Summary
אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.
Abstract
Erythropoiesis כרוך בתהליך דינמי שמתחיל ביחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es) ואחריו המתחלק במהירות המושבה erythroid להרכיב יחידות (CFU-Es). לאחר CFU-Es, תאי מורפולוגית לזיהוי ובדרך כלל מכונה erythroblasts מסוף. אחד האתגרים לחקר erythropoiesis המסוף הוא חוסר גישות ניסיוניות לנתח פונקציות גן באופן כרונולוגי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית כדי לקבוע פונקציות גן בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. במערכת זו, TER119 העכבר העוברי כבד (סמן תא erythroid הבוגר) erythroblasts השלילי היו מטוהר וtransduced עם ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין. התאים היו בתרבית לאחר מכן בגורמי גדילה בינוניות המכיל מלבד אריתרופויאטין (EPO) כדי לשמור על הבמה אביהם עבור שעות 12 תוך מתן האפשרות לcDNAs אקסוגניים או shRNAsלהביע. התאים שונו עד בינוני Epo לאחר שעה 12 לגרום התמיינות תאים והתרבות ואילו החומרים גנטיים אקסוגני כבר הביעו. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף. ללמוד erythropoiesis מסוף שלב מאוחר, תאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. בדרך זו, התאים היו כבר הבדילו לשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף כאשר החומרים גנטיים transduced באו לידי ביטוי. אנו ממליצים יישום כללי של אסטרטגיה זו, שיסייע להבין את פונקציות גן מפורטות בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.
Introduction
Erythropoiesis הוא התהליך של התמיינות של תאי גזע hematopoietic multipotent להבשיל אריתרוציטים. תהליך הדרגתי זה כולל הקמת יחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es), היחידות המתחלקות במהירות erythroid המושבה להרכיב (CFU-Es), ומורפולוגית erythroblasts זיהוי 1,2. erythropoiesis מסוף מתאי אב CFU-E כרוך אריתרופויאטין תלוי רציף ושלבים עצמאיים 2,3. בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, אריתרופואטין (EPO) נקשר לקולטן שלו על פני התא וגורם לסדרה של מסלולי איתות במורד הזרם המונעים אפופטוזיס תא ולקדם חלוקות תא מהירות וביטוי גני 1,4. בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, erythroblasts לעבור יציאת תא מסוף מחזור, הכרומטין ועיבוי גרעין, ושחול של הגרעינים מרוכזים מאוד 5.
ההבנה של מסוף שלנוerythropoiesis השתפר מאוד בעשורים האחרונים, שהוא במידה רבה עקב השימוש המוצלח של כמה במבחנה ובמודלים של עכברי vivo 6-9. בין הדגמים הללו, בתרבות במבחנה של erythroblasts כבד עכבר עוברי מספק יתרונות רבים, כולל את הקלות של טיהור תא, התפשטות מהירה ובידול, וקרוב יותר לחקות לerythropoiesis אדם 10,11. במערכת זו, מספר גדול של תאי אב erythroid מכבדים עובריים של עכבר יכול להיות מבודד בקלות על ידי הטיהור היחידה צעד של TER119 (סמן לתאי erythroid הבוגרים) erythroblasts השלילי. במהלך התרבות בת היומיים של erythroblasts, ההתמיינות של תאים אלה יכול להיות במעקב על ידי ניתוח התזרים cytometric מבוסס על ביטוי פני השטח של קולט transferrin (CD71) ואנטיגן TER119 12. בנוסף, אנוקלאציה של erythroblasts בידול סופני יכולה להיות מזוהה על ידי יצרנית DNA (Hoechst 33342) 13. יתר על כן, האבות המטוהרים ניתן מהונדסים גנטי על ידי ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין, המאפשר מחקרים מכניסטית של הפונקציות של ביטוי גנים בerythropoiesis 11,13,14.
מצד השני, שיעור צמיחת תאים המהיר יכול להיות חרב פיפיות, שכן קשה לאפיין פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. ברוב המקרים, קשה לקבוע אם פונקציות גן ספציפיות בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף מאז על ידי הזמן cDNAs או shRNAs הביע, התאים כבר עברו את השלב המוקדם. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מערכת ייחודית לנתח המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי המהונדס גנטי היה בתרבית במדיום Epo נטול אבל מכיל תאי גזע גורם (SCF), IL-6 וFLT3ליגנד כדי לשמור על מעמד אביהם ולאפשר cDNAs transduced או shRNA לביטוי 13. התאים שונו למדיום המכיל Epo לאחר שעה 12 לגרום התפשטות תאים והתמיינות. בדרך זו, כאשר התאים התחילו להבחין, cDNAs transduced או shRNAs כבר הביעו. עבור השלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי היו בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה. לכן, ניתן לנתח את הפונקציות של הגנים של עניין בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף. לסיכום, יישום רחב של מערכת זו יעזור פונקציות גן לנתח בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.
