Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

Published: September 9, 2014 doi: 10.3791/51894
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Northwestern University

Summary

نقدم في المختبر الماوس الجنين نظام الثقافة أرومة الحمراء الكبد أن يشرح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. هذا النظام يسهل التحليل الوظيفي للجينات محددة في مراحل النمو المختلفة.

Abstract

ينطوي الكريات الحمر عملية ديناميكية التي تبدأ مع وحدات ملتزمة محمر انفجار تشكيل (الاتحاد البلغاري في Es-)، يليه تقسيم بسرعة محمر مستعمرة (كفو-الخانات). بعد كفو-ES، الخلايا هي معترف بها شكليا ويسمى عموما الأرومة الحمراء الطرفية. واحدة من التحديات لدراسة الكريات الحمر المحطة هو عدم وجود مناهج تجريبية لتشريح وظائف الجينات بطريقة متسلسلة زمنيا. في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجية فريدة من نوعها لتحديد وظائف الجينات في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. في هذا النظام، وتنقيته الماوس TER119 كبد الجنين (محمر ناضجة خلية علامة) الأرومة الحمراء السلبية وtransduced مع التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة. ومثقف الخلايا بعد ذلك في عوامل النمو الأخرى من المتوسط ​​تحتوي الإريثروبويتين (EPO) للحفاظ على مرحلة السلف لمدة 12 ساعة بينما يسمح للcDNAs الخارجية أو shRNAsللتعبير. تم تغيير الخلايا لإبو المتوسطة بعد 12 ساعة للحث على تمايز الخلايا وانتشارها في حين أعرب عن المواد الوراثية خارجية بالفعل. هذا البروتوكول يسهل تحليل وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة. لدراسة المرحلة المتأخرة محطة الكريات الحمر، تم زرعها في خلايا فورا إبو المتوسطة بعد ترنسدوكأيشن. وبهذه الطريقة، كانت خلايا متباينة بالفعل إلى مرحلة متأخرة من الكريات الحمر عند محطة وأعرب عن المواد الوراثية transduced. نوصي التطبيق العام لهذه الاستراتيجية التي من شأنها أن تساعد على فهم وظائف الجينات مفصلة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.

Introduction

الكريات الحمر هي عملية تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات لتنضج كرات الدم الحمراء. وتشمل هذه العملية تدريجية تشكيل وحدات تشكيل ملتزمة محمر انفجار (الاتحاد البلغاري-ES) وعلى سرعة تقسيم الوحدات محمر تشكيل مستعمرة (كفو-ES) وشكليا والأرومة الحمراء التعرف 1،2. الكريات الحمر محطة من الخلايا الاولية كفو-E-إرثروبويتين ينطوي متتابعة تعتمد ومراحل مستقلة 2،3. في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة، هرمون الإيريثروبويتين تربط لمستقبلات على سطح الخلية ويدفع سلسلة من مسارات إشارات المصب التي تمنع موت الخلايا المبرمج الخلية وتعزيز الانقسامات الخلوية السريعة والتعبير الجيني 1،4. في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة، الأرومة الحمراء الخضوع دورة الخلية الطرفية الخروج، لونين والتكثيف النواة، وقذف نوى مكثف للغاية 5.

فهمنا للمحطةالكريات الحمر قد تحسنت كثيرا في العقود القليلة الماضية، والتي هي إلى حد كبير بسبب نجاح استخدام عدة في المختبر وفي الجسم الحي نماذج الماوس 6-9. من بين هذه النماذج، في الثقافة المختبر من الماوس الجنين الأرومة الحمراء الكبد يوفر العديد من المزايا بما في ذلك سهولة تنقية الخلايا، والانتشار السريع والتمايز، وأقرب إلى تقليد الكريات الحمر البشري 10،11. في هذا النظام، وأعداد كبيرة من الخلايا محمر السلف من الماوس كبد الجنين يمكن عزلها بسهولة عن طريق تنقية خطوة واحدة من TER119 (علامة للخلايا ناضجة محمر) الأرومة الحمراء السلبية. خلال ثقافة لمدة يومين من الأرومة الحمراء، والتفريق بين هذه الخلايا يمكن رصدها من خلال تحليل تدفق cytometric على أساس التعبير سطح مستقبلات ترانسفيرين (CD71) والمستضد TER119 12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن قلع من الأرومة الحمراء عضال التمايز بواسطة صانع الحمض النووي (هويشت 33342) 13. وعلاوة على ذلك، فإن الأسلاف المنقى يمكن تعديلها وراثيا عن طريق التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة، مما يسهل الدراسات الميكانيكية للمهام التعبير الجيني في الكريات الحمر 11،13،14.

