Abstract
O sucesso de um modelo animal pequeno para estudar a doença crítica é, em parte, dependente da habilidade do modelo para simular a condição humana. Inoculação intra-traqueal de uma quantidade conhecida de bactérias tem sido utilizados com sucesso para reproduzir a patogénese da pneumonia, que então se desenvolve em sépsis. Monitoramento de parâmetros hemodinâmicos e fornecer tratamento clínico padrão, incluindo a infusão de antibióticos, fluídos e medicamentos para manter a pressão arterial é fundamental para simular cuidados de suporte de rotina neste modelo, mas para fazê-lo requer tanto arterial e acesso vascular venosa. O vídeo detalha a técnica cirúrgica de implantes artéria carótida e cateteres na veia jugular comuns em um rato anestesiado. Após um período de recuperação de 72 h, os animais serão anestesiados e re-ligado a um tirante de configuração giratória e ligado à caixa de roedor que liga os cateteres implantados ao sistema de monitorização hemodinâmica. Esta configuração permite a livre circulação dorato durante o estudo, enquanto monitora continuamente as pressões, infusão de líquidos e medicamentos (antibióticos, vasopressors) e realizando coleta de sangue.
Introduction
Arterial e venosa cateterismo de ratos tem sido muito utilizado em pesquisas de laboratório. 1, 2 Cateterismo pode ser usado para monitoramento de parâmetros hemodinâmicos, incluindo sistólica, diastólica e pressão arterial média (PAM), freqüência cardíaca (FC) e da pressão venosa central (PVC) 3,4. Além disso, esses cateteres de infusão de permitir o tratamento padrão ou terapias potenciais, bem como a amostragem de sangue para analisar ainda mais o mecanismo subjacente de uma doença ou de tratamento. Portanto, tendo acesso vascular em um modelo animal pequeno é crítica para estudar as medidas de desempenho clínicos e os efeitos do tratamento.
Para estudar as causas subjacentes da doença crítica, é importante para desenvolver o primeiro um modelo para simular a condição humana. Inoculação intra-traqueal de uma quantidade conhecida de bactérias tem sido utilizados com sucesso para reproduzir a patogénese da pneumonia, uma infecção pulmonar grave o que então se desenvolve em sépsis.3, 5 Monitoramento medidas hemodinâmicas e fornecer tratamento clínico convencional é fundamental para simular cuidados de suporte de rotina. Tratamento clínico padrão inclui infusão de antibióticos, que auxilia na limpeza da infecção subjacente e a administração de fluidos e vasoconstritores, duas terapias empregadas em pacientes sépticos para manter a pressão arterial. 5-7 Acesso Vascular, especificamente implantação de cateteres de patentes é especialmente importante quando estudamos terapias experimentais para sepse.
Durante muitos anos, a capacidade de administrar o tratamento clínico padrão para roedores foi limitada pela disponibilidade de materiais com as propriedades necessárias para a construção de cateteres implantáveis e a capacidade da tecnologia de infusão para distribuir pequenos volumes com precisão ao longo do tempo. Além disso, a capacidade de desencadear uma infusão, em resposta à monitorização contínua de uma medida hemodinâmica específico permite uma posição consistente e reprodutívelmodelo ard tratamento pelo uso de amostra maior tamanhos típicos de estudos com roedores. 8, 9 Estas limitações tecnológicas em materiais e hardware de precisão foram superados, mas para proporcionar simultaneamente terapias de rotina durante o acompanhamento de parâmetros hemodinâmicos, tanto arterial e acesso vascular venosa deve estar disponível.