.1 הכנת בינוני התרבות
- הכן פתרון פיברונקטין. הוסף 1 מ"ל של מים לבקבוקון אחד של פיברונקטין אדם (1 מ"ג). השאר פתרון למכסת המנוע בתרבית הרקמה ל30 דקות ללא תסיסה. העבר את הנוזל הכולל 50 מ"ל של PBS לעשות ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ובעדינות מערבב היטב. הפוך את פתרון פיברונקטין טרי לפני ציפוי הצלחת (ראה להלן).
- הכן 50 מ"ל של מדיום Epo חופשי (בינוני SCF). מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי.
- הכן 50 מ"ל של מדיום המכיל Epo. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 2. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי. .2 פלייט מצופה פיברונקטין
- הוסף פתרון פיברונקטין 1 מ"ל היטב בכל צלחת 6 היטב (או 0.5 מ"ל היטב בכל צלחת גם 12). השאר את הצלחת במכסת המנוע בתרבית רקמה עבור שעה 1.
- יש לשטוף את בארות עם מים סטריליים פעמיים ואוויר יבשים הצלחת.
- לעטוף את הצלחת ולשמור בחדר הקר ב 4 ° C..
- הכנה של התאים העובריים סה"כ הכבד
- להקריב את mouse משאיפת CO 2 ונקע בצוואר הרחם. תרסיס הבטן עם אתנול 70% לחיטוי. פתח את הבטן עם לנתח מספריים כדי להסיר את הרחם. שטוף את הרחם ב1x PBS.
- לנתח את העוברים בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע בתרבית רקמה וכלי autoclaved ולשטוף בPBS 1x.
- לנתח את הכבדים העובריים מהעוברים. החזק את גופו של העובר עם מלקחיים, משוך בעדינות את כבד העובר (בצבע הוורוד) מהגוף עם מלקחיים אחר. נקה את כבד העובר עם המלקחיים כדי להסיר את רקמות fibrotic הקשורות. מניחים את כל הכבדים העובריים לתוך טרי 1x PBS המכילים 10% בסרום שור העובר.
- מכאני לשבש כבדים עובריים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant וresuspend התאים 1 מ"ל PBS עם 10% FBS (כ 8 E13.5 כבדים עוברייםלכל מ"ל).
- טיהור של TER119 Erythroblasts שלילי
- לחסום את התאים עם IgG חולדה (0.2 מ"ג / מ"ל) על קרח במשך 15 דקות.
- ללא שטיפה או צנטריפוגה, להוסיף נוגדן אנטי TER119 biotinylated להשעית התא (1 מיקרוגרם / מ"ל). דגירה של 15 דקות על קרח.
- לשטוף ב1x PBS עם 10% FBS (1:10) ו צנטריפוגות ב XG 800 למשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS עם 10% FBS.
- הוסף 75 μl streptavidin מצומדות עם חלקיקים מגנטיים ודגירה של 10 דקות על קרח.
- הוסף את הנפח ל2.5 מ"ל עם PBS המכיל 10% FBS. מעבירים את ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל פוליפרופילן עגול צינור תחתון.
- הכנס את הצינור לתוך מנגנון מיון תאים מגנטי ודגירה של 10 דקות. תאים חיוביים TER119 יצרפו לצד של הצינור. Erythroblasts השלילי TER119 הפנוי יישאר בהשעיה.
- יוצקים את ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל פוליפרופילן חדש עגול צינור תחתון.
- חזור על השלבים 3.2.6 ו3.2.7 כדי להסיר את התאים החיוביים TER119 השיורי.
- גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב את supernatant. Resuspend תאי 1 מ"ל PBS המכיל 10 FBS% ולספור תאים חיים עם Trypan הכחול.
- פלייט תאי כבד TER119 המטוהר השליליים העובריים ב3-5 x 10 5 / גם בפיברונקטין מצופה 12 גם צלחת (להתאים את מספר התא, אם באמצעות צלחת שונה).