من ناحية أخرى، يمكن أن معدل نمو الخلايا سريع يكون سيفا ذا حدين لأنه من الصعب لتوصيف وظائف الجينات في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. في معظم الحالات، فإنه من الصعب تحديد ما إذا كان الجين وظائف محددة في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة منذ بحلول الوقت أعرب عن cDNAs أو shRNAs، الخلايا مرت بالفعل في مرحلة مبكرة. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير نظام فريد لتشريح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. للمرحلة الأولى من محطة الكريات الحمر، وكانت معدلة وراثيا TER119 الأرومة الحمراء السلبية مثقف في المتوسط ​​مجانا إبو ولكن تحتوي على الخلايا الجذعية عامل (SCF)، IL-6 و FLT3يجند للحفاظ على حالة السلف وتسمح cDNAs transduced أو shRNA التعبير 13. تم تغيير الخلايا لإبو تحتوي على المتوسط ​​بعد 12 ساعة للحث على تكاثر الخلايا والتمايز. في هذه الطريقة، عندما بدأت خلايا للتمييز، وأعرب بالفعل cDNAs transduced أو shRNAs. لمرحلة متأخرة من الكريات الحمر محطة، كانت TER119 الأرومة الحمراء السلبية المستزرعة في إبو تحتوي على المتوسط ​​مباشرة بعد ترنسدوكأيشن. وبالتالي، يمكن للمرء أن تحليل وظائف الجينات من الاهتمام في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة. وباختصار، فإن التطبيق الواسع لهذا النظام يساعد على وظائف الجينات تشريح في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة نورث وسترن المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. إعداد متوسط ​​الثقافة

  1. إعداد الحل فبرونيكتين. إضافة 1 مل من الماء إلى قارورة واحدة من فبرونيكتين الإنسان (1 ملغ). ترك حل في غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة دون الانفعالات. نقل السائل الإجمالي إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني لجعل تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل وتخلط جيدا بلطف. جعل الحل فبرونيكتين جديدة قبل طلاء لوحة (انظر أدناه).
  2. تحضير 50 ​​مل من إبو المتوسطة مجانا (SCF المتوسطة). الجمع بين العناصر المدرجة في الجدول 1. يمكن تخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر عندما قام الطازجة.
  3. تحضير 50 ​​مل من إبو تحتوي على المتوسط. الجمع بين العناصر المدرجة في الجدول 2. ويمكن تخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر عندما قام الطازجة.
    4. 2. فيبرونكتين] لوحة المغلفة

    1. إضافة 1 مل من محلول فبرونيكتين إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا (أو 0.5 مل لكل بئر من 12 لوحة جيدا). ترك لوحة في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة لمدة 1 ساعة.
    2. شطف الآبار مع الماء المعقم مرتين والهواء الجاف لوحة.
    3. التفاف لوحة وحفظ في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.

    3. تنقية الكبد الجنين الأرومة الحمراء

    ملاحظة: استخدام كبد الجنين من E13 إلى E15 انتهت مهلة الفئران الحوامل (C57BL / 6). ويفضل كبد E13.5 لتعظيم العائد من الأسلاف كفو-E. للحصول على الفئران الحوامل في الوقت المناسب، وضعت 6 إلى 8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران في قفص واحد (عادة الذكور واحد مع واحد أو اثنين من الإناث). تم فحص المقابس المهبل الإناث في صباح اليوم التالي لتحديد ما إذا كان التزاوج الناجح. كان اليوم الأول من الحمل في اليوم التالي تم العثور على المكونات.

