Abstract
Suksessen til et lite dyremodell for å studere kritisk sykdom er, delvis, avhengig av evnen til modellen for å simulere humane tilstand. Intratrakeal inokulasjon av en kjent mengde av bakterier har blitt brukt til å reprodusere patogenesen av lungebetennelse som da utvikler seg til sepsis. Overvåking hemodynamiske parametre og gir standard klinisk behandling inkludert infusjon av antibiotika, væsker og medikamenter for å opprettholde blodtrykket er avgjørende for å simulere rutine støttebehandling i denne modellen, men å gjøre det krever både arteriell og venøs vaskulær tilgang. Videoen beskriver kirurgisk teknikk for å implantere halspulsåren og vanlige halsvene katetre i en bedøvet rotte. Etter en 72 timers restitusjonsperiode dyrene vil bli re-bedøvet og koblet til et tether og dreie oppsett festet til gnager huset som forbinder de implanterte kateteret til hemodynamiske overvåkingssystem. Dette oppsettet tillater fri bevegelse avrotte i løpet av studien, mens kontinuerlig overvåking press, infusjonen væsker og medikamenter (antibiotika, vasopressorer) og utfører blodprøvetaking.
Introduction
Arterielle og venøse kateterisering av rotter har lenge vært brukt i laboratorieforsøk. 1, kan to Kateterisering brukes til overvåking av hemodynamiske parametere inkludert systolisk, diastolisk og gjennomsnittlig arterietrykk (MAP), hjertefrekvens (HR) og sentralt venetrykk (CVP) . 3,4 I tillegg er disse katetre tillate infusjon av vanlige behandlinger eller potensielle terapier, så vel som blodprøver for ytterligere å analysere de underliggende mekanisme for en sykdom eller behandling. Derfor har vaskulær tilgang i en liten dyremodell er avgjørende for å studere kliniske resultatmål og behandlingseffekter.
Å studere de underliggende årsakene til kritisk sykdom, er det viktig å først utvikle en modell for å simulere den menneskelige tilstand. Intratrakeal inokulasjon av en kjent mengde av bakterier har blitt brukt til å reprodusere patogenesen av lungebetennelse, en alvorlig lungeinfeksjon som da utvikler seg til sepsis.3, 5 Overvåking hemodynamiske tiltak og gi standard klinisk behandling er avgjørende for å simulere rutine støttebehandling. Standard klinisk behandling omfatter infusjon av antibiotika som hjelpemidler i å rydde den underliggende infeksjon og administrasjon av væsker og vasopressorer, to behandlinger ansatt i septik pasienter for å opprettholde blodtrykket. 5-7 Vaskulær tilgang, spesielt implantasjon av patent katetre er spesielt viktig når vi studerer eksperimentelle behandlingsformer for sepsis.
I mange år, ble evnen til å administrere standard klinisk behandling for gnagere begrenset av tilgjengeligheten av materialer med de nødvendige egenskaper for å konstruere implanterbart kateter og evnen av infusjons teknologi for å levere små mengder nøyaktig over tid. I tillegg til evnen til å utløse en infusjon i respons til kontinuerlig overvåkning av en bestemt hemodynamiske tiltak muliggjør en konsekvent og reproduserbar stativard behandlingsmodell ved bruk av større prøvestørrelser typisk for gnagere. 8, 9 Disse teknologiske begrensninger i materialer og presisjon hardware har blitt overvunnet, men å samtidig gi rutinemessige terapier mens overvåking hemodynamiske parametre, må både arteriell og venøs vaskulær tilgang være tilgjengelig.
