לdextran FITC- מצומדות).
- הכנס מלקחיים גמישים ביופסיה (3 charr., 28 סנטימטר) דרך ערוץ העבודה של אנדוסקופ לקבל ביופסיות.
- להציג את צינור הזרקה גמישה (0.96 מ"מ) דרך ערוץ העבודה לאקטואלית, intramucosal או endoluminaldministration של סוכני אבחון או טיפול.
- להשתמש בטבלת בדיקה מחוממת עם טמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. זה מונע עכברים הופכים היפותרמיה בזמן הבדיקה.
.3 הרדמה של בעלי חיים
- הנח את העכבר בקופסא קטנה אך leakproof ולנהל isoflurane (100% (v / v), 5% כרך, 3 L / min). חכה עד שהעכבר מאבד את הכרתו.
- העבר את העכבר על שולחן הבדיקה לאנדוסקופיה. המשך שאיפת isoflurane באמצעות מסיכת פנים עם נ מינון 100% / v, 1.5% כרך, 1.5 ליטר / דקה. תמיד להחיל משחה העין כדי למנוע יובש בעיניים בזמן שתחת הרדמה.
- להעריך את היעילות של הרדמה על ידי בדיקת רפלקסים. בדוק את 'להסתובב רפלקס': אם מורדם מספיק, עכבר שוכב על הגב שלה לא צריך להסתובב. בדקו את "הבהונות רפלקס ': כאשר ההרדמה היא נאותה, רך צובטת בין אצבעות רגליו של בעל החיים לא צריך להוביל לנסיגה של רגל (שלב שלסובלנות כירורגית).
.4 קולונוסקופיה
- הנח עכבר הרדים נוטה / על הגב שלה על שולחן הבדיקה.
- לנהל 2 מ"ל של חוקן באמצעות צינורית מכופתרת לתוך המעי הגס אם טעינת צואה משמעותית חשודה שעלול לטשטש את הראייה. חכה לעכברים לעשות את הצורך לאחר מתן החוקן. הכנס את אנדוסקופ מאוד בזהירות כדי להימנע מניקוב.
- פתח את שני השסתומים של הנדן עם אחד מהם להיות מחובר למשאבת האוויר. לאטום את השסתום האחר עם אצבעך לוותר אוויר. לנפח מעי גס עם אוויר, לאט ובזהירות, במיוחד במקרה של ביופסיה או הזרקה.
- לקדם אנדוסקופ רק עד כפף מעי הגס הזכות להימנע מניקוב (4-5 סנטימטר מטבעת).
- קולונוסקופיה לאבחון
- לבחון את הרירית לשינויים דלקתיים או ממאיר תוך משיכת בחזרה אנדוסקופ. משוך לאחור באיטיות על מנת להעריך את כל היקפו של המעי. להעריך pa intraluminalthologies באמצעות מערכות ניקוד הוקמו מתאימות כנדרש.
- כדי להצדיק את עמדת אנדוסקופית זהה לרכישת תמונה בפריטים החזותיים חוזרים ונשנים של אזורי פצע, לב המרחק בין פי הטבעת העכברית והנגע ברירית. יתר על כן, להשתמש בקצה של המלקחיים הביופסיה כspacer כדי להשיג מרחק זהה בין אזור הפצע במהלך רכישת תמונת אנדוסקופ ו. גודל הפצע קשור לגודל של נדן אנדוסקופ, הכולל 3 מ"מ.
הערה: אנדוסקופ מקום בעמדה זהה בהשוואה אופטית עם תיעוד תמונה של בדיקות קודמות. נגעי מדד באותה הזווית ומרחק בכל מעקב בדיקה אנדוסקופית.
- הליך ביופסיה
- קח ביופסיות בעזרת שני חוקרים. להציג את המלקחיים הביופסיה בזהירות דרך הערוץ עובד עד קצה המלקחיים גלוי על הצג לחוקר השני. פתיחה וסגירה של מלקחיים בזהירות כדיניקוב חלל.
- הזז מלקחיים לאתר של פתולוגיה.