    1. إعداد خلايا الكبد إجمالي الجنين
      1. التضحية مذكرة التفاهمSE بنسبة CO 2 الاستنشاق وخلع عنق الرحم. رش البطن مع الايثانول 70٪ لتطهير. فتح البطن مع تشريح المقص لإزالة الرحم. غسل الرحم في برنامج تلفزيوني 1X.
      2. تشريح الأجنة تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء زراعة الأنسجة وأدوات تعقيمها ويغسل في برنامج تلفزيوني 1X.
      3. تشريح كبد الجنين من الأجنة. عقد جسم الجنين مع واحد ملقط، برفق الكبد الجنين (وردي اللون) بعيدا عن الجسم مع ملقط آخر. تنظيف الكبد الجنين مع ملقط لإزالة الأنسجة متليف المرتبطة بها. وضع كل كبد الجنين في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني.
      4. تعطيل كبد الجنين ميكانيكيا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
      5. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي. بيليه الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق.
      6. نضح وطاف resuspend الخلايا في 1 مل PBS مع 10٪ FBS (حوالي 8 E13.5 كبد الجنينلكل مل).
    2. تنقية TER119 الأرومة الحمراء سلبي
      1. منع الخلايا مع مفتش الفئران (0.2 ملغ / مل) على الجليد لمدة 15 دقيقة.
      2. دون غسل أو الطرد المركزي، إضافة المعقدة البيروكسيديز المضادة للTER119 الأجسام المضادة لتعليق خلية (1 ميكروغرام / مل). احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
      3. يغسل في برنامج تلفزيوني 1X مع 10٪ FBS (1:10) وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 10٪ FBS.
      4. إضافة 75 ميكرولتر streptavidin مترافق مع الجزيئات المغناطيسية واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
      5. إضافة الحجم إلى 2.5 مل مع PBS تحتوي على 10٪ FBS. نقل تعليق الخلية إلى 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع.
      6. يتم ادخال الانبوب في جهاز الفرز المغناطيسي خلية واحتضان لمدة 10 دقيقة. خلايا إيجابية TER119 سوف نعلق على جانب الأنبوب. ستبقى الأرومة الحمراء السلبية TER119 غير مرتبط في التعليق.
      7. صب تعليق خلية في جديد 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع.
      8. كرر الخطوات من 3.2.6 و 3.2.7 لإزالة الخلايا إيجابية TER119 المتبقية.
      9. بيليه الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق. نضح قبالة طاف. resuspend الخلايا في 1 مل PBS تحتوي على 10٪ FBS والعد الخلايا الحية مع التريبان الأزرق.

    4. تنبيغ مع الفيروسات ترميز [كدنا] أو shRNA

    1. لوحة خلايا الكبد الجنين السلبية TER119 تنقيته في 3-5 × 10 5 / بئر في فبرونيكتين المغلفة لوحة 12 جيدا (ضبط عدد الخلايا في حالة استخدام لوحة مختلفة).
    2. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل لتسهيل تنبيغ الفيروسية. تدور تصيب الخلايا مع lentiviruses أو الفيروسات القهقرية، [كدنا] ترميز أو shRNA، في 800 x ج لمدة 1-1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.

    5. الثقافة في Transduced TER119 ماوس سلبي الجنين الكبد الأرومة الحمراء

    1. لاختبار وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر محطة (الشكل 1 الخطوط المتقطعة).">
      1. ثقافة الخلايا transduced في إبو المتوسطة مجانا (SCF المتوسطة) لمدة 12 ساعة للسماح للتعبير عن الجينات وصيانة الدولة السلف transduced.
      2. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف. resuspend الخلايا في 1 مل تحتوي على إبو المتوسطة في كل بئر من 12 لوحة جيدا.
      3. بعد ثقافة لمدة 24 أو 48 ساعة، حصاد الخلايا لمزيد من المقايسات.
    2. اختبار وظائف الجينات في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر محطة (الشكل 1 خطوط الصلبة).
      1. ثقافة الخلايا transduced فورا في إبو تحتوي على المتوسط.
      2. بعد ثقافة لمدة 24 أو 48 ساعة، حصاد الخلايا لفحوصات أخرى.