Videoen beskriver kirurgisk teknikk for å implantere halspulsåren og vanlige halsvene katetre i en bedøvet rotte. Etter en 72 timers restitusjonsperiode dyrene vil bli re-bedøvet og koblet til et tether og dreie oppsett festet til gnager huset benyttes for å koble de implanterte kateteret til hemodynamiske overvåkingssystem. I løpet av studien, tillater systemet for en fluidinfusjons basert på enten å levere et gitt volum i en viss infusjonshastighet eller et automatisert system som gir en infusjonshastighet avhengig av den midlere arterietrykk registrert for å opprettholde en gitt trykkområde. Væsken infusjonssystemetbenytter programmerbar sprøyte pumper som grensesnitt med datainnhentingssystemets digitale utganger og styres av programvaren overvåke MAP. Fortøyningen og dreie oppsettet tillater fri bevegelse av rotten i løpet av studien, mens overvåking trykk, infusere væsker og vasopressorer, og utføre blodprøver uten å måtte manipulere dyrene. Samtidig overvåking av opptil 12 instrumenterte dyr med to katetre hver (i vår oppsett) med maskinvaren kan utvides til å overvåke 24 instrumenterte dyr åpner for en stor grad av fleksibilitet for å studere flere lagdelte grupper i hvert forsøk.
Dette kateterisering prosedyren kan være gunstig for forskningsfasiliteter som bruker lignende gnagermodeller krever tilgang til blodkar for overvåking, prøvetaking og behandling i inntil 11 dager. Hvis forskningen anlegget vurderer denne prosedyren har erfaring med gnagere og en skikkelig støttestruktur for å opprettholde disse dyrene så developing disse ferdighetene kan gi en betydelig kostnadsbesparelse, redusere totalkostnaden per kateteriseres rotte fra mer enn $ 180 til mindre enn $ 50 (inkludert naive rotte, kateter komponenter og tekniske kostnader) og økende planlegging fleksibilitet (naive rotter er lett tilgjengelig vs. selskap leveringsplan av implanterte rotter). Suksessen med denne prosedyren er avhengig av ferdighetene til den enkelte å utføre catheterizations. Opplærings dyr som kreves for å bli dyktigere i denne prosedyren har varierte 20-40 rotter med en resulterende kateter åpenhetsgrad på> 90%.
Protocol
Prosedyrene som er beskrevet nedenfor ble utført som en del av en protokoll godkjent av Animal Care og bruk komité ved Clinical Center ved National Institutes of Health.
1. Forberedelse til kirurgi
- Gass sterilisere katetre og instrumenter.
2. Forbered katetre
- Skylle kateter med heparinisert glyserol (250 IE heparin / 1 ml glyserol) for å sikre åpenhet og unngå lekkasje. Plugg enden av kateteret med en metallpropp (20 GA, 15 mm) for å holde heparinisert glycerol.
3. Forbered Aseptisk arbeidsstasjon
- Bruke 70% alkohol for å spraye arbeidsstasjon og instrumentbrett. Bruk en steril drapere å dekke operasjonsbordet og instrumentbrett og plassere instrumenter på skuffen.
4. Forbered Rotter for kirurgi
- Sted rotte individuelt i en Lucite kammer og utsettes for en bedøvelse; isofluran (3-5%) blandinged med oksygen til bevisstløs. Fjern rotte fra kammeret og barbere pelsen fra fremre og bakre områder i nakken. Påfør smøremiddel salve til øynene.
5. Kateter Implantasjon
- Plasser bedøvet rotte (bekreftet av tå klype) på en oppvarmet kirurgisk bord i ventral posisjon; plassere sin nese inn i den koniske nese til å opprettholde anestesi med spontan respirasjon (isofluran; 3,5%). Forsiktig skrubbe den kirurgiske området tre ganger vekslende bruk av Betadine og 70% alkohol. Lag en 0,5 cm midtlinjen snitt i huden mellom scapulae hjelp av et kirurgisk saks.
- Reposisjonere rotte i dorsal stilling; forsiktig holde bena på hver side av bordet ved hjelp av gummi band; opprettholde anestesi. Plasser to rullet steril 4x4 gasbind under halsen til litt hyperextend for bedre eksponering. Gjør en 2 cm ventralt cervikalt innsnitt rett over midtlinjen av halsen på nivået av kravebenet ved hjelp av en skalpell.