O vídeo detalha a técnica cirúrgica de implantes artéria carótida e cateteres na veia jugular comuns em um rato anestesiado. Após um período de recuperação de 72 h, os animais serão anestesiados e re-ligado a um tirante de configuração giratória e ligado à carcaça do roedor usado para ligar os cateteres implantados ao sistema de monitorização hemodinâmica. Durante o estudo, o sistema permite que um fluido de infusão com base ou entrega de um determinado volume a uma determinada taxa de infusão ou um sistema automatizado que proporciona uma taxa de infusão de acordo com a pressão arterial média detectado para manter uma determinada gama de pressão. O sistema de infusão de líquidosusa seringa programável bombas que fazem interface com saídas digitais do sistema de aquisição de dados e são controlados pelo software de monitorização, o MAP. A configuração de baraço e giro permite a livre circulação do rato durante o estudo, enquanto a monitoração da pressão, infusão de líquidos e vasoconstritores, e realizando coleta de sangue sem ter que manipular os animais. O monitoramento simultâneo de até 12 animais instrumentado com dois cateteres cada (em nossa configuração) com o hardware expansível para monitoramento 24 animais instrumentados permite uma grande flexibilidade para o estudo de vários grupos estratificados em cada experimento.
Este procedimento de cateterização pode ser benéfico para instalações de pesquisa que utilizam modelos de roedores semelhantes que precisam de acesso vascular para o monitoramento, a amostragem e tratamento por até 11 dias. Se o centro de pesquisa, considerando este procedimento tem experiência com roedores e uma estrutura de apoio adequada para a manutenção destes animais, em seguida, developing essas habilidades podem proporcionar uma economia de custos significativa, reduzindo o custo total por rato cateterização de mais de US $ 180 a menos de US $ 50 (incluindo rato naïve, componentes de cateter e custos técnicos) e aumentando a flexibilidade de horários (ratos ingênuos estão prontamente disponíveis vs. cronograma de entrega empresa de ratos implantados). O sucesso desse processo depende das habilidades do indivíduo que executa os cateterismos. Os animais de formação exigidos para se tornar proficientes neste procedimento variou de 20 a 40 ratos com uma taxa de patência cateter resultante de> 90%.
Protocol
Os procedimentos descritos abaixo foram realizados como parte de um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso do Centro Clínico animal no National Institutes of Health.
1. Preparação para a cirurgia
- Gas esterilizar cateteres e instrumentos.
2. Prepare os cateteres
- Lave os cateteres com glicerol heparinizado (250 UI de heparina / 1 ml de glicerol) para garantir a permeabilidade e evitar vazamentos. Buj de extremidade do cateter, com uma tampa metálica (20 ga, 15 mm) para reter glicerol heparinizado.
3. Prepare Aseptic Workstation
- Use álcool 70% para pulverizar as estações de trabalho e de instrumentos bandejas. Use um campo estéril para cobrir a mesa e bandejas de instrumentos operacionais e instrumentos lugar na bandeja.
4. Prepare Rats para Cirurgia
- Lugar de rato individualmente em uma câmara de Lucite e expor a um anestésico; isoflurano (3-5%) misturaed com o oxigênio até inconsciente. Remover rato da câmara e fazer a barba peles de anterior e posterior áreas do pescoço. Aplique lubrificante pomada para os olhos.
5. Implantação do Cateter
- Coloque rato anestesiado (confirmado por toe pitada) sobre uma mesa cirúrgica aquecida na posição ventral; colocar o nariz em cone do nariz para manter a anestesia com respirações espontâneas (isoflurano; 3,5%). Esfregar delicadamente a área cirúrgica 3 vezes uso de Betadine e 70% de álcool alternados. Faça uma incisão na pele 0,5 centímetros da linha média entre as escápulas usando uma tesoura cirúrgica.
- Reposicionar rato na posição dorsal; restringir delicadamente as pernas para cada lado da mesa usando elásticos; manter a anestesia. Coloque dois rolou gaze estéril 4x4 sob pescoço para hiperextensão ligeiramente para melhor exposição. Fazer uma incisão na pele direito cervical ventral 2 centímetros da linha média do pescoço, a nível da clavícula, usando um bisturi.