    6. تلون خلايا الكبد مثقف الجنين لتحليل تدفق Cytometric

    1. غسل وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. الحصاد 2 ​​× 10 5 الخلايا المستزرعة لتحليل تدفق cytometric.
    2. احتضانالخلايا مع الأجسام المضادة مترافق fluorophore لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لاختبار التمايز، استخدم APC مترافق مكافحة CD71 وPE مترافق مكافحة TER119. لاختبار استئصال، استخدم هويشت 33342 صمة عار بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأخرى.
    3. غسل الخلايا مع 1X PBS. resuspend الخلايا في 0.5 مل PBS تحتوي على 1٪ FBS ويوديد propidium (PI) (1 ميكروغرام / مل) وصمة عار على الخلايا الميتة واستبعادها من التحليل.
    4. تحليل سلوك تدفق cytrometric. تحليل اللون الملون وغير ملوثين خلايا تحكم واحد أولا لتعديل والتعويض من تدفق عداد الكريات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 الاستراتيجيات التجريبية. يتكون البروتوكول من شرطين مستقلة لاستهداف وظائف الجزيئات يشير في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. تم تنقيته TER119 السلبية الأرومة الحمراء الكبد الجنين من الماوس E13.5 الجنين. أظهر تحليل تدفق cytometric من خلايا الكبد محمر الجنين قبل وبعد التنقية أن تنقية كانت فعالة (أرقام 2A و 2B). للمرحلة الأولى من محطة الكريات الحمر (الشكل 1، الخطوط المتقطعة)، بعد تنبيغ الفيروسية، كانت الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​مجانا إبو (SCF المتوسطة) لمدة 12 ساعة. خلال هذه الفترة، وأظهرت الخلايا الحد الأدنى من التمايز (الشكل 2C) مع أي موت الخلايا المبرمج كبيرة لوحظت في الخلايا transduced (GFP إيجابي) (الشكل 3). بدأت خلايا التفريق بعد نقل إلى إبو التي تحتوي على المتوسطة (الشكل 4 قوية>)، والتي كانت مشابهة للخلايا المستزرعة في إبو تحتوي على المتوسط ​​مباشرة بعد التنبيغ (الشكل 1، وخطوط الصلبة والشكل 5). خلال ثقافة 2 يوم في إبو تحتوي المتوسطة في كلتا الطريقتين، فإن معظم الخلايا محمر السلف (منخفض CD71 TER119 الأقل) عرضت تحريض مستقبلات ترانسفيرين (CD71) وTER119 في يوم 2 (CD71 عالية TER119 الأعلى) (الشكل 4A الشكل و 5A). وقع قلع في يوم 2، كما لوحظ من قبل هويشت TER119 عالية عالية (الأرومة الحمراء) وهويشت منخفضة TER119 عالية (الشبكيات) (الشكل 4B و الشكل 5B). ومن الجدير بالذكر أن الخلايا فورا الثقافة في إبو (خط الصلبة) كانت أكثر كفاءة نسبيا عن التمايز واستئصال من الخلايا المستزرعة في أول SCF المتوسطة (خط متقطع).

جوري 1 "FO: محتوى العرض =" 5in "العرض =" 500 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg "/>
الرقم 1. محة تخطيطية استراتيجية التجريبية. متقطع وخطوط الصلبة تمثل أساليب لدراسة الجزيئات يشير في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر محطة، على التوالي.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل تدفق cytometric من خلايا الفأر الجنينية محمر الكبد قبل وبعد تنقية TER119 الأرومة الحمراء السلبية. (A) مجموع خلايا الكبد الجنين ملطخة TER119 وCD71. (B) تنقية TER119 خلايا السلبية ملطخة TER119 وCD71. (C) تنقية TER119 خلايا سلبية بعد 12 ساعة في الثقافة SCF المتوسطة. مناشداتالبريد انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. تحليل تدفق cytometric من الخلايا بعد في الثقافة المتوسطة مجانا إبو (SCF المتوسطة) لمدة 12 ساعة. تم transduced (AB) وTER119 الأرومة الحمراء السلبية مع lentiviruses السيطرة (A) أو lentiviruses ترميز البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) (B). تم عرض نسبة الخلايا transduced إيجابية GFP بعد 12 ساعة من الثقافة في SCF المتوسطة. (CD) تحليل موت الخلايا المبرمج في GFP سلبي (C) و (D) خلايا إيجابية من (B).

