Abstract
Успех небольшой животной модели для исследования критических заболеваний является, в частности, зависит от способности модели для моделирования условий жизни человека. Intra-трахеи прививка известного количества бактерий был успешно использован для воспроизведения патогенеза пневмонии, которая затем перерастает в сепсис. Мониторинг гемодинамики и обеспечение стандартного клинического лечения, включая инфузии антибиотиков, жидкостей и препаратов для поддержания артериального давления необходима для имитации обычной поддерживающей терапии в этой модели, но сделать это необходимо как артериальной, так и венозной сосудистого доступа. Детали видео хирургической техники имплантации сонной артерии и общие яремную вену катетер в наркозом крыса. После восстановительного периода 72 ч, животные будут повторно анестезировали и подключен к троса и поворотной установки, прикрепленной к корпусу с грызунами, которая соединяет имплантированных катетеров в систему мониторинга гемодинамики. Эта установка позволяет свободное передвижениекрысы во время исследования при непрерывном мониторинге давления, вливая жидкостей и лекарств (антибиотики, вазопрессоры) и выполнения забора крови.
Introduction
Артериальная и венозная катетеризация крыс уже давно используется в лабораторных исследованиях. 1, 2 катетеризации может быть использован для мониторинга параметров гемодинамики в том числе систолического, диастолического и среднего артериального давления (САД), частоты сердечных сокращений (ЧСС) и центрального венозного давления (ЦВД) . 3,4 Кроме того, эти катетеры позволяют вливание стандартных процедур или потенциальных терапии, а также забор крови для дальнейшего анализа основной механизм болезни или лечения. Поэтому, имея доступ к сосудам в небольшом животной модели имеет решающее значение для изучения клинических показателей производительности и эффективности лечения.
Для изучения причин, лежащих в критической болезни, важно, чтобы сначала разработать модель для имитации условий жизни людей. Intra-трахеи прививка известного количества бактерий был успешно использован для воспроизведения патогенеза пневмонии, в тяжелой легочной инфекции, которая затем перерастает в сепсис.3, 5 гемодинамический мониторинг мер и обеспечения стандартного клинического лечения имеет важное значение для моделирования обычной поддерживающей терапии. Стандартный клиническое лечение включает в себя настой антибиотиков, который помогает в очистке основной инфекции и администрации жидкостей и вазопрессоров, два терапия используется у больных с сепсисом поддерживать артериальное давление. 5-7 сосудистого доступа, в частности, внедрение патентных катетеров особенно важно, когда мы изучаем Экспериментальные методы лечения сепсиса.
На протяжении многих лет, способность к управлению стандартный клинический лечение грызунов ограничивается наличием материалов с необходимыми свойствами для построения имплантируемых катетеров и способность технологии инфузии, чтобы доставить небольшие объемы точно в течение долгого времени. Кроме того, способность инициировать настой в ответ на непрерывный мониторинг конкретной гемодинамической мере позволяет последовательно и воспроизводимым стендаARD модель лечения при использовании большего образца, размеры типично исследованиях на грызунах. 8, 9 Эти технологические ограничения в материалах и аппаратных средств точности были преодолены, но одновременно предоставить регулярные терапии при мониторинге гемодинамики, как артериальная и венозная сосудистого доступа должен быть доступен.
Детали видео хирургической техники имплантации сонной артерии и общие яремную вену катетер в наркозом крыса. После периода восстановления 72 ч, животные будут повторно наркозом и подключен к троса и поворотного установки, прикрепленной к корпусу грызунов, используемого для подключения имплантированных катетеров системы контроля гемодинамики. В ходе исследования, система позволяет для инфузии жидкости на основе либо доставки заданного объема с определенной скоростью инфузии или автоматизированная система, которая обеспечивает скорость инфузионного в зависимости от среднего артериального давления, определенного для поддержания заданного диапазона давления. Инфузионная система жидкостииспользует программируемые шприцевые насосы, которые взаимодействуют с цифровыми выходами системы сбора данных и управляются с помощью программного обеспечения мониторинга карте. Установка троса и поворотные позволяет свободное перемещение крысы в ходе исследования при мониторинге давления, инфузии жидкостей и вазопрессоры, и выполнение забор крови, без необходимости манипулировать животных. Одновременный мониторинг до 12 инструментальных животных с 2 катетеров каждый (в нашей установке) с аппаратной возможностью расширения до мониторинга 24 приборно-измерительным животных позволяет обеспечить большую гибкость для изучения нескольких слоистых групп в каждом эксперименте.