- להוסיף polybrene לריכוז סופי של 10 מ"ל / מיקרוגרם כדי להקל על התמרה ויראלית. ספין להדביק את התאים עם lentiviruses או רטרווירוסים, cDNA קידוד או shRNA, ב800 XG ל1-1.5 שעה על 37 מעלות צלזיוס.
- כדי לבדוק פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מקווקווים).">
תרבות תאי transduced במדיום חופשי (בינוני SCF) EPO לשעה 12 כדי לאפשר הביטוי של גנים והתחזוקה של מדינת אב transduced. - צנטריפוגה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend תאי 1 מ"ל Epo המכילים בינוני בכל אחד גם צלחת 12 גם.
- אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים עבור מבחני נוספים.
- פונקציות גן המבחן בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מוצקים).
- תרבות תאי transduced מייד במדיום המכיל Epo.
- אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים למבחנים נוספים.
- לשטוף וresuspend תאי 1x PBS. קציר 2 x 10 5 תאים בתרבית לניתוח התזרים cytometric.
- דגירההתאים עם נוגדני fluorophore מצומדות- ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. כדי לבדוק בידול, להשתמש נגד TER119 מצומדות APC אנטי CD71 מצומדות וPE. כדי לבדוק אנוקלאציה, להשתמש כתם Hoechst 33342 בנוסף לנוגדנים האחרים.
- שטוף תאים עם 1x PBS. Resuspend תאי 0.5 מ"ל PBS המכילים 1% FBS ויודיד propidium (PI) (1 מיקרוגרם / מ"ל) להכתים את התאים המתים ומוציא אותם מניתוח.
- זרימת התנהלות ניתוח cytrometric. לנתח תאי בקרת צבע המוכתם ובלא כתם הסינגל ראשון להסתגלות ופיצוי של cytometer את הזרימה.
.3 טיהור Erythroblasts הכבד העוברי
הערה: כבדי העובר שימוש מE13 לE15 מתוזמן עכברים בהריון (C57BL / 6). כבדי E13.5 הם העדיפו למקסם את התשואה של אבות CFU-E. כדי להשיג את העכברים בהריון בעיתוי, זכר בן 6 עד 8 שבועות ונקבות עכברים הושמו בכלוב אחד (בדרך כלל זכר אחד עם נקבות אחד או שתיים). תקעי נרתיק נקבה נבדקו למחרת בבוקר כדי לקבוע אם ההזדווגות הייתה מוצלחת. היום הראשון של הריון היה היום אחרי התקע נמצא.
התמרה .4 עם וירוסי הקידוד cDNA או shRNA
.5 תרבות של Erythroblasts העוברי העכבר שלילי transduced TER119 הכבד
.6 הכתמה של התאים בתרבית עוברי כבד לניתוח תזרים cytometric
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את האסטרטגיות הניסיוניות. הפרוטוקול מורכב משני תנאים עצמאיים למיקוד הפונקציות של מולקולות איתות בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. TER119 erythroblasts כבד העובר השלילי היו מטוהר מן עובר עכבר E13.5. ניתוח תזרים cytometric של תאי erythroid כבד העובר לפני ואחרי הטיהור הוכיח כי הטיהור הייתה יעילה (2A דמויות ו2B). עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף (איור 1, קווים מקווקווים), אחרי התמרה ויראלית, התאים בתרבית במדיום Epo חינם (בינוני SCF) במשך שעה 12. במהלך תקופה זו, התאים הראו בידול מינימאלי (איור 2 ג) ללא אפופטוזיס משמעותי שנצפה בתאי transduced (GFP החיובי) (איור 3). התאים החלו להבחין לאחר העברה למדיום Epo המכיל (איור 4 strong>), שהיה דומה לתאים בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה (איור 1, קווים מוצקים ואיור 5). במהלך תרבות 2 יום במדיום המכיל Epo בשתי השיטות, רוב תאי אב erythroid (TER119 הנמוך CD71 נמוך) הציג אינדוקציה של הקולטן transferrin (CD71) וTER119 ביום 2 (איור 4 א (CD71 הגבוה TER119 גבוה) ואיור 5A). Enucleation התרחש ביום 2, כפי שנצפה על ידי גבוה TER119 Hoechst הגבוה (erythroblasts) וHoechst TER119 הנמוך גבוה (רטיקולוציטים) (איור 4 ואיור 5 ב). יש לציין שהתאים באופן מיידי תרבות בEpo (קו מוצק) היו יחסית יותר יעיל לבידול ואנוקלאציה מאשר תאים בתרבית ראשון במדיום SCF (קו מקווקו).
תרשים 1 "FO: תוכן width =" 5in "width =" 500 "= src" / קבצים / ftp_upload / 51,894 / 51894fig1highres.jpg "/>
איור 1 סקירה סכמטי של האסטרטגיה הניסיונית. מקווקו וקווים מוצקים מייצגים שיטות ללימוד מולקולות איתות בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים, בהתאמה.
איור 2 ניתוח תזרים cytometric של עכבר תאי erythroid כבד העובר לפני ואחרי הטיהור של TER119 erythroblasts השלילי. (א) בתאי כבד עובריים סה"כ מוכתמים בTER119 וCD71. תאים שליליים (B) מזוקק TER119 מוכתם בTER119 וCD71. (C) מזוקק TER119 תאים שליליים לאחר תרבות 12 שעות במדיום SCF. תחנוניםדואר לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 זרימת ניתוח cytometric של אפופטוזיס לאחר התרבות במדיום Epo חינם (בינוני SCF) במשך שעה 12. TER119 erythroblasts השלילי (AB) היו transduced עם lentiviruses שליטה (א) או lentiviruses קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (ב). אחוז תאי transduced החיוביים GFP הוצג לאחר 12 שעות של התרבות במדיום SCF. (CD) ניתוח של אפופטוזיס בGFP השלילי (C) ותאים חיוביים (D) מ (B).
איור 4 ניתוח cytometric זרימה של בידול ואנוקלאציה של erythrobla transducedSTS בתרבית בינוני SCF ואחריו בינוני Epo. () כמו באיור 3, תאים שליליים וחיוביים GFP היו סגור לניתוח בידול באמצעות CD71 וTER119 לאחר התאים שונו עד בינוני Epo ותרבותי עבור 48 שעות נוספות. Assay (B) Enucleation באמצעות Hoechst וTER119 של הצביע תאים לאחר 48 שעות במדיום Epo.
ניתוח cytometric איור 5 זרימה של בידול ואנוקלאציה של erythroblasts transduced ישירות בתרבית בינונית Epo. () TER119 התאים השליליים היו transduced עם lentiviruses קידוד GFP. התאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. ניתוח התמיינות תאים של תאים שליליים וחיוביים GFP בוצע באמצעות CD71 וTER119 לאחר 48 שעות בתרבות. assay Enucleation (B) שלהתאים שצוינו באמצעות Hoechst וTER119 לאחר 48 שעות בתרבות.
| מרכיב | כמות |
| IMDM | 41.385 מ"ל |
| סרום שור העובר (FBS, 15%) | 7.5 מ"ל |
| ב-mercaptoethanol (10 -4 M) | 50 μl (10 -1 מניית M בIMDM) |
| פניצילין, סטרפטומיצין (1%) | 500 μl |
| גלוטמין (2 מ"מ) | 500 μl |
| גזע פקטור נייד (50 ng / ml) | 25 μl מ100 מניית מ"ל / ng |
| FLT3 יגנד (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 μl מ50 מניית מ"ל / ng |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 μl מ100 מניית מ"ל / ng |
טבלה 1 מרכיב FOבינוני r SCF (מדיום חופשי EPO).
| מרכיב | כמות |
| IMDM | 36.3 מ"ל |
| FBS (15%) | 7.5 מ"ל |
| שור הסרום אלבומין (BSA, 10%) | 5 מ"ל (10% מניות בIMDM) |
| אינסולין (10 מ"ג / מ"ל) | 50 μl ממניות 4 ° C. |
| Holo-transferrin (200 מ"ג / מ"ל) | 200 μl (50 מ"ג / מ"ל במים, -20 ° מניית C) |
| ב-mercaptoethanol (10 -4 M) | 50 μl (10 -1 מניית M בIMDM) |
| פניצילין, סטרפטומיצין (1%) | 500 μl |
| 2 מ"מ גלוטמין | 500 μl |
| EPO (2 U / ml) | 33 μl (3,000 מניות / מ"ל U) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים מערכת ייחודית לניתוח erythropoiesis מסוף כבד העובר עכבר כרונולוגי. באמצעות היישום של תנאי תרבות שונים, נתחנו בהצלחה erythropoiesis מסוף בתחילת וסוף השלבים. הדבר חשוב במיוחד על מנת לקבוע את המנגנונים של גנים עם פונקציות מרובות. לדוגמא, GTPases Rac לשחק תפקידים חשובים בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. עיכוב של GTPases Rac בשלב המוקדם של התמיינות תאי השפעות erythropoiesis מסוף ושגשוגם. מצד השני, עיכוב הפעילות של GTPases Rac בשלב מאוחר של אנוקלאציה לוקי erythropoiesis מסוף מבלי להשפיע על התמיינות תאים, התפשטות, או הישרדות 13.