الرقم 4
الرقم 4. تحليل تدفق cytometric من التمايز وقلع للerythrobla transducedSTS المثقف في SCF المتوسطة تليها إبو المتوسطة. (A) كما في الشكل 3، وبوابات الخلايا GFP السلبية والإيجابية لتحليل التمايز باستخدام CD71 وTER119 بعد تم تغيير الخلايا لإبو المتوسطة ومثقف ل48 ساعة إضافية. (B) قلع الفحص باستخدام هويشت وTER119 من أشار الخلايا بعد 48 ساعة في إبو المتوسطة.

الرقم 5
الشكل 5. تحليل تدفق cytometric من التمايز واستئصال من الأرومة الحمراء transduced مثقف مباشرة في إبو المتوسطة. تم transduced (A) خلايا السلبية TER119 مع lentiviruses ترميز GFP. كان المثقف الخلايا مباشرة في إبو المتوسطة بعد ترنسدوكأيشن. تم إجراء تحليل تمايز الخلايا من الخلايا GFP السلبية والإيجابية باستخدام CD71 وTER119 بعد 48 ساعة في الثقافة. (B) قلع فحص للالخلايا المشار باستخدام هويشت وTER119 بعد 48 ساعة في الثقافة.

العنصر الكمية
IMDM 41.385 مل
مصل بقري جنيني (FBS، 15٪) 7.5 مل
ب المركابتويثانول (10 -4 M) 50 ميكرولتر (10 -1 M الأسهم في IMDM)
البنسلين، الستربتوميسين (1٪) 500 ميكرولتر
الجلوتامين (2 ملي) 500 ميكرولتر
وقف عامل خلية (50 نانوغرام / مل) 25 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل الأسهم
FLT3 يجند (FLT-3L) (30 نانوغرام / مل) 30 ميكرولتر من 50 نانوغرام / مل الأسهم
IL-6 (20 نانوغرام / مل) 10 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل الأسهم

الجدول 1. مكونات FOص SCF المتوسطة (EPO المتوسطة مجاني).

العنصر الكمية
IMDM 36.3 مل
FBS (15٪) 7.5 مل
الأبقار مصل الزلال (BSA، 10٪) 5 مل (10٪ الأسهم في IMDM)
الانسولين (10 ملغ / مل) 50 ميكرولتر من 4 ° C الأسهم
هولو-ترانسفيرين (200 ملغ / مل) 200 ميكرولتر (50 ملغ / مل في الماء، -20 ° C الأسهم)
ب المركابتويثانول (10 -4 M) 50 ميكرولتر (10 -1 M الأسهم في IMDM)
البنسلين، الستربتوميسين (1٪) 500 ميكرولتر
2 مم الجلوتامين 500 ميكرولتر
EPO (2 U / مل) 33 ميكرولتر (3،000 الأسهم U / مل)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم نظام فريد لتحليل زمنيا الماوس الجنين تكون الكريات الحمر محطة الكبد. من خلال تطبيق الشروط ثقافة مختلفة، ونحن تشريح بنجاح الكريات الحمر محطة في المراحل المبكرة والمتأخرة. هذا مهم بشكل خاص لتحديد آليات الجينات مع وظائف متعددة. على سبيل المثال، GTPases RAC تلعب أدوارا مهمة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. تثبيط راك GTPases في المرحلة الأولى من تمايز الخلايا الكريات الحمر التأثيرات الطرفية والانتشار. من ناحية أخرى، وتثبيط نشاط راك GTPases في مرحلة متأخرة من محطة كتل الكريات الحمر دون أن يؤثر استئصال تمايز الخلايا، والانتشار، أو البقاء على قيد الحياة 13.