6. DireitoJugular Vein Cateterismo
- Utilizando uma tesoura cirúrgica, sem corte dissecar a veia jugular direita, para separar o salivar e tecidos linfáticos para visualizar e isolar uma secção de 5 mm do vaso. Usando sutura de seda 4-0, coloque um laço frouxo em ambas as extremidades cranianos e caudal da embarcação para maximizar a exposição do recipiente. Utilizando uma tesoura cirúrgica micro fazer uma incisão grande o suficiente para passar o cateter, de acordo com o vaso entre as duas ligaduras e amarrar a ligadura craniana em torno do navio.
- Inserção do cateter venoso para dentro do vaso para o coração com a ajuda do gancho e micro fórceps de dissecação e avançar o cateter até que todo o segmento de PU 3F é no vaso. Use as ligaduras nas extremidades cranial e caudal para fixar o cateter para o navio.
7. Esquerda Carótida Cateterismo
- Usando uma pinça hemostática, sem rodeios dissecar o músculo omo-hióideo longitudinalmente para expor a artéria carótida esquerda e isolate uma secção de 5 milímetros da embarcação. Verifique se o nervo vago (na cor branca) está completamente separado da artéria. Tome cuidado para não rasgar ou quebrar o nervo.
- Usando sutura de seda 4-0, coloque um laço solto na extremidade caudal do navio, amarrar a extremidade craniana do recipiente e colocar uma pinça buldogue caudalmente acima da sutura para parar o fluxo de sangue após a incisão. Utilizando uma tesoura cirúrgica micro, fazer uma incisão, grande o suficiente para passar o cateter, de acordo com o vaso entre as duas ligaduras. Inserção do cateter arterial para o coração com a ajuda do gancho e micro fórceps de dissecação.
- Usar um suporte de agulha lisa sem bloqueio para segurar a porção do cateter no interior do vaso apertado antes de remover o grampo de buldogue. Avançar o cateter com um par de pinças, enquanto o afrouxamento do suporte de agulha lentamente até que todo o segmento de cateter 2F PU é no vaso. Amarre a ligadura caudal solta ao redor do cateter e navio para garantir, mas não tão tight como a oclusão, o cateter.
8. Usando um Hemostat Em linha reta, um túnel cinco centímetros do tubo de volta Subcutânea atrás da orelha e através da incisão entre a escápula. Exteriorizar os cateteres através do tubo e retirar o tubo.
9. Feche a Ventral incisão com três aço inoxidável grampos de sutura, ea Dorsal incisão com fio de seda 4-0 para garantir a Cateteres exteriorizado no lugar.
Monitor de 10. Pós-cirúrgico e Cuidados
- Após cateterismo, encerrar a anestesia e recuperar o rato em decúbito lateral em uma gaiola com cama de celulose. Observe os ratos em intervalos de RH 2 por pelo menos 4 horas ou até que não mostrando sinais de dor e, em seguida, uma vez por dia. Dê cetoprofeno [5 mg / kg, injeção subcutânea (SQ)] imediatamente após o procedimento e cada 12 horas se o rato mostra sinais de dor ou angústia. Em nossa experiência, não há ratos têm exigido analgesia adicional para a dor após a INICIAl injecção. Características observadas que provocam consideração para doses adicionais de analgesia incluem, mas não se limitando a; postura anormal; aumento / diminuição da freqüência respiratória, unthrifty / ungroomed, infecção / inflamação do local da incisão, secreção ocular, piloereção ("haircoat cravado"), redução da atividade em resposta a estímulos sonoros ou táteis.
NOTA: Os ratos recuperados durante 72 horas que ganham> 10 g de peso pré-cateterismo serão incluídos no estudo.
11. A ligação a hemodinâmica do sistema
- Após a recuperação, se inscrever ratos saudáveis (ganho de peso> 10 g) em estudo. Coloque ratos em câmara de Lucite e anestesiar como descrito anteriormente.
- Coloque cortina estéril na mesa cirúrgica com pinça hemostática estéril, micro fórceps, 1 ml seringas com agulha romba anexados.