כמה צעדים חשובים בפרוטוקול זה צריכים להיות כל הזמן בראש. ראשית, כבדי העובר E13.5 עכבר עדיפים לטיהור TER119 תאים שליליים. ניתן להשתמש בו אך proporti עוברים מבוגריםעל של האבות מתוך תאי כבד העובריים הכולל יהיה נמוך. שנית, זה חשוב להשתמש בBSA רעלן הפנימי נמוך במדיום Epo שכן הוא קריטי לאנוקלאציה, למרות שהמנגנון לא ברור. שלישית, למרות שפיברונקטין נמסר להיות חשוב לerythropoiesis 15, מצאנו כי השימוש בצלחת מצופה פיברונקטין היה אופציונלית. זה לא משפיע על שגשוג תאים, התמיינות, או אנוקלאציה במערכת שלנו. עם זאת, פיברונקטין יכול להיות שימושי עבור התאים לצרף לצלחת שעשויה להיות חשוב עבור יישומים מסוימים, כגון immunostaining. רביעית, באחוז קטן של רטיקולוציטים או erythroblasts שלב מאוחר עלול לאבד את אות GFP שנערכה עם תאי transduced. לחלופין אנו משתמשים CD4 אנושי כסמן כדי לעקוב אחר תאי transduced. לבסוף, דיווחים קודמים מומלצים הסרת אריתרופויאטין מהתרבות ביום 1 11. מצאנו כי לא היה צורך לעשות זאת מאחר שאין הבדל משמעותי בתאבידול, הפצה, או אנוקלאציה עם או בלי הסרת אריתרופויאטין. להיפך, שינוי של מדיום עלול לגרום לאובדן תא.
תוך שימוש באותה האסטרטגיה, לאחרונה גילו יותר מ 30 גנים הלשחק פונקציות רומן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף (Zhao et al., תוצאות לא פורסמו). כמו GTPases Rac, רבים מהגנים האלה לשחק פונקציות כפולה בשני השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. זה מצביע על כך מסלולי איתות בerythropoiesis המסוף מחוברים ביניהם באופן הדוק. גני המעורבים בשלד תא אקטין שיפוץ ועיבוי גרעיני הם אלה שנוטים לשחק פונקציות כפולה בשל התפקידים הקריטיים של מסלולי איתות אלה בerythropoiesis מסוף. מצד השני, גני המעורבים במסלולים כגון סינתזת heme ודור של קרום פלזמה הספציפי erythroid נוטים להיות מוגבל יותר בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף 16,17. למרות שיסדואר מגבלות מסוימות של אסטרטגיה ניסיונית זה, כגון יעילות נמוכה יחסית זיהום בהשוואה לתמרה של שורות תאים, וקושי של דריסה חלבונים עם זמן מחצית חיים ארוכים, אנו ממליצים ששגרה להשתמש במערכת שלנו מתוך הבנה לחשיבות לנתח פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. בנוסף, אסטרטגיה ניסיונית זו יכולה לשמש גם ליישומים אחרים. לדוגמא, שימוש במצב התרבות בינונית SCF, הגנים שמעורבים באחזקה של נכסים בתאי גזע כגון התחדשות עצמית או בידול יכולים להיות מנותחים. תוך שימוש בשיטה לניתוח erythropoiesis שלב מאוחר, אפשר גם לקבוע את הפונקציה של גנים שיכולים להיות מעורב בautophagy להסרת אברונים.
באופן כללי, אסטרטגיה ניסיונית זו יכולה להיות מיושמת על החקירה התפקודית של מערכות hematopoietic אחרות כגון megakaryopoiesis וmyelopoiesis. יישום מוצלח של זה זהtrategy היה חושף גם את הצד הנסתר של המנגנונים המולקולריים של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים של תאי דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי NIH R00HL102154, ואגודה אמריקנית של הפרס חוקר המטולוגיה לP ג'י.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