يجب أن تبقى عدة خطوات هامة في هذا البروتوكول في الاعتبار. أولا، ويفضل E13.5 كبد الفأر الجنينية لتنقية TER119 خلايا السلبية. الأجنة القديمة يمكن استخدامها ولكن proportiعلى من الأسلاف من مجموع خلايا الكبد الجنين سوف تكون منخفضة. ثانيا، من المهم استخدام منخفضة الذيفان الداخلي BSA في إبو المتوسطة لأنها حاسمة لاستئصال، على الرغم من أن الآلية ليست واضحة. ثالثا، على الرغم من أن أفيد فبرونيكتين إلى أن تكون مهمة لتكون الكريات الحمر 15، وجدنا أن استخدام لوحة المغلفة فبرونيكتين كان اختياري. فإنه لا يؤثر على تكاثر الخلايا، التمايز، أو قلع في نظامنا. ومع ذلك، يمكن فبرونيكتين تكون مفيدة للخلايا لنعلق على اللوحة التي قد تكون مهمة لبعض التطبيقات مثل المناعية. رابعا، نسبة صغيرة من الخلايا الشبكية أو الأرومة الحمراء مرحلة متأخرة قد تفقد إشارة GFP التي أجريت مع الخلايا transduced. بدلا من ذلك نستخدم CD4 الإنسان كعلامة لتعقب الخلايا transduced. وأخيرا، أوصت التقارير السابقة إزالة إرثروبويتين من الثقافة في اليوم 1 11. لقد وجدنا أنه ليس من الضروري القيام بذلك منذ لم يكن هناك اختلاف كبير في خليةالتمايز، والانتشار، أو قلع مع أو بدون إزالة إرثروبويتين. على العكس من ذلك، تغيير المتوسطة قد يسبب فقدان الخلية.

باستخدام نفس الاستراتيجية، اكتشفنا مؤخرا أكثر من 30 الجينات التي تلعب وظائف جديدة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر محطة (تشاو وآخرون، نتائج غير منشورة). مثل راك GTPases، وكثير من هذه الجينات تلعب ظائف مزدوجة في كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. هذا يشير إلى أن مسارات إشارات في الكريات الحمر محطة مترابطة بشكل وثيق. الجينات المسؤولة عن الهيكل الخلوي الأكتين إعادة عرض والتكثيف النووي هي تلك التي تميل للعب وظائف مزدوجة بسبب الأدوار الحاسمة لهذه الكريات الحمر مسارات الإشارات في جميع أنحاء المحطة. من ناحية أخرى، الجينات المسؤولة عن مسارات مثل التوليف الهيم وتوليد محمر غشاء البلازما معين تميل إلى أن تكون أكثر مقيدة في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر محطة 16،17. على الرغم من ذرالبريد قيود معينة من هذه الاستراتيجية التجريبية، مثل كفاءة العدوى منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تنبيغ خطوط الخلايا، وصعوبة هدم البروتينات مع نصف العمر الطويل، ونحن نوصي ممارسة روتينية لاستخدام نظامنا نظرا لأهمية تشريح وظائف الجينات في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الاستراتيجية التجريبية أن تستخدم أيضا لتطبيقات أخرى. على سبيل المثال، باستخدام حالة SCF مستنبت، يمكن تحليل الجينات التي تشارك في الحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية مثل التجديد الذاتي أو التمايز. باستخدام طريقة لتحليل أواخر مرحلة الكريات الحمر، واحدة ويمكن أيضا تحديد وظيفة الجينات التي يمكن أن تشارك في الالتهام الذاتي لإزالة العضيات.

على نطاق واسع، فإن هذه الاستراتيجية التجريبية يمكن تطبيقها على التحقيق الوظيفي للأنظمة المكونة للدم أخرى مثل megakaryopoiesis وتكون النقويات. التطبيق الناجح لهذا لياليسوف trategy تكشف أيضا عن الجانب الخفي من الآليات الجزيئية للجينات معينة في مراحل النمو المختلفة من خلايا الدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00HL102154، والجمعية الأمريكية لأمراض الدم جائزة الباحث إلى P جي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100x
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
Fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
  2. Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
  3. Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
  4. Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
  5. Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
  6. Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
  7. Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
  8. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
  9. Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
  10. Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
  11. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  12. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  13. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
  14. Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
  15. Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
  16. Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
  17. Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).

Tags

علم المناعة، العدد 91، الكريات الحمر، زراعة الخلايا، أرومة الحمراء، والتمايز، إرثروبويتين والكبد الجنين، قلع
الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P.… More

Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter