Abstract
Framgången av en liten djurmodell för att studera kritisk sjukdom är, delvis, beroende på förmågan hos den modell för att simulera det mänskliga tillståndet. Intra-trakeal inokulering av en känd mängd av bakterier har framgångsrikt använts för att reproducera patogenesen av lunginflammation, som därefter utvecklas till sepsis. Övervakning hemodynamiska parametrar och ge standard klinisk behandling inklusive infusion av antibiotika, vätskor och läkemedel för att upprätthålla blodtrycket är kritisk för att simulera rutin stödjande vård i denna modell, men att göra det kräver både arteriell och venös kärlaccess. Videon detaljer den kirurgiska tekniken för implantering halspulsådern och gemensamma halsvenen katetrar i en bedövad råtta. Efter en 72 timmar återhämtningsperiod, djuren kommer åter bedövas och ansluten till ett tjuder och vridbar inställning fäst gnagare huset som ansluter de implanterade katetrar till hemodynamiska övervakningssystem. Denna setup tillåter fri rörelse avråtta under studien under kontinuerlig övervakning tryck, infusion vätskor och läkemedel (antibiotika, blodtryckshöjande medel) och utföra blodprovtagning.
Introduction
Arteriell och venös kateterisering av råttor har länge använts i laboratorieforskning. 1, kan 2 Kateterisering användas för övervakning av hemodynamiska parametrar inklusive systoliskt, diastoliskt och medelartärtryck (MAP), hjärtfrekvens (HR) och centralt ventryck (CVP) . 3,4 Dessutom är dessa katetrar tillåta infusion av standardbehandlingar eller potentiella terapier samt blodprovstagning för att ytterligare analysera den underliggande mekanismen av sjukdom eller behandling. Därför, med vaskulär åtkomst i en liten djurmodell är avgörande för att studera kliniska prestanda åtgärder och behandlingseffekter.
För att studera de underliggande orsakerna till kritisk sjukdom, är det viktigt att först ta fram en modell för att simulera det mänskliga tillståndet. Intra-trakeal inokulering av en känd mängd av bakterier har framgångsrikt använts för att reproducera patogenesen av lunginflammation, en allvarlig lunginfektion som därefter utvecklas till sepsis.3, 5 Övervakning hemodynamiska åtgärder och tillhandahålla standard klinisk behandling är avgörande för att simulera rutin stödjande vård. Standard klinisk behandling omfattar infusion av antibiotika som hjälper till att rensa den underliggande infektion och administration av vätskor och kärl, två behandlingar som används i septiska patienter för att upprätthålla blodtrycket. 5-7 Kärl tillgång, särskilt implantation av patent katetrar är särskilt viktigt när vi studerar prövnings terapier för sepsis.
Under många år var förmågan att administrera standard klinisk behandling till gnagare begränsas av tillgången på material med de nödvändiga egenskaperna för att konstruera implanterbara katetrar och förmåga infusions teknik för att leverera små volymer noggrant över tiden. Dessutom, förmågan att utlösa en infusion som svar på kontinuerlig övervakning av en specifik hemodynamisk åtgärd möjliggör en konsekvent och reproducerbar monterard behandlingsmodell vid användning större prov storlekar typiska för studier på gnagare. 8, 9 Dessa tekniska begränsningar i material och precision hårdvara har övervunnits, men att samtidigt ge rutin terapier under övervakning hemodynamiska parametrar, måste både arteriell och venös kärl tillgång finnas tillgängliga.
Videon detaljer den kirurgiska tekniken för implantering halspulsådern och gemensamma halsvenen katetrar i en bedövad råtta. Efter en 72 timmar återhämtningsperiod, djuren kommer åter bedövas och ansluten till ett tjuder och vridbar inställning fäst gnagare huset används för att ansluta de implanterade katetrar till hemodynamiska övervakningssystem. Under studien, kan systemet för en fluidinfusions baserad på antingen leverera en given volym vid en viss infusionshastighet eller ett automatiserat system som levererar en infusionshastighet beroende på det genomsnittliga arteriella trycket detekterat att upprätthålla en given tryckområde. Fluidinfusionssystemetanvänder programmerbar sprutpumpar som har gränssnitt till datainsamling systemets digitala utgångar och styrs av mjukvaran övervaka MAP. Den tjuder och vrid inställning möjliggör fri rörlighet för råttan under studien under övervakning tryck, infusion vätskor och kärl och utföra blodprovtagning utan att manipulera djuren. Samtidig övervakning av upp till 12 instrumente djur med 2 katetrar vardera (i vår inställning) med hårdvaran utbyggbart till övervakning 24 instrumente djur möjliggör en stor flexibilitet för att studera flera skiktade grupper i varje experiment.
Denna kateterisering förfarande kan vara till nytta för forskningsanläggningar som använder liknande gnagarmodeller kräver vaskulär åtkomst för övervakning, provtagning och behandling i upp till 11 dagar. Om forskningsanläggningen väger detta förfarande har erfarenhet av gnagare och en ordentlig stödstruktur för att upprätthålla dessa djur sedan developing dessa färdigheter kan ge en betydande kostnadsbesparing, minska den totala kostnaden per kateteriserad råtta från mer än $ 180 till mindre än $ 50 (inklusive naiv råtta, kateter komponenter och tekniska kostnader) och ökad schemaläggning flexibilitet (naiva råttor är lätt tillgängliga kontra företagets leveransschema av implanterade råttor). Framgången med detta förfarande är beroende av kompetensen hos individen utför kateterisering. Tränings djur som krävs för att bli skicklig i detta förfarande har varierat mellan 20 och 40 råttor med en resulterande kateter patency takt> 90%.
Protocol
De förfaranden som beskrivs nedan utfördes som en del av ett protokoll som godkänts av Animal Care och användning kommittén för klinisk Center vid National Institutes of Health.
1. Förberedelse för kirurgi
- Gas sterilisera katetrar och instrument.
2. Förbered Katetrar
- Spola katetrarna med heparin glycerol (250 IE heparin / 1 ml glycerol) för att säkerställa öppenhet och undvika läckage. Anslut änden av katetern med en metallpropp (20 ga, 15 mm) för att kvar hepariniserat glycerol.
3. Förbered Aseptisk Workstation
- Använd 70% alkohol för att spraya brickor arbetsstationen och instrument. Använd en steril duk att täcka drifts bord och instrumentbrickor och placera instrument på facket.
4. Förbered Råttor för kirurgi
- Placera råttan individuellt i en Lucite kammaren och utsättas för ett bedövningsmedel; isofluran (3-5%) mixed med syre tills medvetslös. Ta råtta från kammaren och raka päls från främre och bakre områden i nacken. Smörj salva till ögonen.
5. Kateter Implantation
- Placera sövd råtta (bekräftas av tå nypa) på en uppvärmd operationsbord i ventrala positionen; placera nosen in i noskonen att upprätthålla anestesi med spontana andetag (isofluran, 3,5%). Skrubba försiktigt operationsområdet 3 gånger omväxlande användning av Betadine och 70% alkohol. Gör en 0,5 cm mittlinje hudincision mellan scapulae med användning av en kirurgisk sax.
- Flytta råtta i dorsal position; försiktigt hålla benen på varje sida av bordet med hjälp gummiband; upprätthålla anestesi. Placera två rullade steril 4x4 gasbinda i halsen till svagt översträcka för bättre exponering. Gör en 2 cm ventral cervikal hudsnitt höger om mittlinjen av halsen vid nivån av nyckelbenet med hjälp av en skalpell.