- הליך הזרקה
- לבצע הליך הזרקה בעזרת שני חוקרים. צינור טרום מילוי הזרקה גמישה (0.96 מ"מ) עם הסוכן לחלוטין להינתן. לדחוף צינור דרך הערוץ עובד עד הצינורית (30 G) היא נראה על הצג לחוקר השני. הכן את המזרק העדין ובעדינות לנהל את הסכום המבוקש סוכן אבחון או טיפול של. כרכי הזרקה צריכים להיות 50 מרביים μl.
- הכנס את המחט לתוך submocosa בזווית של 15-30 מעלות. פנים שפוע בכיוון של הרירית. רירית תערוכות הרמת סימן אופייני לאחר זריקה מוצלחת.
- אנדוסקופיה הקרינה (FE)
- לנהל dextran FITC- מצומדות 60 מ"ג המדולל ב100 μl PBS לווריד לפני בדיקת הקרינה אנדוסקופית.
- בדוק את נקודת הזמן האופטימלית בין ההזרקה שלנותב ניאון שכותרתו והליך ההדמיה שתלויה בפרמקולוגיה נותב. קביעת תצורה של הגדרות של מערכת סינון bandpass בהתאם לאורך גל עירור ופליטה של נותב בשימוש. לבצע אנדוסקופיה הקרינה לקליעים נותבים נפח דם שאינם ספציפיים (לדוגמא, FITC) מייד לאחר הזרקה תוך ורידית של צבע הניאון כדי להעריך את הדפוס של כלי הדם של פני השטח הרירי.
- לשקול הדמיה כמה שעות לאחר יישום נותב במקרה של קליעים נותבים ממוקדים או "בדיקות חכמות 'כדי לספק יעד טוב יותר לרקע יחס.
- לבצע תיעוד וידאו פוטו ושל התוצאות.
.5 Post-קולונוסקופיה
- הפרד את העכבר בכלוב ריק ולהניח אותה על מגבת נייר כדי להגן על העכבר מaspirating ההמלטה. לחמם את העכבר עם מנורת Redlight כדי למנוע היפותרמיה. שים לב לעכבר ולא להשאיר ללא השגחה עד שהוא חזר מספיקתודעה לשמור כיבתה sternal. ברגע שמודע לחלוטין, במקום את העכבר חזרה לכלוב שלו בהתאמה.
- בסופו של ניסוי, עכבר מקום בקופסא קטנה אך leakproof ולנהל CO 2 (100% (v / v), 100% כרך, 3 L / min). חכה עד שהעכבר מאבד את הכרתו מלאה ועוצר נשימה. עכבר שדר על ידי שבר צוואר. בצע laparotomy הבטן וexplant המעי הגס. פתח את המעי הגס אורכים או לשטוף אותו להערכה היסטולוגית או מולקולרית נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניטור vivo של ריפוי פצע במעיים
במהלך אנדוסקופיה שגרתית, פצעים ברירית היו מושרה באופן מכאני על ידי מלקחיים זעירים ביופסיה בקוטר של 3 צרפתי (שווה 1 מ"מ; איור 1 א). בהמשך לכך, ריפוי פצעים היה במעקב על ידי בדיקות אנדוסקופיות יומיות ולכמת על ידי מדידה של השטח שיורית פצע באמצעות תוכנה לעריכת תמונות, למשל, ImageJ (איור 1). סגירת הפצעים בודדת לאורך הזמן מתבטאת במנה של אזור פצע בפועל / אזור פצע ראשוני. לדוגמא, ביום 3 אחרי דור פצע, 41% ± 4.1% מאזור הפצע התאוששו, ואילו ביום 7 הפצע בדרך כלל נרפא לחלוטין (תרשים 1C). בנוסף, בסוף הניסוי, ניתן עברו כריתת פצעים להערכה היסטולוגית ex vivo. מתוארות הם תמונות מייצגות של hematoxylin ו eosin (H & E) -stained מיטות פצע בday 0 ויום 5 (1D איור).