6. HøyreJugularvenen Kateterisering
- Ved hjelp av en hemostat, rett ut dissekere høyre halsvene, skille ut spytt og lymfatisk vev til å visualisere og isolere en 5 mm seksjon av fartøyet. Ved hjelp av 4-0 silke sutur, plasserer en løs slips på både kranie og caudal endene av fartøyet for å maksimere eksponeringen av fartøyet. Ved hjelp av en mikro- kirurgisk sakse gjøre et snitt stort nok til å passere kateteret, på linje med beholderen mellom de to ligaturer og binde den kraniale ligatur rundt fartøyet.
- Sett venekateter inn i beholderen mot hjertet ved hjelp av mikro dissekere kroken og tang og forhånd kateteret inntil alt PU 3F segmentet er i beholderen. Bruk ligaturer på den kraniale og caudal endene for å feste kateteret til fartøyet.
7. Venstre arteria carotis Kateterisering
- Ved hjelp av en hemostat, uten omsvøp dissekere omohyoid muskel i lengderetningen for å avsløre den venstre halspulsåren og jegsolate en 5 mm seksjon av fartøyet. Sikre vagusnerven (hvit farge) er helt atskilt fra arterien. Pass på ikke å makulere eller bryte nerve.
- Ved å bruke 4-0 silkesutur, plasserer en løs tie på kaudal ende av karet, feste den kraniale ende av karet, og plassere en klypen caudally ovenfor suturen for å stanse blodstrømmen etter snittet. Ved hjelp av en mikro kirurgisk saks, gjør et snitt, stor nok til å passere kateteret, i tråd med fartøyet mellom de to ligaturer. Sett arteriekateteret mot hjertet med hjelp av mikro dissekere krok og tang.
- Å bruke en glatt nåleholderen uten lås for å holde den delen av kateteret inne i beholderen tett før fjerning av klypen. Advance kateteret med en pinsett under løsne nåleholderen langsomt inntil hele PU 2F segment av kateteret er i karet. Bind den løse kaudal ligatur rundt kateteret og fartøyet for å sikre, men ikke så tight å tilstoppe, kateteret.
8. Bruk en Straight hemostat, Tunnel en 5 cm Tube tilbake subkutant bak øret og gjennom snittet mellom scapulae. Exteriorize kateter gjennom Tube og Fjern Tube.
9. Lukk Ventral snittet med tre rustfritt stål Wound Klipp og Dorsal snittet med 4-0 silkesuturer å sikre exteriorized katetre i Place.
10. Post-kirurgisk Monitor og omsorg
- Etter kateterisering, avslutte anestesi og gjenopprette rotte i lateral decubitus posisjon i et bur med cellulose sengetøy. Observere rottene på to timers mellomrom i minst 4 timer eller inntil viser ingen tegn til smerte og deretter en gang daglig. Gi Ketoprofen [5 mg / kg, subkutan injeksjon (SQ)] umiddelbart legge prosedyre og hver 12. time hvis rotta viser tegn til smerte eller ubehag. I vår erfaring, har ingen rotter nødvendig ekstra analgesi for smerte etter initiativl injeksjon. Kjennetegn observert som ville lokke fram hensynet til ytterligere doser av analgesi inkluderer men ikke begrenset til; unormal holdning; økning / reduksjon i respirasjonsfrekvens, unthrifty / ustelt, infeksjon / betennelse i innsnitt området, rennende øyne, piloereksjon ("piggete pels"), reduksjon i aktivitetsnivået til hørbare eller taktile stimuli.
MERK: Rotter gjenvunnet for 72 timer som får> 10 g fra pre-kateterisering vekt vil bli inkludert i studien.
11. Tilkobling til hemodynamiske System
- Etter utvinning, melde friske rotter (vektøkning> 10g) i studien. Plasser rotter i Lucite kammer og bedøve som tidligere beskrevet.
- Plasser sterile drapere på kirurgisk bord med steril hemostat, mikro tang, 1 ml sprøyter med butt nål festet.