6. HögerHalsvenen Kateterisering
- Med användning av en hemostat, rakt på sak dissekera den högra halsvenen, separera ut spott och lymfvävnad att visualisera och isolera ett 5 mm sektion av kärlet. Använda 4-0 silkessutur, placera en lös slips på båda kraniala och kaudala ändarna av fartyget för att maximera exponeringen av fartyget. Med hjälp av en mikro kirurgisk sax göra ett snitt är tillräckligt stort för att passera katetern, i linje med kärlet mellan de två ligaturer och knyta den kraniala ligatur runt kärlet.
- Sätt i venkateter i kärlet mot hjärtat med hjälp av mikro dissekera krok och pincett och avancera katetern tills all PU 3F segmentet är i kärlet. Använd ligaturer vid de kraniala och kaudala ändarna för att säkra katetern till kärlet.
7. Vänster carotis Kateterisering
- Med hjälp av en hemostat, rakt på sak dissekera omohyoid muskeln längdled för att exponera den vänstra halspulsådern och jagsolate en 5mm sektion av kärlet. Säker vagusnerven (vitt) är helt skild från artären. Se till att inte riva eller bryta nerven.
- Använda 4-0 silkessutur, placera en lös slips på kaudala änden av kärlet, fästa hjärn änden av kärlet och placera en bulldog klämma kaudalt ovanför suturen för att stoppa blodflödet efter snittet. Med hjälp av en mikro kirurgisk sax, göra ett snitt, tillräckligt stora för att passera katetern, i linje med kärlet mellan de två ligaturerna. Sätt i arteriell kateter mot hjärtat med hjälp av mikro dissekera kroken och pincett.
- Använd en mjuk nål utan lås för att hålla den del av katetern inuti kärlet tätt innan du tar bort bulldog klämman. Advance katetern med en pincett medan lossa nålhållaren långsamt tills hela PU 2F segmentet av katetern är i kärlet. Knyt den lösa caudal ligatur runt katetern och fartyget för att säkra, men inte så tight såsom att ockludera, katetern.
8. Använd en rak Hemostat, Tunnel en 5 cm Tube tillbaka subkutant bakom örat och genom snittet mellan skulderbladen. Exteriorize katetrarna genom röret och ta bort röret.
9. Stäng Ventral Incision med tre Stainless Steel sårklämmor och Rygg Incision med 4-0 Silk Suturer att Fäst exterioriserades Katetrar på plats.
10. Post-kirurgisk Monitor och omsorg
- Efter kateterisering, avsluta anestesi och återvinna råttan i sidoläge trycksår i en bur med cellulosa sängar. Observera råttor vid 2 h intervaller i minst 4 timmar eller tills visar inga tecken på smärta och sedan en gång dagligen. Ge Ketoprofen [5 mg / kg, subkutan injektion (SQ)] omedelbart efter förfarande och varje 12 timmar om råttan visar tecken på smärta eller ångest. Enligt vår erfarenhet har inga råttor krävs ytterligare smärtlindring för smärta efter inil injektion. Kännetecken observerade som skulle framkalla hänsyn till ytterligare doser av smärtlindring inkluderar men inte begränsat till; onormal kroppshållning; ökning / minskning av andningsfrekvens, unthrifty / ovårdat, infektion / inflammation i snittet platsen, rinnande ögon, piloerektion ("spetsade haircoat"), minskad aktivitet som svar på hörbara eller taktila stimuli.
OBS: Råttor återvinnas för 72 timmar som får> 10 g från pre-kateterisering vikt kommer att vara inskrivna i studien.
11. Anslutning till Hemodynamic System
- Efter återhämtning, registrerar friska råttor (viktökning> 10g) i studien. Placera råttor i Lucite kammare och söva såsom tidigare beskrivits.
- Placera steril duk på operationsbordet med sterilt hemostat, mikro pincett, 1 ml sprutor med trubbig nål bifogade.