Эта процедура катетеризации может быть полезным для научно-исследовательских учреждений, которые используют аналогичные модели грызунов, требующие сосудистого доступа для контроля, отбора проб и лечения на срок до 11 дней. Если объект исследования, учитывая эту процедуру имеет опыт работы с грызунами и правильную структуру поддержки для сохранения этих животных, то developinг эти навыки могут обеспечить значительную экономию затрат, снижение общих затрат на катетерами крысы из более чем $ 180 до менее чем $ 50 (в том числе наивный крысы, компонентов катетер и технических затрат) и повышение гибкости планирования (наивные крысы легко доступны против компании графику доставки внедренных крыс). Успех этой процедуры зависит от квалификации человека, выполняющего катетеризации. Учебные животных, необходимого, чтобы стать специалистами в этой процедуре варьируется в диапазоне от 20 до 40 крыс с результатом катетера проходимость> 90%.
Protocol
Описанные ниже процедуры проводились в рамках протокола, утвержденного уходу и использованию комитета животных Клинического центра, по крайней Национальных Институтов Здоровья.
1. Подготовка к операции
- Газ стерилизации катетеров и инструментов.
2. Подготовка катетеры
- Промойте катетеров гепарином глицерина (250 МЕ гепарина / 1 мл глицерина) для обеспечения проходимости и предотвращения утечки. Вставьте конец катетера с металлической пробкой (20 Ga, 15 мм), чтобы сохранить гепаринизированной глицерин.
3. Подготовить Асептическая Workstation
- Используйте 70% спирта спрей рабочей станции и приборов лотков. Используйте стерильную салфетку, чтобы покрыть таблиц и инструментов лотки эксплуатации и место инструментов на панели задач.
4. Подготовьте крысах хирургии
- Место крысы индивидуально в Lucite камеры и подвергать анестетика; ИФ (3-5%) смесьне эд с кислородом до потери сознания. Удалить крысу из камеры и брить шерсть от передних и задних областях шеи. Нанесите смазку мазь для глаз.
5. Катетер Имплантация
- Поместите под наркозом крысы (подтверждается ног крайнем случае) на операционном столе в брюшной положении с подогревом; разместить свой нос в нос конуса для поддержания анестезии со спонтанным дыханием (ИФ; 3,5%). Аккуратно скраб области операции 3 раза чередующиеся использование Бетадин и 70% спирта. Сделать 0,5 см разрез по средней линии кожи между лопатками, используя хирургическую ножницами.
- Повторно крысу в положении лежа на спине; мягко сдерживать ноги к каждой стороне таблицы, используя резиновые полосы; поддержания анестезии. Поместите два скрученных стерильную 4x4 марлю под шею слегка гиперэкстензии для лучшего воздействия. Сделать 2 см вентральной шейки разрез кожи право средней линии шеи на уровне ключицы, используя скальпель.
6. ПравоЯремную вену катетеризации
- Использование кровоостанавливающего, прямо рассекать правую яремную вену, выделить слюнных и лимфатические ткани для визуализации и изолировать 5 мм части судна с. Использование 4-0 шелковой нити, поместите свободную связь с обеих черепно-каудального концов сосуда, чтобы максимизировать воздействие судна. Использование микро хирургическое ножницами делают разрез достаточно большой, чтобы пройти катетер, в соответствии с судна между двумя лигатурами и связать черепа лигатуру вокруг судна.
- Вставьте венозный катетер в сосуд к сердцу с помощью микро рассекает крючком и пинцетом и не продвигать катетер, пока все сегменте PU 3F находится в сосуде. Используйте лигатуры на черепно-каудального концов, чтобы обеспечить катетер в сосуд.
7. левой сонной артерии катетеризации
- Использование кровоостанавливающего, прямо рассекать Лопаточно-подъязычная мышца продольно подвергать левой сонной артерии и яsolate 5 мм сечение судна. Убедитесь, что блуждающий нерв (белый цвет) полностью отделена от артерии. Будьте осторожны, не вскрывайте перерыв или нерв.
- Использование 4-0 шелковой нити, поместите свободную галстук на хвостовом конце судна, галстук черепной конец судна и место бульдог зажим каудально над швом, чтобы остановить поток крови после разреза. Использование микро хирургического ножницы, надрезать, достаточно большой, чтобы пройти катетер, в соответствии с судна между двумя лигатурами. Вставьте артериального катетера к сердцу с помощью микро рассекает крючком и щипцами.
- Использование гладкую иглодержатель без замка, чтобы удерживать часть катетера внутри сосуда крепко перед удалением бульдог зажим. Продвигать катетер с парой щипцов, а не ослабляя иглодержатель медленно, пока весь сегмент ПУ 2F катетера в сосуде. Свяжите свободную хвостовой лигатуры вокруг катетера и судна обеспечения, но не так Тайт, чтобы закупорить, катетер.
8. С помощью поверочной кровоостанавливающего, Tunnel 5 см Труба назад подкожно за ухом и через разрез между лопатками. Экстериоризироваться катетеров через трубку и снимет трубку.
