Summary
Küçük hayvan görüntüleme teknikleri seri tetkikler ve in vivo terapötik müdahaleyi sağlar. Son zamanlarda, uygulamaların kapsamı önemli genişletmiştir ve şu anda kolon tümör gelişiminin değerlendirilmesi, yara iyileşmesi ve enflamasyon izleme içerir. Bu protokol kemirgen endoskopi bu çeşitli potansiyel uygulamaları göstermektedir.
Abstract
Fare modeller yaygın insan hastalıkların oluş çalışma ve klinik öncesi tanı usullerinin yanı sıra terapötik girişimlerin değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, patolojik değişimlerin geçerli değerlendirme genellikle histolojik analizini gerektirir ve ex vivo olarak gerçekleştirilen zaman, hayvanın ölümü gerektirir. Bu nedenle, geleneksel deneysel ortamlarda, birey-içi izlem muayeneleri nadiren mümkündür. Dolayısıyla, canlı farelerde kemirgen endoskopi ortaya çıkışı ile mide-bağırsak mukozası ve aynı zamanda görsel değişiklikler izlemek için prosedürü tekrarlayın hem ilk kez araştırmacılar sağlar. In vivo kemirgen endoskopi birçok uygulamaları, bağırsak iltihabı veya yara iyileşmesini okuyan defalarca mukozal biyopsilerin dahil olmak üzere mevcut ve yerel minyatür enjeksiyon kataterlerinden tanısal veya terapötik ajanlar yönetmek. En son, moleküler görüntüleme genişletmiştir tanısal görüntüleme moBelirli photoprobes kullanarak farklı hedef moleküllerin saptanmasına olanak tanıyan spesifik, şekilleri. Sonuç olarak, kemirgen endoskopi in vivo görüntüleme tanı deneysel için yeni bir son teknoloji olarak ortaya çıkmıştır ve önemli ölçüde çeşitli alanlarda preklinik araştırma etkileyebilir.
Introduction
Hayvan modelleri büyük ölçüde sayısız bağırsak patolojileri anlayışımızı zenginleştirilmiş. Laboratuvar faresi (Mus musculus) nedeniyle bol genetik ve genomik bilgiye biyomedikal araştırma bir başbakan hayvan modeli olarak ortaya çıktı ve transgenik ve nakavt suşları kolayca kullanılabilir etti. Anlayış hastalık patogenezini artırmaya ek olarak, hayvan modelleri de önemlisi ilaç adayları gibi klinik öncesi teşhis ya da tedavi müdahale test edilmesi için kullanılır. Ancak, insan hastalığı taklit fare modellerinin çeşitliliği rağmen, rutin hasta bakımında kullanılan birçok tanısal ve girişimsel seçenekleri fareler için mevcut değildir. Buna göre, gözetim stratejiler genellikle dolaylı gözlemlere sınırlıdır kemirgen hastalığı veya terapötik müdahalelerin etkisinin seyrini izlemek ya da ölüm sonrası analizleri yayınlamak için. Non-invaziv girişimler izleme fareler için hastalık aktivitesi endeksleri gibi canlılık mevcut iken, qukilo kaybı veya kazancı, kan, idrar ve dışkı antification bu sadece dolaylı göstergeleri ve bireyler arası değişkenliğin tarafından önyargılı, analiz eder. Ayrıca, otopsi tekrarlı zaman noktalarında boyuna gözlemler önlemek analiz eder. Sofistike görüntüleme teknikleri sadece son 1,2 getirilmiştir farelerde hastalık aktivitesini izlemek için. Bu görüntüleme teknikleri tekrarlanan analizler için izin olsa da, onlar doğrudan mukozal görselleştirme izin veya biyopsi satın alma veya ilaç adayları topikal ve intramukozal uygulama olarak tanısal veya tedavi edici girişimler izin vermez, bağırsak üzerinde bir açıklayıcı ve genellikle özensiz bir görünüm sağlar.
Son zamanlarda, canlı farelerde kullanım için yüksek çözünürlüklü endoskopi sistemleri 3,4 geliştirilmiştir. İlk defa bu endoskopik teknikler, yara iyileşmesi veya bağırsak iltihabı sağlayan obj olarak Endoluminal kolon hastalık patolojilerinin doğrudan görselleştirme izintekrarlanan zaman noktalarında aynı hayvanın uzunlamasına çalışmalar sağlayan ci, gerçek zamanlı durum. Yanı sıra tekil bir fare tekrarlanmıştır biyopsiler izin vermek veya endoskopik tedavi edici sistemler aynı zamanda ilgi alanı, bir maddenin doğrudan uygulanmasını sağlayan bir ayrı tümör veya lokalize iltihabı etkilemek için kullanılabilir. Tedavi ve kontrol maddeleri ilgi alanına doğrudan teslim edilebilir, bunun için bireyler arası değişkenliğin hariç, aynı fare gerçekleştirilebilir. Bu sistemler artık bu tür kolit şiddeti (MEICS) 5-7 kemirgen endoskopik indeksi gibi kolon iltihabı, yara iyileşmesi, laparoskopik karaciğer biyopsisi ve çeşitli skorlama sistemleri kullanılarak karaciğer tümörleri 8 ve tümör gelişiminin ortotopik indüksiyon değerlendirilmesi için istihdam edilmiştir. Kolon duvarının kalınlaşması, vasküler desen değişiklikleri, fibrin varlığı, MUCOS bir ayrıntı: MEICS iltihabı değerlendirmek için beş parametreden oluşmaktadıral yüzey, ve dışkı kıvamı.
Bu protokolde, bağırsak yara iyileşmesi, enflamasyon ve kolon kanseri olan kemirgen modellerinde katı endoskopi kullanılmasını tarif eder. Öncelikle, biz yara iyileşmesi ve inflamatuvar barsak endoskopik değerlendirme yanı sıra kolit aktivite boyuna değerlendirilmesi ve kemirgen kolon karsinogenezi çalışma göstermektedir. Kemirgen endoskopi tanımlayıcı kullanımının ötesinde, biz biyopsisi almak için endoskopik enstrümantasyon kullanımı hakkında ayrıntılı yönergeler sağlar ve farklı ilgi bileşenleri (örneğin, ilaç adayları veya tümör hücrelerinin) topikal ve intramukozal uygulama. Son olarak, kolorektal tümörlerin ortamda gelişmiş moleküler görüntüleme teknikleri kullanılır sıçangil floresan endoskopi kullanımını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Alman Hayvanları Koruma Kanunu'na göre Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemeler ve Deney Düzeneği
- Hayvan bakım
- 20 ila 25 gr ağırlığında herhangi bir zorlanma kadın ya da erkek fareler kullanın ve yerel hayvan bakımı mevzuatına göre bunları barındıracak.
- Kemirgenler için özel diyeti ile fareler Yem ve yonca-ücretsiz yemi uygulamak en az üç gün Endoluminal otomatik floresan en aza indirmek için sınavlara floresan önce.
- Otoklavlanmış içme suyu ad libitum sağlayın.
- DDS ile indüklenen akut kolit indüksiyonu
- Su otoklavlanmış, 100 ml DSS, 3 g çözülerek çözelti: dekstran sülfat sodyum (DSS Da 36,000-50,000 moleküler ağırlık) (ağ / hac) bir% 3 hazırlayın. Fareye gerektiğinde özel içme suyu olarak, bu çözüm sunar ve fare / günde DSS çözeltisi 5 ml hesaplar. Yem devamDSS istenildiği 9 olmadan otoklavlanmalıdır su ile rol farenin.
- Kolorektal kanserin başlaması
- Mutajenik azoksimetan (AOM) çözündürün (kanser ve genetik hasara neden olabilir DİKKAT!) Steril izotonik tuz çözeltisi içinde 1 mg / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. Vücut ağırlığı intraperitoneal olarak 1 ml şırınga (30 g), 10 kg ile 10 mg AOM tek bir doz uygulanır.
- 21'den% 3 ila 7 gün, 0 (ağ / hac), DSS, gün 14, tekrarlı devreler, gün 28-35 ve 42-49 gün ile (kontrol farelerinde hariç) Görev farenin enflamatuar tahrik kolorektal karsinogenezi tetiklemek için karıştırılabilir. Sadece bu zorluklara (ayrıntılı bir zaman çizelgesi için Şekil 4A) arasında Otoklavlanmış su ile fareler besleyin. Deney boyunca Otoklavlanmış su ile kontrol fareler besleyin.