טיפול הזרקה intramucosal מודרך אנדוסקופיה
ליישום intramucosal של סוכנים תרופתיים, צינור גמיש (בקוטר של 0.96 מ"מ) עם צינורית קבועה עד הסוף (30 G) הוצג לערוץ העבודה של אנדוסקופ (איור 2 א). לאחר מיקום intramucosal של המחט, למקסימום של 50 μl הוזרק בזהירות. מעיד על יישום intramucosal המוצלח, הסרת רירית המעי הגס ניתן להבחין בקלות macroscopically (תרשים 2B, C).
בהערכת vivo של קוליטיס הניסיוני
לאחר האינדוקציה של קוליטיס, עכברים הראו ירידה במשקל מיום 3 בהפסד מרבי של משקל גוף של 19% המתרחשים ביום 7 (איור 3 א). בנוסף למדידה יומית של משקל גוף, פעילות מחלה הייתה פיקוח על ידי endoscopies ומקרוסקופית חוזר על עצמו כימות של דלקת במדד אנדוסקופית העכברי של חומרת קוליטיס (MEICS). בהתאם לאובדן משקל גוף, ציון MEICS הוגדל ביום 7 לאחר תחילת DSS המציין נזק דלקתי מאסיבי של רירית המעי הגס, שלהשתפר ביום 13 (איור 3 ב). למתאם vivo לשעבר של נזק היסטולוגית, שינויים דלקתיים של סעיפים מוכתמים-E H & מעי הגס היו לכמת לפי Dieleman ציון 11. ביום 7 לאחר תחילת DSS, נזק היסטולוגית היה גבוה באופן משמעותי בעכברים שטופל DSS השוואה לקבוצת ביקורת שבאו לידי ביטוי על ידי denudation אפיתל, כיבים ברירית כמו גם חדירת נויטרופילים גדלו והשתפרו באופן משמעותי ביום 13 (איור 3 ג, ה). בנוסף, ערכה היסטולוגית של ביופסיות ריריות, באופן שיגרתי שהושגו במהלך בדיקות אנדוסקופיות, אימתה את השלב המתקדם של קוליטיס ביום 7 (איור 3F-H).
כ 80 ימים לאחר אינדוקציה גידול על ידי AOM ושלושה מחזורים של DSS (איור 4 א), גידולים מרובים במעי הגס (איור 4C) כמו גם סימנים מקרוסקופית של דלקת כרונית כגון רירית מגורען (איור 4) 10 נצפו אנדוסקופים. הערכה היסטולוגית של גידולי מעי גס על ידי צביעת H & E חשפה אדנומות עם ובלי neoplasia intraepithelial בדרגה גבוהה. לכן, AOM-DSS-המודל דומה למודל מושלם ללמוד תהליכים מולקולריים של סרטן 12, כמו גם להעריך את מכשירי אבחון חדשים 13. דימות פלואורסצנטי מיקוד מולקולות ספציפיות מאפשרת בתחום ההדמיה מולקולרית vivo 'שיטות צילום' 14,15 עם. כדי להדגים היתכנות של FE, השתמשנו FITC, fluorochrome בשימוש נרחב. לגילוי FITC ספציפי, בשילוב מערכת סינון bandpass עם l אורך גל מקור ight סיפק עירור ספציפי נחוץ (490 ננומטר; איור 4D). לאיתור מדויק של אורך גל FITC הספציפי פליטה (525 ננומטר), מסנן bandpass שני התערב בין ראש המצלמה ואנדוסקופ (איור 4E). FE ללא יישום נותב לא לזהות כל אות ספציפית ולא אינטראקציה עם רקמת מעי הגס או autofluorescence בצואה (איור 4F, G). בניגוד לכך, מייד לאחר יישום תוך ורידי של FITC-dextran, fluorochrome יכול להיבחן ברירית המעי הגס ועשוי לשמש להערכה של כלי דם מוגברים באזורים של דלקת כרונית (איור 4H), כמו גם רירית ממארת (איור 4I). בהתאם לכך, כימות של עוצמת הקרינה על ידי תוכנה לעריכת תמונות הראתה גדילה באופן משמעותי את ספיגת של fluorochrome בתוך רקמה ממארת בהשוואה לרירית מעי הגס שאינו מושפעת (איור 4K).
"Jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 1 ניטור אנדוסקופי של אפיתל ריפוי פצע בגוף חי, כמו גם הערכה כמותית והיסטולוגית של ריפוי פצע. אחרי הדור של פצעים במעי הגס, גבול פצע וסגירת פצע ניתן לאתר בקלות. אזור הפצע (חיצים לבנים) מוערך ביום endoscopies מעקב כדי לעקוב אחר ריפוי פצע אפיתל כמותית (- ג) Ex vivo, פצעים שעברו כריתה וH & E-מוכתם לניתוח היסטולוגית של ריפוי פצע (ד ').. סולמות מוגדרים על ידי סרגל קנה מידה מתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מחדש 2 "FO: = תוכן ברוחב" 5in "src =" / קבצים / ftp_upload / 51,875 / "width =" 51875fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2 אנדוסקופיה מודרכת intramucosal טיפול הזרקה. תחת בקרה חזותית, קצה המחט () ממוקם בשקט לתוך רירית המעי הגס ו50 μl של חומרים מומסים מוזרק (B). בהמשך לכך, הרמת רירית מסומנת יכולה להיות מוכר (כוכבית) ללא כל סימנים של דימום חריף (C). סולמות מוגדרים על ידי סרגל קנה מידה מתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכת .3 אנדוסקופי איור של הקורס של קוליטיס DSS הניסיוני. כמובן של קוליטיס היה להעריךד על ידי שינויים במשקל גוף, בדיקות אנדוסקופיות כמו גם ניתוח היסטולוגית של חלקים במעי הגס מודלקים וביופסיות אנדוסקופיות. בקו אחד עם אובדן מסיבי של משקל גוף ונזק היסטולוגית מתקדם ביום 7 (A, C, E; 10X הגדלה), בדיקות אנדוסקופיות והערכה היסטולוגית של ביופסיות שהושגו מתוארות סימנים של דלקת חמורה (B, D, G, H; הגדלת 5X ו10X) ואילו ביום 13 לאחר DSS להתחיל שינויים דלקתיים היו להשתפר באופן משמעותי. סולמות מוגדרים על ידי סרגל קנה מידה מתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Fiהתרשים 4 FE של גידולי מעי גס. לאחר האינדוקציה של cancerogenesis מעי הגס על ידי AOM וממשל DSS מחזורי ל11 שבועות (), זוהתה רירית מגורען אנדוסקופיה אור הלבנה מעידים על דלקת המעי הגס כרוני (B) ונגעי endoluminal רבים (C), אשר אובחנו כ אדנומות עם neoplasia intraepithelial בדרגה גבוהה על ידי צביעת H & E ex vivo (G). בעוד ההדמיה של דלקת כרונית (H) וגידולים (I) הייתה בקלות אפשרית באמצעות FE ממוקד FITC, FE ללא יישום נותב לא לאפשר זיהוי גידול סופי (F, G). בהתאם לכך, כימות של עוצמת הקרינה הייתה גדלה באופן משמעותי בתוך רקמה ממארת בהשוואה לרירית מעי הגס שאינו מושפעת, שמוצגת על ידי פרופילים בקנה מידה אפורים (E, F). כדי לעבור למצב הקרינה במהלך colonoscop אור הלבןy, מסנן bandpass ספציפי מחובר בנוסף למקור קר האור כדי לספק את גל העירור הספציפי (לדוגמא, 490 ננומטר עבור FITC; D). מסנן זה מאפשר מיתוג (חץ לבן) בין מצבי אור הלבנים וקרינה (ד '). כדי ללכוד את פליטת הגל הספציפי (לדוגמא, 525 ננומטר עבור FITC), מסנן bandpass שני התערב בין אנדוסקופ וראש המצלמה באמצעות משותפת כידון (E). סולמות מוגדרים על ידי סרגל קנה מידה מתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 הגדרה ניסויית של תחנת עבודה אנדוסקופית. תחנת העבודה אנדוסקופית (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ריפוי פצעי אפיתל הוא תהליך מתמשך. קילוף פיסיולוגי מתמשך של תאי שטח בתוך הרירית של הקיבה והמעיים מתרחש דורש התחדשות תכופה של תאי האפיתל 16. כתוצאה מכך, יש ריפוי פצע לקוי השפעה עצומה על מספר מחלות, כולל כיבים במערכת העיכול ודליפה 17 בהשקה 18. הערכת רקע מולקולרי, כמו גם לתרופות פוטנציאליות כדי לעורר ריפוי האפיתל יכולה להתבצע רק באופן חלקי במערכות תרבית תאים במבחנה 19,20. לפיכך, יש צורך בהגדרות ניסיוניות מתוחכמות יותר כגון קולונוסקופיה עכברית עם דור מפצעים ברירית שהוגדרו על ידי מלקחיים ביופסיה כדי לאפשר הערכה אמינה in vivo של ריפוי פצע במערכת העיכול ועל מנת להעריך אינטראקציות אפשריות בין דלקת מעיים ותהליכי ריפוי פצע.
בנוסף, מחט זריקה עשויה לשמש לליטרממשל intramucosal ocal של צבעים לאבחון או לתרופות פוטנציאליות. זה יכול להיות מושגים באמצעות צינור גמיש (בקוטר של 0.96 מ"מ) עם מחט קבועה עד הסוף יכול להיות מוצג דרך ערוץ העבודה. בהתחשב בכך שסוכן מבחן, כמו גם את שליטת פלצבו עשוי להיות מועברת בנגעים דלקתיים או גידולים נפרדים בתוך אותה החיה, גישה זו מספקת יתרון באמינות בהשוואה להגדרות ניסוייות מסורתיות. יישום נוסף של זריקות מקומיות הוא ההשתלה של תאים סרטניים אנושיים או עכבריים ליצירת גידולי orthotopic במעי הגס העכברי 21.
מודלים עכבריים של קוליטיס יש צורך להבהיר הפתופיזיולוגיה כמו גם כדי להעריך סוכנים טיפוליים פוטנציאליים preclinically. לכן, ניטור מדויק של מהלך המחלה הוא בעל חשיבות עליונה. כמקובל, חומרת המחלה היא בדרך כלל שהוערכה על ידי פרמטרים עקיפים כמו משקל גוף, בדיקות haemoccult כמו גם ניתוחשל דם וצואה. בניגוד לכך, קביעה ישירה של חומרת קוליטיס לעתים קרובות מוגבלת לנתיחה שלאחר מות ניתוח היסטולוגית, המחייב את מותו של בעל החיים. עם זאת, קולונוסקופיה העכברית מציעה להדמיה ישירה של רירית המעי הגס של עכברים חיים. יתר על כן, ניטור ישיר וחוזר על עצמו לתכונות של קוליטיס הוא אפשרי, שבו הוא נחוץ במודלים ניסיוניים עם תחילת מחלה הומוגניות, למשל, IL-10 עכברים חסרים או במודל של transfercolitis בעכברי RAG-לקוי. כתוצאה מכך, מדד אנדוסקופי עכברי של קוליטיס כבר נקבע 6 המאפשר כימות אובייקטיבי של דלקת ברירית ובדיקות מעקב סדרתי של אותו בעל החיים.
בהקשר של סרטן מעי גס, קולונוסקופיה מציעה הזדמנויות מועילות שונות. לדוגמא, בניגוד לשיטות לא פולשנית, אנדוסקופיה היא הגישה הראשונה, כדי לאפשר בנחישות vivo של גודל גידולומספרי גידול. יתר על כן, השימוש בphotoprobes ניאון מיקוד מולקולות ספציפיות מאפשר הדמיה וכימות של תהליכים מולקולריים. במחקר שבוצע על ידי אל translational Foersch et. מיקוד ספציפי של ביטוי VEGF ברירית מעי הגס ממארת הוצג להיות ריאלי ועשוי לשמש לאפיון נגע וחיזוי של תגובה לטיפול בחולים עם סרטן המעי הגס אנושיים 22. יתר על כן, מידע הנובע מגישת הדמיה מולקולרית זה ייתכן שתוכל להיות מתורגם לשימוש בחולים אנושיים. היכולת זו תאפשר אפיון חי של נגעים חשודים באנדוסקופיה. לבסוף, מה שנקרא סגוליות "בדיקות חכמות 'גידול של קליעים נותבים אלה על ידי הפעלה של fluorophores על ידי תהליכים אנזימטיים בצד של הנגע הממוקד 23.
בעת ביצוע אנדוסקופיה עכברית, צעדים מסוימים של הפרוטוקול הנתון קריטיים במיוחד. לדוגמא, מו שונהזני שימוש שונים ברגישות שלהם להרדמה וריכוזי DSS. לכן ייתכן שיהיה צורך בפרוטוקול זה כדי להיות מותאם להגדרות מקומיות. יתר על כן, ניסיון בביצוע בדיקות אנדוסקופיות וידע של האנטומיה עכברית מדויק נדרש לבצע אנדוסקופיה העכברית אופטימלית כי הוא בטוח ומונחה מטרה. בהתייחס למגבלות אפשריות של טכניקה זו, אנו מדגישים כי מערכת אנדוסקופ המשמשת היא נוקשה, ולכן מגבילה את ההליך למעי הגס ככל כפף תקין. יתר על כן, רוב fluorochromes הישים עבור FE כרגע נבחנים לגבי פרופיל הבטיחות שלהם, ולכן בזמן שהועמד לרשות לימודים עכבריים, עדיין לא אושר לשימוש בחולים אנושיים.
להלן שלבים קריטיים הנוגעים לפרקטיקה של ההליך: (1) מאז רגישות לDSS קוליטיס מושרה עשויים להשתנות בין זנים שונים, האינדוקציה של קוליטיס החריף DSS עשויה לסכן את מותם של בעלי החיים אם יש עו"דחומרת anced של קוליטיס. לכן, כדאי לשקול הערכה כמה ריכוזי DSS לזהות המתאים ביותר לזן בודד ותצווה DSS הספציפי בשימוש. בדיקה אנדוסקופית עלולה להיות קשה בנוכחות המוני שרפרף intracolonic הגדולים. גרימת פעולת מעיים לפני ההליך באמצעות יישום רקטלית של 2 מ"ל של נוזל חוקן באמצעות צינורית מכופתרת תשפר את נראות אם טעינת צואה משמעותית חשודה שעלול לטשטש את הראייה. אם שיעורי ניקוב גבוהים במהלך הביופסיה להתרחש, להקטין אספקת אוויר למעי הגס לפני קבלת ביופסיות ריריות ולהפחית לחץ של המלקחיים ביופסיה על פני השטח הרירי לפני סגירת הסניפים.
יחדיו, בניגוד לשיטות קונבנציונליות להערכת פעילות מחלה של קוליטיס או cancerogenesis הניסיוניים על ידי פרמטרים עקיפים כמו משקל גוף, התרחשות של דם בצואה, ניתוח של דם היקפי או ניתוח היסטולוגית לאחר המוות, סוףטכניקות מבוססות oscopy לאפשר ניטור חי של מהלך מחלה עם ההזדמנות לבצע ביופסיות תחת שליטה חזותית. בנוסף, ריפוי פצע והשפעה טיפולית של תרופות פוטנציאליות למריחה על העור עשוי להיות מוערך in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לסוניה Dufentester ואלקה וובר לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים Faekah גוהר להגהה את כתב היד וסטפן ברוקנר לתמיכת מידע רפואי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בינתחומי מ- קרונות-Fresenius-Stiftung השאר (2012_A94). ד Bettenworth נתמכה על ידי מענק מחקר מהפקולטה לרפואה, Westfälische Wilhelms-Universität מינסטר. מ 'ברוקנר נתמכה על ידי עמדה סיבובית "Gerok" של (DFG SFB1009B8). אנו מודים ליקה בלום להמחשה של הקריקטורה העכבר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al.
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H.
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