9. Закройте вентрального выреза с тремя из нержавеющей стали клипы рану, и спинной разрез с 4-0 швами из шелка, чтобы обеспечить экстериоризированного Катетеры на месте.
10. Послеоперационный мониторинг и Уход
- После катетеризации прекратить наркоз и восстановить крысу в боковом положении пролежни в клетку с постельными принадлежностями целлюлозы. Соблюдайте крыс на 2 ч интервалами в течение по крайней мере 4 часа или пока не проявляя никаких признаков боли, а затем один раз в день. Дайте кетопрофена [5 мг / кг, подкожно (SQ)] сразу же размещать процедуру и каждые 12 ч, если крыса показывает признаки боли или стресса. По нашему опыту, не крысы не требует дополнительного обезболивания для боли после применения Первол инъекции. Характеристики отмечено, что бы вызвать рассмотрение дополнительных доз аналгезии включают, но не ограничиваются ими; ненормальное положение; увеличение / уменьшение частоты дыхания, расточительный / неопрятного, инфекции / воспаления месте разреза, выделения из глаз, пилоэрекции ("шипами haircoat"), снижение активности в ответ на звуковые или тактильные раздражители.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы восстановлены в течение 72 ч, что усиление> 10 г от веса предварительно катетеризации будут зачислены в исследовании.
11. Подключение к гемодинамики системе
- После восстановления, зарегистрируйтесь здоровых крыс (веса> 10) в исследовании. Поместите крыс в камере Lucite и анестезию, как описано выше.
- Поместите стерильную салфетку на операционном столе стерильной кровоостанавливающего, микро щипцы, 1 мл шприцы с тупой иглой прилагается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики кровоостанавливающего должна быть покрыта резиной, чтобы избежать повреждения катетера. Поместите под наркозом крыса на хирургическоестол в брюшной Должность и место носа в носового конуса поддержания анестезии (3-5%) со спонтанным дыханием. - Зажим артериальный и венозный катетер помощью пары резиновых ограничен кровоостанавливающих чуть ниже металлические штыри вилки. Используйте пару щипцов, чтобы удалить металлический штифт в конце катетера и прикрепить шприц 1 мл, заполненный физиологическим раствором гепарина с тупым иглой. В свою очередь, удалить кровоостанавливающих и вывести 0,1 мл, чтобы обеспечить катетеры патент.
- Повторное зажим катетеров, удалить иглу и приложить этот конец более длинного катетера (предварительно продувают гепарина физиологического раствора), который подключен к вертлюга и привязанного на верхней части обувной коробки клетке. Соедините эти катетеры для датчиков для сбора данных и записи, выборки, или инфузии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все катетеры защищены спиральная пружина трубопроводов достаточно долго, чтобы позволить животного полный диапазон движения в их клетке. - После катетер соединение, прекратить наркоз ивосстановить животных в грудины положение в клетке с подстилкой целлюлозы. Для поддержания артериального катетера, вручную промойте линии с 0,05 мл гепарина физиологического раствора (50 МЕ / мл) через 1 час в течение 24 часов, которые совпадают с обычными оценками животных.
12. Кровь Отбор проб, мониторинг давления и медикаментов
- Прикрепите пустой шприц, чтобы запорный кран подключается к артериального катетера и вывести 0,6 мл встроенный флеш. Прикрепите образец шприц, возьмите образец, и вернуть 0,6 мл встроенный флеш затем 0,7 мл гепаринизированной соленых флеш.
- Использовать данные приобретение аппаратных средств и программного обеспечения для измерения и регистрации MAP и частоты сердечных сокращений непрерывно.
- Подключите автоматизированной системы доставки лекарственных средств (дополнение) к венозным катетером.
ПРИМЕЧАНИЕ: добавление регулирует скорость вазопрессорной инфузии (высокий, низкий, или 0 доз) на основании карты обнаруженном поддерживается давление в пределах нормы физиологической диапазоне.
Representative Results
Изменения в сосудистой давлении передаются через жидкость заполнено катетеров (рисунок 1) и преобразуют в электрические сигналы, представленные гемодинамических сигналов (фиг.2, 3). Без сосудистого доступа, не может быть эти меры. Real-Time Streaming из сигналов позволяет обнаруживать и анализ изменений на такт бить основу (Рисунок 2). Сжатие временного масштаба сигналов позволяет для количественного изменения, которые могут произойти в течение более длительного периода времени (от минут до дней) (рис 3, верхние 4 сигналов), которые могут быть связаны с изменениями в тарифах вазопрессоров инфузионных (рис 3, нижние 4 сигналов).
Рисунок 1. Катетер: Детали компонентов артериальной и венозных катетеров ПУ, полиуретан;. PE, полиэтилен (длина сегмента) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. в режиме реального времени КАРТА формы волны 4 типичной грызунов 7 дней после катетеризации в течение 7 сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Время сжимается КАРТА формы волны 4 типичной грызунов (верхние 4 волновых форм) 7 дней после катетеризации в течение 1 ч. При MAP усредняется (Нижняя 4 сигналов), это значение используется для запуска добавляет, высокий (<90 мм рт.ст.) , низкая (<100 мм рт.ст.) или остановить (> 110) ответ поток от насоса вливания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
Исследование терапевтические подходы к клинической модели заболевания диктует необходимость способность точно выполнять гемодинамики мониторинга, таким образом, требует сосудистого доступа. В нашей модели сепсиса, артериальная катетеризация обеспечивает мониторинг системного давления и венозного Катетеризация позволяет для применения стандартной клинической терапии. Стандартная терапия сепсиса включает вливание антибиотиков для лечения бактериальной инфекции и вливание жидкостей и вазопрессоров для поддержания артериального давления в пределах требуемого диапазона. Оба катетера используются для забора крови. В этой конструкции, применение программируемого инфузионных насосов с автоматическим срабатываний вазопрессорной скорости инфузии на основе реального времени среднее артериальное давление является преимуществом по сравнению с клинической, который требует ручного титрования медицинского персонала и в доклинических настройки делает использование этого метода лечения возможного для изучения большого количества животных.
. e_content "> Некоторые осложнения были испытаны в начале разработки модели К ним относятся частичное окклюзии обеих артериальных и венозных катетеров из более чем ужесточения, связей на pu2 и PU3 компонентов, (1-2%); в ненадлежащее место яремной венозного катетера в веточка (<1%); необъяснимая внезапная смерть после восстановления (без легких тромбом или других повреждений органов очевидной), (1-2%) было принято решение, сохраняя изофлурановой концентрации 2-3,5% с уплотнительным скоростью 2 потока 2 л / мин . Другие общие хирургические осложнения кровоизлияния, местной инфекции и себе самому ущерб не наблюдалось. После хирургического знание достигается, каждая процедура должна быть в состоянии быть завершена в не более чем на 15 мин. показатель успеха измеряется как здорового восстановления и патент катетеры, можно ожидать, что более 90% после полного подготовку. дополнительное животное, включенный в каждом исследовании, чтобы свести к минимуму потери данных и общее количество животных, необходимых и учетную запись для неудачного катетера, который может быть "втолько слияние "или смертности из-за осложнений.Наиболее важным шагом в этой процедуре является дизайн и размещение катетеров. Материалы должны быть мягкими на кончике, чтобы не протыкать стенку сосуда без опрессовки слишком легко. Тело катетера должен быть жестче (чем кончик), чтобы быть в состоянии продвинуться в сосуд достаточно и быть закреплены на месте. Рисунок 1 показывает 3 диаметров труб, которые подключены к артериального катетера и 2 различных труб диаметром подключенного для венозных катетеров. Эти компоненты скользили друг в друга, чтобы уменьшить диаметр катетера на кончике и склеены с анкерами, добавленных чтобы обеспечить размещение катетера в сосуде или в сердце поддерживается.
После восстановления и подключен к поворота и троса, карта и CVP сигналы должны выглядеть примерно основании данных, представленных на рисунке 2. Для поддержания артериального катетера patencу в ходе мониторинга, ежечасно гепарин солевой флеш (0,05 мл) должны быть выполнены. Непрерывная инфузия поддерживает венозный катетер проходимости. В линии связи и флеш пристальное внимание должно быть уделено застраховать нет пузырьков воздуха в линии. Воздушный пузырь ≥0.1ml может привести к эмболии в легких, мозге или других органах. Гемодинамические сигналы записаны и проанализированы в течение всего исследования. При сжатии времени по оси х, 3 показаны изменения на карте и CVP над курсом 1 ч, а также изменение скорости и эффекта вазопрессорной инфузии.
Процедура имеет несколько потенциальных ограничений. В наших исследованиях, катетеры остаются патент на срок до 11 дней. Это неизвестно, как долго будет оставаться катетеры патент за этот период. Для установки катетеров, как описано, существует минимальный размер сосудов, что примерно коррелирует с весом грызунов, требующих животных участие в этом исследовании, чтобы быть больше, чем200 г. Использование меньшего диаметра катетера приведет к увеличению сопротивления потоку снижения проходимости. Достижение центральные меры венозного давления требуется точное размещение катетера в атриуме достаточное для учета размера и роста в течение всего периода исследования и может быть проблемой.
После того, как освоены, артериальная и сосудистая катетеризация может служить основой для широкого спектра моделей грызунов, требующих гемодинамики мониторинг, анализ крови и вливание жидкостей или лечения при минимизации боли и страдания при аппаратуры или обработки сразу выздоровел. В самом деле, в сочетании с предыдущей публикации JOVE 10, описывающей катетеризации бедренной вены, мы успешно выполнили эту модель с 3 имплантированных катетеров.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