- Floresan endoskopi hazırlanması (FE)
- Kullanım Flüoresanla Isothiocyanat (FITC) -, dekstran (molekül ağırlığı 70.000 Da moleküler FITC: Glukoz = 1: 250) için deterjanlarıdisplazi ilişkili vasküler desen görsel iyileştirme ile kolon adenomu avranış.
- Intravenöz 5 dk floresan endoskopik muayene öncesi 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 60 mg FITC-dekstran yönetmek.
- Anestezi
- (, Hacimce% 1.5-2 izofluran [2-kloro-2-(diflorometoksi) -1,1,1-trifloro-etan] 1,5 Lo 2 / dakika) ile anestezi sürekli izofluran kaynağını temin ederler. Sıkı anestezi kontrol etmek için bir yüz maskesi ile özel bir veteriner anestezi ekipman kullanın.
- Lavman hazırlanması
- Sıvı lavman 2 ml aşılamak (içindekiler: disodyumhidrojenfosfat (w /% 1.5 h) ve sodyum w / v) (% 11 dihidrojen-) kolona önemli dışkı yükleme şüphesi varsa görünümü gizleyebilir ki.
2. Teknik Ekipmanlar
- Geliştirilen ve küçük hayvan endoskopi kullanımı onaylanmış bir veteriner endoskopik iş istasyonu kullanın. Wo bağlayınBir kamera birimi, ksenon ışık kaynağı, bir hava pompasına ve beyaz ışık endoskopi için bilinen bir PC monitörü rkstation. Sonra kamera ve minyatür sert teleskop (Şekil 5 1.9 mm dış çap, 10 cm uzunluğunda) bağlayın.
- Biyopsi forseps veya enjeksiyon tüp uygulaması için çalışma kanalı (Şekil 5D) ile endoskop kılıfı kullanın. Tanısal kolonoskopi için çalışma kanalı olmadan kılıfı kullanın.
- Kullanılmış izleyiciler uyarmak için floresan endoskopi için, ışık kaynağının yapılandırma ayarları (örneğin, FITC ile konjüge edilmiş dekstran 490 nm). Ayrıca, teleskop ve kamera (FITC-dekstran örneğin, 525 nm) arasında uygun bir Avanlanche entegre.
- Biyopsisi almak için endoskop çalışma kanalına esnek biyopsi forseps (3 Charr., 28 cm) yerleştirin.
- Topikal, intramukozal için çalışma kanalına esnek enjeksiyon tüp (0.96 mm) tanıtmak veya Endoluminaldiagnostik veya terapötik madde arasında dministration.
- 42 ° C'lik bir sıcaklık ile ısıtılabilen bir muayene masası kullanın. Bu farenin muayene sırasında hipotermik hale önler.
Hayvanlar 3. Anestezi
- Küçük ama sızdırmaz kutu içinde fare ve yönetmek izofluran (% 100 (h / h),% 5 hacim / dak 3 L). Fare bilincini kaybedene kadar bekleyin.
- Endoskopi için muayene masasının üzerine fare aktarın. Bir doz 100% v / v, 1.5 hacim,% / dk 1.5 L yüz maskesi ile izofluran teneffüs devam edin. Her zaman anestezi altında iken göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi uygulanır.
- Refleksleri kontrol ederek anestezi etkinliğini değerlendirmek. 'Refleks dönüş' Giriş: yeterince anestezi ise, sırtında döşeme fare etrafında çevirmek gerekir. Kontrol 'ayak refleks': anestezi yumuşak bacak çekilmesi (evresine yol açmamalıdır hayvanın ayak arasındaki kısma, yeterli zamancerrahi tolerans).
4. Kolonoskopi
- Muayene masasına sırtını / anestezi fare eğilimli yatıyordu.
- Önemli dışkı yükleme görünümü gizleyebilir olduğu şüphesi varsa kolona düğmeli kanül aracılığı ile lavman 2 ml uygulayın. Farenin lavman uygulanmasından sonra arınmak için bekleyin. Perforasyonunu önlemek için çok dikkatli endoskop yerleştirin.
- Bunlardan biri hava pompasına bağlanır kılıfın her iki vanalarını açın. Havayı dağıtmak için parmağı ile diğer vana kapatılmalıdır. Özellikle biyopsi veya enjeksiyon durumunda, yavaş ve dikkatli bir şekilde, hava ile kolon şişirmek.
- Perforasyon (makattan 4-5 cm) önlemek için sağ kolon eğrilme gibi sadece kadar endoskop ilerlemek.
- Tanı kolonoskopi
- Endoskop geri çekerken, enflamatuar veya malign değişiklikler için mukozayı inceleyin. Bağırsak bütün çevresini değerlendirmek için geri yavaşça çekin. Intraluminal pa değerlendiringerektiği gibi uygun kurulmuş skorlama sistemleri kullanılarak patolojiler.
- Yara alanların tekrarlayan görselleştirme sırasında görüntü alımı için aynı endoskopik pozisyonunu garanti etmek, kemirgen anüs ve mukozal lezyon arasındaki mesafeyi unutmayın. Ayrıca, endoskop ve görüntü alımı sırasında yara bölgesi arasında aynı mesafe elde etmek için bir aralayıcı olarak biyopsi forseps ucunu kullanın. Yara büyüklüğü 3 mm ihtiva endoskop kılıfın büyüklüğü ile ilgilidir.
NOT: Önceki sınavlarda fotoğraf belgeleri ile optik karşılaştırıldığında aynı pozisyonda yerleştirin endoskop. Her biri aynı açı ve mesafe Tedbir lezyonlar endoskopik muayene kadar izleyin.
- Biyopsi işlemi
- Iki araştırıcının yardımı ile biyopsilerin alınması. Forseps ucu ikinci araştırmacıya monitörde görünür oluncaya kadar çalışma kanalına dikkatlice biyopsi forseps tanıtın. Bir dikkatle açık ve kapalı forsepsgeçersiz perforasyon.
- Patolojinin sitesine forseps taşıyın.
- Enjeksiyon prosedürü
- Iki araştırıcının yardımı ile enjeksiyon işlemini gerçekleştirin. Tamamen bir madde ile ön-doldurma esnek enjeksiyon borusu (0.96 mm) tatbik edilecek. Kanül (30 G), ikinci araştırmacı için monitörde görünür oluncaya kadar çalışma kanalına tüp itin. Ince şırınga hazırlayın ve yavaşça teşhis ya da tedavi edici bir maddenin istenen miktarda ilaç. Enjeksiyon hacmi 50 ul yüksek olmalıdır.
- 15-30 derecelik bir açıyla submocosa iğne takın. Mukoza yönünde eğim Yüz. Mukoza başarılı enjeksiyondan sonra bir karakteristik kaldırma işareti gösterir.
- Floresan endoskopi (FE)
- Intravenöz önce endoskopik muayene floresan 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 60 mg FITC-dekstran yönetmek.
- Enjeksiyonu arasındaki optimum zaman noktasını kontrol edinfloresan etiketli izleyici ve izleyici farmakoloji bağlıdır görüntüleme yöntemidir. Kullanılan tracer eksitasyon ve emisyon dalga boyunda uygun olarak bant geçiş filtresi sistemi ayarlarını yapılandırır. Mukoza yüzeyinin vasküler dağılımını değerlendirmek için hemen floresan boya intravenöz enjeksiyonundan sonra (örneğin, FITC) ile spesifik olmayan kan hacmi ajanları için floresan endoskopi gerçekleştirin.
- Background-oranı daha iyi hedef sağlamak için hedeflenen izleyici ya da 'akıllı prob' durumunda izleyici uygulamadan birkaç saat sonra görüntüleme düşünün.
- Sonuçların fotoğraf ve video belgeleri gerçekleştirin.
5. Post-kolonoskopi
- Boş bir kafes içinde fare ayırın ve çöp aspire gelen fareyi korumak için bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu. Hipotermi önlemek için redlight lamba ile fare ısıtın. Fareyi gözlemleyin ve yeterli kavuşana kadar sahipsiz bırakmayınbilinç sternum yatma korumak için. Tamamen bilinçli kez, geri gelen kafesine fare yerleştirin.