NOTA: As pontas da pinça hemostática deve ser coberto com borracha para evitar danos no cateter. Coloque rato anestesiado em um cirúrgicatabela na posição e lugar ventral nariz no cone do nariz para manter a anestesia (3-5%), com respirações espontâneas. - Braçadeira arterial e cateteres venosos usando um par de borracha tampado hemostats logo abaixo a ficha de metal. Utilizar um par de fórceps para remover o pino de metal no final do cateter e anexar uma seringa de 1 ml cheio com solução salina de heparina com uma agulha cega ligada. Por sua vez, remova as hemostats e retirar 0,1 ml para garantir os cateteres são patentes.
- Re-braçadeira os cateteres, retire a agulha e anexar esse fim a um cateter mais tempo (pré-lavado com heparina salina) que está ligado a um suporte giratório e amarrado em cima da gaiola caixa de sapatos. Conecte esses cateteres para os transdutores para aquisição de dados e gravação, amostragem, ou infusão.
NOTA: Todos os cateteres são protegidos com condutas mola enrolada longos o suficiente para permitir a gama completa de um animal de movimento em sua gaiola. - Após conexão cateter, encerrar anestesia erecuperar os animais na posição esternal numa gaiola com cama de celulose. Para manter a permeabilidade do cateter arterial, lave manualmente as linhas com 0,05 ml de solução salina heparina (50 UI / ml) a cada 1 hora, durante 24 horas, que coincidem com as avaliações regulares dos animais.
12. coleta de sangue, de Monitorização da Pressão and Drug Administration
- Anexar seringa vazia para torneira ligada ao cateter arterial e retirar 0,6 ml nivelado embutido. Anexar amostra seringa, tomar amostra, e voltar a 0,6 ml nivelado em linha seguida por 0,7 ml solução salina heparinizada.
- Usar dados de hardware e software de aquisição de medir e MAP registro e freqüência cardíaca de forma contínua.
- Ligue o sistema de entrega de drogas automatizada (ADDS) ao cateter venoso.
NOTA: Adiciona ajusta a taxa de infusão de vasopressor (alto, baixo, ou 0 dose) com base no MAP detectada a pressões mantidos dentro da faixa fisiológica normal.
Representative Results
As alterações na pressão vascular são transmitidos através dos cateteres cheios de fluido (Figura 1) e convertida em sinais eléctricos representados pelas formas de onda hemodinâmicos (Figuras 2, 3). Sem acesso vascular, estas medidas não poderiam ser feitas. Transmissão em tempo real das formas de onda permite a detecção e análise de mudanças em um batimento a batimento base (Figura 2). Comprimir a escala de tempo das formas de onda permite quantificar as alterações que ocorrem ao longo de um período mais longo (minutos até dias) (Figura 3, 4 curvas superiores), que pode ser correlacionada com as alterações nas taxas de infusão vasopressora (Figura 3, 4 curvas inferiores).
Figura 1. Cateter Projeto: Os detalhes dos componentes das arteriais e venosos cateteres PU, poliuretano;. PE, polietileno (comprimento do segmento) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Em tempo real formas de onda Mapa de 4 roedores típicos 7 dias após o cateterismo mais de 7 seg. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. ondas MAP compactado pelo tempo de 4 roedores típicos (superiores 4 formas de onda) 7 dias após o cateterismo mais de 1 hora. Quando o mapa é em média mais baixos (4 formas de onda), esse valor é usado para disparar ACRESCENTA elevada (<90 mmHg) , baixo (<100 mmHg) ou parar (> 110) resposta do fluxo da bomba de infusão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Investigando abordagens terapêuticas para um modelo clínico da doença exige que a capacidade de executar com precisão monitorização hemodinâmica, exigindo, portanto, o acesso vascular. Em nosso modelo de sepse, o cateterismo arterial fornece monitoramento de pressão sistêmica e venosa permite a aplicação da terapia clínica padrão. A terapia padrão para sepse inclui a infusão de antibióticos para tratar a infecção bacteriana e a infusão de fluidos e de fármacos para manter a pressão arterial dentro da gama desejada. Ambos os cateteres são utilizados para a coleta de sangue. Neste projeto, a aplicação de infusão programável bombas com accionamento automático da taxa de perfusão vasopressor baseado em tempo real as médias de pressão arterial é um avanço em relação à situação clínica que requer titulação manual por parte do pessoal médico e no cenário pré-clínico torna o uso desta modalidade possível para o estudo de um grande número de animais de tratamento.
. e_content "> Algumas complicações foram sentidas no início do desenvolvimento do modelo Estes incluíram oclusão parcial arterial e cateteres venosos de mais aperto, laços em componentes PU2 e PU3, (1-2%); extravio de cateter venoso jugular em um pequeno ramo, (<1%); morte súbita inexplicada após a recuperação (sem trombo pulmonar ou outro órgão danos evidentes), (1-2%) resolvido, mantendo concentração de isoflurano 2-3,5% com taxa de 2 O fluxo de 2 L / min . Outras complicações cirúrgicas comuns de hemorragia, infecção local e danos auto-infligidos não foram observados. Uma vez que a proficiência cirúrgica é atingido, cada procedimento deve ser capaz de ser concluída em não mais do que 15 min. A taxa de sucesso é medido como uma recuperação saudável e cateteres de patente, pode-se esperar que excede 90%, uma vez completamente formado. Uma animal adicional é incluído em cada estudo para minimizar a perda de dados e o número total de animais necessários e conta para um cateter que não pode ser "emfusão só "ou mortalidade devido a complicações.A etapa mais importante neste processo é a concepção e colocação de cateteres. Os materiais devem ser suave na ponta, a fim de não perfurar a parede do vaso sem engaste muito facilmente. O corpo do cateter tem de ser mais rígida (de ponta) para ser capaz de fazer avançar para dentro do recipiente suficiente e ser fixado no seu lugar. A Figura 1 mostra os três diâmetros de tubagem que estão conectados para o cateter arterial e 2 tubos de diâmetro diferente ligado para os cateteres venosos. Estes componentes são deslizados um dentro do outro para reduzir diâmetro na ponta do cateter e são coladas em conjunto com âncoras adicionados para assegurar a colocação do cateter no vaso ou coração é mantido.
Uma vez recuperado e conectado à giratória e corda, o mapa e as formas de onda de PVC deve ser semelhante aos dados representados na Figura 2. Para manter patenc cateter arterialy durante o monitoramento, de um autoclismo heparina salina por hora (0,05 ml) deve ser realizada. A infusão contínua mantém a desobstrução do cateter venoso. Durante a ligação da linha e flush, muita atenção deve ser pago para garantir que não haja bolhas de ar na linha. Uma bolha de ar de ≥0.1ml pode resultar em uma embolia no pulmão, cérebro ou outros órgãos. Formas de onda de hemodinâmica são registados e analisados ao longo do estudo. Quando se comprime em tempo o eixo x, A Figura 3 mostra as mudanças na PAM e PVC ao longo de 1 h, bem como as alterações na frequência e efeito da infusão do vasopressor.
O procedimento tem várias limitações potenciais. Em nossos estudos, os cateteres permanecer patente por até 11 dias. Não se sabe quanto tempo os cateteres permaneceria patente para além deste período. Para ajustar os cateteres, tal como descrito, existe uma dimensão mínima vascular, o que se correlaciona aproximadamente com peso roedor, que obrigue os animais inscritos neste estudo a ser maior do que200 g. O uso de um cateter de diâmetro menor resultaria no aumento da resistência ao fluxo diminuição da patência. Atingir as medidas de pressão venosa central requer a colocação do cateter preciso no átrio suficiente para a conta para o tamanho e crescimento durante o período de estudo e pode ser um desafio.
Uma vez dominado, arterial e cateterismo vascular pode fornecer a base para uma ampla variedade de modelos de roedores que exigem monitorização hemodinâmica, coleta de sangue e infusão de fluidos ou terapias, minimizando qualquer dor e angústia durante a instrumentação ou manusear uma vez recuperado. De facto, em conjunto com uma publicação descrevendo JOVE 10 cateterismo anterior da veia femoral, temos realizado com sucesso este modelo com três cateteres implantados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
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