MERK: tips av pinsetten skal være dekket med gummi for å unngå skade på kateteret. Plasser bedøvet rotte på et kirurgiskbord i ventral stilling og sted nesen inn i nesen membran for å opprettholde anestesi (3-5%) med spontan respirasjon. - Clamp arterielle og venøse kateter ved hjelp av et par gummi avkortet hemostats like under metall pinner. Bruk en pinsett til å fjerne metallpinnen på slutten av kateteret og fest en 1 ml sprøyte fylt med heparin saltvann med en butt nål festet. I sin tur, fjerne hemostatene og ta ut 0,1 ml for å sikre kateter er patent.
- Re-klemme katetre, fjern nålen og feste denne enden til en lengre kateter (pre-spylt med heparin saltvann) som er koblet til en svivel og tjoret på toppen av skoeske buret. Koble disse katetre til transdusere for datainnsamling og registrering, prøvetaking, eller infusjon.
MERK: Alle katetre er beskyttet med coiled våren rør lange nok til å tillate et dyrs hele spekteret av bevegelse i buret sitt. - Etter kateter tilkobling, avslutte anestesi oggjenopprette dyrene i sternum stilling i et bur med cellulose sengetøy. For å opprettholde arteriekateter åpenhet, spyle ledningene med 0,05 ml heparin saltvann (50 IE / ml) hver av 1 time i 24 timer, som faller sammen med de regelmessige vurderinger av dyrene manuelt.
12. blodprøvetaking, Pressure Monitoring and Drug Administration
- Fest tom sprøyte til stoppekran koblet til arteriell kateter og ta ut 0,6 ml inline flush. Fest prøve sprøyte, ta prøven, og returnere 0,6 ml inline flush etterfulgt av 0,7 ml heparinisert saltvannsskylling.
- Bruk datainnsamling maskinvare og programvare for å måle og registrere MAP og puls kontinuerlig.
- Koble den automatiserte levering av legemidler (legger) til venekateter.
MERK: Legger justerer frekvensen av vasopressor infusjon (høy, lav eller 0 dose) basert på oppdaget til opprettholdt presset innenfor det normale fysiologiske området MAP.
Representative Results
Endringer i vaskulær trykket blir overført gjennom væskefylte katetere (figur 1) og omdannet til elektriske signaler som representeres av de hemodynamiske bølgeformer (figurene 2, 3). Uten vaskulær tilgang, ikke kunne bli gjort disse tiltakene. Real-time streaming av bølgeformene åpner for deteksjon og analyse av endringer på en beat å slå basis (figur 2). Komprimering av tidsskalaen av bølgeformene åpner for å kvantifisere endringer som skjer over en lengre varighet (minutter eller dager) (figur 3, øvre fire bølgeformer) som kan være korrelert med endringer i vasopressor infusjonsrater (figur 3, lavere fire bølgeformer).
Figur 1. Kateter Design: Detaljer av komponentene i den arterielle og venøse katetre PU, polyuretan;. PE, polyetylen (segment lengde) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. sanntidskart bølgeformer av fire typiske gnagere 7 dager etter kateterisering over 7 sek. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Tids komprimert MAP bølgeformer av fire typiske gnagere (øvre fire kurvene) 7 dager etter kateterisering over 1 time. Når kartet er midlet (lavere fire bølgeformer), er den verdien som brukes til å utløse LEGGER høy (<90 mmHg) , lav (<100 mmHg) eller stoppe (> 110) flyt respons fra infusjonspumpe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Investigating terapeutiske tilnærminger til en klinisk modell av sykdom nødvendiggjør evnen til nøyaktig å utføre hemodynamisk overvåkning, og dermed krever vaskulær tilgang. I vår modell av sepsis, gir arteriell kateterisering systemisk press overvåking og venøse kateterisering tillater bruk av standard klinisk behandling. Standard terapi for sepsis omfatter tilførsel av antibiotika til behandling av bakterielle infeksjoner, og tilførsel av fluider og for å opprettholde vasopressorer arterielt trykk innen det ønskede område. Begge katetere brukes for blodprøvetaking. I denne designen, pumper anvendelsen av programmerbare infusjon med automatisk utløser av vasopressor infusjonshastighet basert på sanntids bety arterielle press er en forhånd over klinisk setting som krever manuell titrering av medisinsk personell og i pre-klinisk setting gjør Bruk av denne behandlingsform mulig for å studere et stort antall dyr.
. e_content "> Noen komplikasjoner ble opplevd tidlig i utviklingen av modellen Disse inkluderte delvis okklusjon av både arterielle og venøse katetre fra over innstramming, bånd på PU2 og PU3 komponenter, (1-2%), feilplassering av vena venekateter inn i en liten gren, (<1%); uforklarlig plutselig død etter gjenvinning (ingen pulmonal trombose eller andre organskade tydelig), (1-2%) løses ved å holde konsentrasjonen 2-3,5% isofluran med O 2 strømningshastighet på 2 l / min . Andre vanlige kirurgiske komplikasjoner av blødning, lokal infeksjon og selvpåførte skader ble ikke observert. Når kirurgisk kompetanse er oppnådd, hver prosedyre bør være i stand til å være ferdig i ikke mer enn 15 min. Satsen for suksess måles som en sunn utvinning og patent katetre, kan forventes å overstige 90% når fullt utdannet. En ytterligere dyret er inkludert i hver studie for å minimere tap av data, og det totale antall dyr som trengs og står for en mislykket kateter som kan være "ifusjon bare "eller dødelighet på grunn av komplikasjoner.Den mest kritiske trinnet i denne prosedyren er utforming og plassering av kateter. Materialene må være mykt på spissen for ikke å stikke hull i beholderveggen uten krymping for lett. Legemet av kateteret må være stivere (enn spissen) for å være i stand til å gå videre inn i beholderen i tilstrekkelig grad og sikres på plass. Figur 1 viser de tre diameter av rør som er koblet til det arterielle kateter og to forskjellig diameter koblet for venekateter. Disse komponenter er skjøvet i hverandre for å redusere kateterdiameter på spissen og er limt sammen med ankere tilsatt for å sikre plassering av kateteret på fartøyet eller hjerteopprettholdes.
Når utvinnes og koblet til svivelen og tjore bør MAP og CVP bølgeformer ligne på dataene som er representert i figur 2. For å opprettholde arteriekateter patency under overvåking, bør en time heparin saltvann flush (0,05 ml) utføres. Kontinuerlig infusjon opprettholder venekateter åpenhet. Under linje tilkobling og flush, må nøye betales for å sikre det ikke er luftbobler i slangen. En luftboble med ≥0.1ml kan resultere i en blodpropp i lungene, hjernen eller andre organer. Hemodynamiske bølgeformer blir registrert og analysert i løpet av studien. Ved komprimering av tid i x-aksen, Figur 3 viser endringene i MAP og CVP i løpet av 1 time, så vel som endringer i hastigheten og virkningen av vasopressor infusjon.
Prosedyren har flere potensielle begrensninger. I våre studier kateter forblir patent for opp til 11 dager. Det er ukjent hvor lenge katetre ville forbli patent utover denne perioden. For å passe til de katetre som beskrevet, er det et minimum vaskulær størrelse, som omtrent samsvarer med gnager vekt, krever dyr inkludert i studien være større enn200 g. Bruken av en mindre kateterdiameter vil resultere i økt motstandsverdier å flyte redusere åpenhet. Oppnå sentralt venetrykk tiltak krever nøyaktig kateter i atriet tilstrekkelig til konto for størrelse og vekst i løpet av studieperioden, og kan være en utfordring.
Når mestret, arteriell og vaskulær kateterisering kan gi grunnlag for et bredt utvalg av gnagermodeller som krever hemodynamisk monitorering, blodprøvetaking, og infusjon av væsker eller behandlinger samtidig minimere eventuelle smerter og ubehag under instrumentering eller håndtering gang gjenvunnet. Faktisk, i forbindelse med en tidligere JOVE publikasjon 10 beskriver kateterisering av lårvenen, vi har vellykket utført denne modellen med tre implanterte katetre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