- Ve küçük ama sızdırmaz kutu bir deney, yerleştir sonunda CO 2 (% 100 (h / h), 100 hacimce% 3 L / dk) yönetmek. Fare tam bilincini kaybeder ve nefes durana kadar bekleyin. Boyun kırığı tarafından sevk fare. Karın laparotomi gerçekleştirin ve kolon eksplantasyona. Uzunlamasına kolon açın ve daha fazla histolojik veya moleküler değerlendirme için yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bağırsak yara iyileşmesi in vivo izleme
(Şekil 1A 1 mm'ye eşit) rutin endoskopi sırasında, mukozal yaralar 3 Fransızca çapında minyatür biyopsi forseps mekanik oluşturuldu. Daha sonra, yara iyileşmesi, günlük muayene, endoskopik olarak izlenip, örneğin resim düzenleme yazılımı kullanarak kalıntı yara bölgesinde ölçülmesiyle nicelleştirilmiştir, İmageJ (Şekil 1B). Zaman içinde, bireysel yara kapatma kısmının gerçek yara alanı / ilk yara bölgesinin katsayı ile ifade edilir. 7. günde yara genellikle tam olarak (Şekil 1C) iyileşti ise Örneğin, yara üretilmesinden sonra, 3. günde, yara bölgesinin% 41 ±% 4.1, elde edildi. Buna ek olarak, deney sonunda, yaralar ex vivo olarak, histolojik inceleme için rezeke edilebilir. Hematoksilen ve eozin temsilcisi görüntüler tasvir (H & E) at da yara yatak -stainedy, 0 ile 5 gün (Şekil 1D).
Endoskopi eşliğinde intramukozal enjeksiyon tedavisi
Farmakolojik maddelerin mukoza içi bir uygulama için, uç (30 g) sabitlenmiş bir kanül ile esnek bir boru (0.96 mm çaplı) endoskop (Şekil 2A) çalışma kanalı tanıtıldı. İğnenin, intramukozal yerleştirilmesinden sonra, 50 ul maksimum dikkatlice enjekte edilmiştir. Gösterge başarılı mukoza içi uygulama, kolon mukozası kolayca kaldırılması (Şekil 2B, C), makroskopik olarak gözlemlenebilir.
Deneysel kolit in vivo değerlendirilmesi
Kolit indüksiyonu sonrasında, farenin% 19 gün 7 (Şekil 3A) oluşan vücut ağırlığının maksimum kaybı gün 3 ağırlık kaybı göstermiştir. Vücut ağırlığı günlük yöntemlere ek olarak, hastalık aktivitesi tekrar endoskopik ve makroskopik ile gözlenmiş kolit şiddeti (MEICS) 'nin murin endoskopik indeksi ile inflamasyon ölçümü. Vücut ağırlığı kaybı ile uygun olarak, günde MEICS skoru 13 (Şekil 3B) iyileştirilmesi sağlanmıştır kolon mukozası, büyük bir inflamatuar hasarı gösteren DSS başlamasından sonra 7. günde arttırılmıştır. Histolojik hasar ex vivo korelasyon için, kolon H & E-boyanan kesitler inflamatuar değişiklikler 11 Puan Dieleman göre ölçüldü. DSS başladıktan sonra 7. günde histolojik hasar epitel soymadan ile yansıtılan kontroller ile karşılaştırıldığında DSS ile tedavi edilmiş farelerde önemli ölçüde daha yüksek olduğu, mukozal ülser gibi artmış nötrofil infiltrasyon ve önemli ölçüde 13. günde (Şekil 3C, E) geliştirilmiştir. Ayrıca, rutin endoskopik muayene sırasında elde edilen mukozal biyopsilerin, histolojik değerlendirilmesi, 7. günde (Şekil 3F-H) en kolit ileri bir aşamaya doğrulanmıştır.
Yaklaşık 80 gün AOM DSS (Şekil 4A) içinde üç döngü, tümörün uyandırılmasından sonra, çok sayıda kolon tümörleri (Şekil 4C) yanı sıra, toz mukoza gibi kronik enflamasyon makroskopik bulguları (Şekil 4B) 10 endoskopik olarak gözlenmiştir. H & E boyama ile kolorektal tümörlerin histolojik olarak değerlendirilmesi ile ve yüksek dereceli intraepitelyal neoplazi olmadan adenom saptandı. Bu nedenle, AOM-DSS-modeli karsinogenezin 12 moleküler süreçleri incelemek için, yanı sıra yeni tanı cihazları 13 değerlendirmek için mükemmel bir modelini andırıyor. Belirli molekülleri hedef floresan görüntüleme 'fotografik yöntemleri' 14,15 ile vivo moleküler görüntüleme sağlar. FE uygulanabilirliğini göstermek için, biz FITC, yaygın olarak kullanılan fluorokrom kullanılmaktadır. Belirli FITC saptanması için, bir bant geçiş filtresi sistemi, l ile birlikteIght kaynağı temin spesifik emisyon dalga boyu gereklidir (490 nm, Şekil 4D). FIT-spesifik emisyon dalga boyu (525 nm) doğru algılanması için, ikinci bir bant geçiren filtre kamera kafası ve endoskop (Şekil 4E) arasına sokulmuş oldu. Izleyici uygulaması olmadan FE herhangi belirli bir sinyal ve kolon doku veya dışkı otofloresansı (Şekil 4F, G) ile etkileşimi tespit etmedi. Bunun aksine, derhal damardan uygulama FITC-dekstran sonra, floro, kolon mukozası gözlenir olabilir ve kronik enflamasyon bölgelerindeki (Şekil 4 H) yanı sıra habis mukoza (Şekil 4i) artmış vaskülarite değerlendirilmesi için kullanılabilmektedir. Etkilenmemiş bir kolon mukozası (Şekil 4 K) ile karşılaştırıldığında Bu duruma göre, bir görüntü işleme yazılımı tarafından floresan yoğunluğunun ölçümü anlamlı habis doku içinde florokrom alımını artış gösterdi.
= "Her zaman" keep-together.within-sayfası>: fo "jove_content" 
Epitel Şekil 1. Endoskopik izleme vivo yanı sıra yara iyileşmesi nicel ve histolojik değerlendirmede yara iyileşmesi. Kolon yaralar, yara sınır ve yara kapatma nesil kolayca tespit edilebilir sonra. Yara alan (beyaz oklar) kantitatif epitel yara iyileşmesini takip etmek günlük takip endoskopi sırasında değerlendirilir (A - C) ex vivo, yaralar rezeke edildi ve H & yara iyileşmesi (D) histolojik analiz için e-boyandı.. Ölçekler tasvir ölçek çubuğu ile tanımlanır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2 "fo: İçerik-width =" yeniden 5in "src =" / files / ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2. enjeksiyon tedavisinde intramukozal Endoskop kılavuzlu. Optik kontrol altında, iğne (A) 'nın ucu yumuşak kolon mukozası içine yerleştirilir ve çözünmüş madde 50 ul (B) enjekte edilir. Daha sonra, işaretli mukozal kaldırma (C) kanama akut belirtisi olmadan (yıldız) kabul edilebilir. Ölçekler tasvir ölçek çubuğu ile tanımlanır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Deneysel DSS kolit dersin Şekil 3. Endoskopik değerlendirme. Kolit ders değerlendirmek olduvücut ağırlığı değişiklikleri ile d endoskopik tetkikler yanı sıra iltihaplı kolon bölümleri ve endoskopik biyopsiler histolojik analizi. (; Büyütme 10X A, C, E), endoskopik muayene ve şiddetli inflamasyon (B, D, G, H işaretleri tasvir edilen biyopsilerin histolojik değerlendirilmesi; gün 7 vücut ağırlığı ve ileri histolojik hasar büyük kaybı doğrultusunda büyütme 5X ve DSS gün sonra 13 de ise 10X) inflamatuar değişiklikler belirgin düzelme görüldü başlar. Ölçekler tasvir ölçek çubuğu ile tanımlanır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FiKolorektal tümörlerin? Güre 4. FE. tanısı konuldu kronik kolit (B) ve çok sayıda Endoluminal lezyonlar (C) göstergesidir 11 hafta (A), beyaz ışık endoskopi tespit toz mukoza için AOM ve halkalı DSS idaresi tarafından kolorektal karsinogenezi indüksiyonu sonrasında H & E boyama ex vivo (G) yüksek-dereceli intraepitelyal neoplazi ile adenom. Kronik inflamasyon (H) ve tümörler (I) görselleştirme kullanarak kolayca mümkün iken FE kesin tümör tespiti (F, G) izin vermedi izleyici uygulama olmadan FITC, FE hedefli. Etkilenmemiş bir kolon mukozası ile karşılaştırıldığında duruma göre, floresan yoğunluğunun ölçümü anlamlı gri skala profilleri (E, F) ile gösterilen, habis doku içinde yükseltilmiştir. Beyaz ışık colonoscop sırasında floresan moduna geçmek içiny, belirli bir bant geçiren filtresi ek spesifik dalgaboyu sağlamak için soğuk ışık kaynağı takılı (örneğin, FITC'ye için 490 nm D). Bu filtre beyaz ışık ve floresan modları (D) arasındaki geçiş (beyaz ok) kolaylaştırır. Belirli bir emisyon dalga boyu yakalamak için (örneğin, FITC 525 nm), bir ikinci bant geçiş filtresi, bir sürgü (E) kullanarak endoskop ve kamera kafası arasına yerleştirilir. Ölçekler tasvir ölçek çubuğu ile tanımlanır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Endoskopik çalışma istasyonu Şekil 5. Deneysel set-up. Endoskopik çalışma istasyonu (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelyal yara iyileşmesi devam eden bir süreçtir. Mide-bağırsak mukozasına olan yüzey hücrelerinin sürekli fizyolojik pullanarak 16 epitel hücrelerinin yenilenmesini gerektiren sık ortaya çıkar. Sonuç olarak, yara iyileşmesinde bozulma, gastrointestinal ülser ve 17 anastomoz kaçağı 18 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerinde çok büyük bir etkisi vardır. Epitel iyileşmesini uyarmak için moleküler arka plan değerlendirilmesi yanı sıra potansiyel ilaç adayları, sadece eksik vitro 19,20 hücre kültürü sistemlerinde yapılabilir. Dolayısıyla, böyle bir biyopsi forseps ile tanımlanan mukozal yaralar nesil ile kemirgen kolonoskopi gibi daha sofistike deney düzenekleri gastrointestinal yara iyileşmesi güvenilir in vivo değerlendirilmesini sağlayacak ve bağırsak iltihabı ve yara iyileşme süreçlerinin arasındaki olası etkileşimleri değerlendirmek için gereklidir.
Buna ek olarak, bir enjeksiyon iğne l için kullanılabilmektedirteşhis boyalar veya potansiyel ilaç adaylarının ocal intramukozal yönetimi. Bu, çalışma kanalı aracılığıyla dahil edilebilir ucuna monte edilmiş olan bir iğne ile esnek bir tüp (0.96 mm çaplı) kullanılarak elde edilebilir. Bir test maddesi hem de plasebo kontrolü, aynı hayvan içinde ayrı bir enflamatuar veya neoplastik lezyonların teslim edilebilir göz önüne alındığında, bu yöntem, geleneksel deneysel düzenlemeler ile karşılaştırıldığında güvenirlik bir avantaj sağlar. Lokal enjeksiyonlar bir başka uygulaması, murin kolon 21, ortotopik tümörleri üretmek için insan ya da sıçan tümör hücrelerinin implantasyonudur.
Kolitin murin modelleri patofizyolojisini aydınlatmak için hem de klinik öncesi potansiyel tedavi edici maddeler olarak değerlendirmek için gereklidir. Bu nedenle, hastalık seyrinin doğru izlenmesi büyük önem taşımaktadır. Geleneksel olarak, hastalığın şiddeti, genellikle dolaylı vücut ağırlığı, haemoccult testi gibi parametrelerin yanı sıra analizi ile değerlendirilirkan ve dışkı. Bunun aksine, kolit şiddeti doğrudan belirlenmesi genellikle hayvanın ölümü histolojik gerektirir analizi otopsi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, kemirgen kolonoskopi canlı farelerde kolon mukozası bir gözlenmesidir sunmaktadır. Ayrıca, kolit özellikleri doğrudan tekrar izlenmesi homojen olmayan hastalığın başlangıcında, örneğin IL-10 eksikliği olan farelerde veya RAG-eksikliği olan farelerde transfercolitis modelinde deneysel modellerde gerekli olan mümkündür. Sonuç olarak, kolitin bir murin endoskopik mukozal inflamasyon göstergesi ve aynı hayvanın seri kontrollerde objektif miktar tayinine izin veren 6 kurulmuştur.
Kolorektal karsinogenezin kapsamında, kolonoskopi çeşitli yararlı fırsatlar sunmaktadır. Örneğin, invazif olmayan yöntemlerin aksine, endoskopi in vivo tümör boyutunun belirlenmesinde olanak sağlamak üzere ilk yaklaşımve tümör sayıları. Ayrıca, belirli molekülleri hedef floresan photoprobes kullanımı görselleştirme ve moleküler süreçlerin ölçümü sağlar. Foersch ve diğerleri tarafından yapılan bir çalışmada, translasyon. Malign kolon mukozası içindeki VEGF ekspresyonunda özel hedefleme mümkün olduğu gösterilmiştir ve lezyon karakterizasyonu ve kolorektal kanser 22 insan hastalarda tedaviye yanıt tahmininde kullanılabilir. Ayrıca, bu moleküler görüntüleme yaklaşımdan edilen bilgiler insan hastalarda kullanılmak üzere tercüme edilmesi mümkün olabilir. Bu endoskopi sırasında şüpheli lezyonlardan canlı karakterizasyonu sağlayacak. Son olarak, bu nedenle, hedeflenen lezyona 23 kenarındaki enzimatik işlemlerle fluorophores aktivasyonu bu izleyicilerin 'Probları de yüksek özgüllük adlandırılır.
Kemirgen endoskopi yaparken, verilen protokol bazı adımlar özellikle kritiktir. Örneğin, farklı aykullanım suşları anestezi ve DSS konsantrasyonlara duyarlılıkları farklıdır. Bu nedenle bu protokol yerel koşullara adapte edilmesi gerekebilir. Ayrıca, endoskopik muayene ve kemirgen anatomi tam bilgiye performans deneyimi, güvenli ve hedef odaklı optimum kemirgen endoskopi gerçekleştirmek için gereklidir. Bu tekniğin olası kısıtlamalara ile ilgili olarak, kullanılan endoskop sistemi bu nedenle kadar doğru esneme olarak kolona prosedürü sınırlayıcı sert olduğunu vurgulamaktadır. Ayrıca, FE için uygulanabilir en fluorokromun anda nedenle kemirgen çalışmalar için mevcut iken, henüz insan hastalarda kullanılmak için onaylanmış değil, onların güvenliği profillerini açısından değerlendirildi ve ediliyor.
Prosedürün pratiklerini ilgilendiren kritik adımlar şunlardır: satıldı varsa (1) farklı suşları arasında değişebilir kaynaklı kolit KDS'ne duyarlılık yana, akut DSS kolit indüksiyon hayvanların ölüm riski olabilirkolit anced şiddeti. Bu nedenle, tek bir gerilme ve ikinci belirli DSS parti için en uygun tespit etmek çok sayıda DSS konsantrasyonları değerlendirebilir. Endoskopik muayene Büyük intrakolonik dışkı kitlelerin varlığında zor olabilir. Önemli dışkı yükleme görünümü gizleyebilir olduğu şüphesi varsa görünürlüğünü artıracak düğmeli kanül aracılığı ile lavman sıvısının 2 ml rektal uygulamasını kullanarak prosedür öncesinde bağırsak hareketi uyaran. Biyopsi sırasında yüksek perforasyon oranları oluşursa, mukozal biyopsilerin önce kolon içine hava girişini azaltmak ve dalları kapatmadan önce mukoza yüzeyi üzerinde biyopsi forseps baskıyı azaltmak.
Vücut ağırlığı, kan dışkı bir olayda, periferal kan ya da post-mortem histolojik analizler: sonu dolaylı parametrelerin deneysel kolit veya karsinogenezi hastalık aktivitesini belirlemek için geleneksel yöntemlerin aksine, birlikte ele alındığındaoscopy tabanlı teknikleri görsel kontrol altında biyopsi fırsat hastalığın seyri canlı izlenmesini sağlar. Buna ek olarak, iyileştirici ve topikal olarak uygulanabilir ilaç adaylarının tedavi edici etkisi, in vivo olarak değerlendirilebilir yara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz uzman teknik yardım için Sonja Dufentester ve Elke Weber teşekkür ederiz. Biz tıp bilişimi destek el yazması ve Stefan Brückner düzeltiyorum için Faekah Gohar teşekkür ederim. Bu çalışma Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94) bir disiplinlerarası hibe ile desteklenmiştir. D. Bettenworth Tıp Fakültesi, Westfälische Wilhelms-Universität Münster bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. M. Brückner Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8) bir "Gerok" dönme pozisyonuna tarafından desteklenmiştir. Biz fare karikatür resmi için Heike Blum teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al. Colonoscopy in mice. Surgical endoscopy. 16, 22-24 (2002).
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H. Peptic ulcer pathophysiology. The Medical clinics of North America. 75, 799-814 (1991).
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