OBS: Spetsarna hemostat bör täckas med gummi för att undvika skador på katetern. Placera sövda råttan på en kirurgiskbord i ventrala position och plats näsan i noskonen att upprätthålla anestesi (3-5%) med spontana andetag. - Clamp arteriella och venösa katetrar med hjälp av ett par gummi utjämnade peanger strax nedanför metallkontaktens stift. Använd en pincett för att ta bort metallstift i slutet av katetern och bifoga en 1 ml spruta fylld med heparin saltlösning med en trubbig nål fastsatt. I sin tur, ta peanger och dra 0,1 ml för att säkerställa katetrarna är patent.
- Åter klämma katetrarna, ta bort nålen och fäst detta till en längre kateter (pre-spolas med heparin saltlösning) som är ansluten till ett vridbart och tjudrad ovanpå skokartong bur. Anslut dessa katetrar till givarna för datainsamling och inspelning, provtagning, eller infusion.
OBS: Alla katetrar är skyddade med spiralfjäder ledningar tillräckligt lång för att ett djurs komplett utbud av rörelse i sin bur. - Efter kateteranslutningen, avsluta anestesi ochåtervinna djuren i bröst position i en bur med cellulosa sängar. För att upprätthålla arteriell kateter patency, spola ledningarna med 0,05 ml heparin saltlösning (50 IU / ml) varje 1 timme för 24 timmar, som sammanfaller med de regelbundna bedömningar av djuren manuellt.
12. Blodprovstagning, Pressure Monitoring and Drug Administration
- Bifoga tomma sprutan för att kranen ansluten till arteriell kateter och dra 0,6 ml inline flush. Bifoga provspruta, ta prov, och returnera 0,6 ml inline flush följt av 0,7 ml hepariniserat koksalt flush.
- Använd datainsamling hårdvara och mjukvara för att mäta och registrera MAP och hjärtfrekvens kontinuerligt.
- Anslut det automatiserade systemet för läkemedelsleverans (lägger) till venkatetern.
OBS: Lägger justerar graden av vasokonstriktion infusion (hög, låg eller 0 dos) baserat på MAP upptäckts att hållna trycket inom det normala fysiologiska intervallet.
Representative Results
Förändringar i vaskulär tryck överförs via vätskefyllda katetrar (figur 1) och omvandlas till elektriska signaler som representeras av de hemodynamiska vågformerna (figurerna 2, 3). Utan vaskulär access, kan dessa åtgärder inte göras. Realtids streaming av vågformerna möjliggör detektion och analys av förändringar på en slag till slag basis (Figur 2). Komprimering tidsskalan för vågformerna tillåter kvantifiera förändringar som sker över en längre tid (minuter till dagar) (Figur 3, övre 4 vågformer), som kan korreleras med förändringar i vasopressor infusionshastigheter (Figur 3, lägre 4 vågformer).
Figur 1. Kateter Design: Detaljer av komponenterna i de arteriella och venösa katetrar PU, polyuretan;. PE, polyeten (segmentlängd) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Realtids MAP vågformer av fyra typiska gnagare 7 dagar efter kateterisering över 7 sek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tids komprimerad MAP vågformer av fyra typiska gnagare (övre fyra vågformer) 7 dagar efter kateterisering över 1 timme. När kartan genomsnitt (nedre fyra vågformer), är det värdet som används för att utlösa ADDS hög (<90 mmHg) , låg (<100 mmHg) eller stopp (> 110) flöde svar från infusionspumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Undersöka terapeutiska strategier mot en klinisk modell av sjukdom nödvändiggör förmågan att korrekt utföra hemodynamiska övervakning, vilket kräver vaskulär åtkomst. I vår modell av sepsis, ger arteriell kateterisering systemövervakning tryck och venös kateterisering medger tillämpning av standarden klinisk terapi. Standardbehandling för sepsis inkluderar infusion av antibiotika för att behandla bakteriella infektioner och infusion av vätskor och kärlsammandragande medel för att upprätthålla arteriellt tryck inom det önskade intervallet. Båda katetrarna används för blodprovtagning. I denna design, tillämpningen av programmerbara infusionspumpar med automatisk utlösning av vasokonstriktion infusionshastighet baserad på realtids menar arteriella trycket är ett framsteg jämfört med den kliniska inställningen som kräver manuell titrering av den medicinska personalen och i pre-klinisk miljö gör användning av denna behandlingsform möjligt för att studera ett stort antal djur.
. e_content "> Vissa komplikationer upplevdes tidigt i utvecklingen av modellen Dessa inkluderade partiell ocklusion av både arteriella och venösa katetrar från över skärpning, slipsar på PU2 och PU3 komponenter (1-2%), felplacering av jugular venös kateter i en liten gren, (<1%), oförklarad plötslig död efter återvinning (ingen pulmonell trombos eller annan organskada uppenbar), (1-2%) lösas genom att hålla isofluran koncentration 2-3,5% med O2 flöde på 2 l / min . Andra vanliga kirurgiska komplikationer av blödning, lokal infektion och självförvållad skada observerades inte. När kirurgisk färdighet uppnås, varje förfarande ska kunna slutföras i högst 15 minuter. Hastigheten av framgång mätt som en frisk återhämtning och patentkatetrar, kan förväntas överstiga 90% en gång fullt utbildade. är ytterligare djur som ingår i varje studie för att minimera förlust av data och det totala antalet djur som behövs och står för en misslyckad kateter som kan vara "iEndast fusion "eller dödlighet på grund av komplikationer.Det mest kritiska steget i detta förfarande är utformning och placering av katetrar. Materialen måste vara mjuk vid spetsen för att inte tränga igenom kärlväggen utan krimpning alltför lätt. Kroppen av katetern måste vara styvare (än spetsen) för att kunna avancera in i kärlet tillräckligt och säkras på plats. Figur 1 visar de tre diametrar av slangar som är anslutna till den arteriella katetern och två slangar med olika diameter ansluten för venkatetrar. Dessa komponenter skjuts inuti varandra för att minska kateterdiameter vid spetsen och är hoplimmade med ankare sätts för att säkerställa placering av katetern i kärlet eller hjärtat bibehålls.
När återhämtat sig och är ansluten till den vridbara och tjuder bör MAP och CVP vågformer likna de data som representeras i figur 2. För att upprätthålla arteriell kateter patency under övervakning, bör utföras en gång i timmen heparin saltlösning flush (0,05 ml). Kontinuerlig infusion bibehåller venkatetern patency. Under linjeanslutning och spola, måste stor uppmärksamhet ägnas att försäkra att det inte finns några luftbubblor i ledningen. En luftbubbla av ≥0.1ml kan resultera i en blodpropp i lungan, hjärnan eller andra organ. Hemodynamiska vågformer registreras och analyseras under loppet av studien. När komprimera tiden i x-axeln, Figur 3 visar förändringarna i MAP och CVP under loppet av 1 timme samt förändringarna i takt och effekten av vasopressor infusion.
Förfarandet har flera potentiella begränsningar. I våra studier, katetrarna förblir patent i upp till 11 dagar. Det är okänt hur länge katetrar skulle förbli patent utöver denna period. För att passa katetrarna som beskrivs, det finns minst vaskulär storlek, vilket ungefär korrelerar med gnagare vikt, för att kräva djur inskrivna i denna studie vara större än200 g. Användningen av en mindre kateterdiameter skulle resultera i ökande motstånd att flöda reducerande patency. Att uppnå centralt ventryck åtgärder kräver noggrann kateterplacering i atriet är tillräcklig för att redogöra för storlek och tillväxt under studieperioden och kan vara en utmaning.
När behärskar, arteriell och vaskulär kateterisering kan ligga till grund för en mängd olika djurmodeller som kräver hemodynamiska övervakning, blodprovstagning, och infusion av vätskor eller terapier samtidigt minimera eventuella smärta och ångest under instrumentering eller hanterar en gång återhämtat sig. I själva verket, i samband med en tidigare JOVE publikation 10 beskriver kateterisering av höftbensvenen, vi har framgångsrikt utfört denna modell med 3 implanterade katetrar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
