Summary
Vi presenterar en in vitro musfosterlever erytroblast kultursystem som dissekerar de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. Detta system underlättar funktionsanalys av specifika gener i olika utvecklingsstadier.
Abstract
Erytropoes innebär en dynamisk process, som börjar med engagerade erytroid skurbildande enheter (BFU-Es) följt av snabbt delande erytroid kolonibildande enheter (CFU-Es). Efter CFU-Es, cellerna morfologiskt igenkännliga och allmänt benämns terminal erytroblaster. En av utmaningarna för att studera terminal erytropoes är bristen på experimentella metoder för att dissekera genfunktioner i kronologisk sätt. I detta protokoll, beskriver vi en unik strategi för att bestämma genen fungerar i de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. I detta system var musfosterlever TER119 (mogna erytroid cellmarkör) negativa erytroblaster renades och transducerades med exogen expression av cDNA-sekvenser eller små hårnåls RNA (shRNAs) för generna av intresse. Cellerna därefter odlas i medel innehåller andra än erytropoietin (Epo) att behålla sin stamfader scen för 12 timmar samtidigt som de exogena cDNA eller shRNAs faktorer tillväxtatt uttrycka. Cellerna ändrades till Epo mediet efter 12 h för att inducera celldifferentiering och proliferation medan de exogena genetiska material redan uttryckt. Detta protokoll underlättar analys av genfunktioner i ett tidigt skede av terminal erytropoes. För att studera sent skede terminal erytropoes cellerna omedelbart odlas i Epo mediet efter transduktion. På detta sätt cellerna redan differentierade för det sena stadiet av terminal erytropoes när de omvandlade genetiskt material uttrycktes. Vi rekommenderar en allmän tillämpning av denna strategi som skulle hjälpa att förstå detaljerade genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes.
Introduction
Erytropoes är processen för differentiering av multipotenta hematopoetiska stamceller till mogna erytrocyter. Denna stegvisa process omfattar bildandet av engagerade erytroid burst bildande enheter (BFU-Es), de snabbt delande erytroida kolonibildande enheter (CFU-Es) och morfologiskt igenkännliga erytroblaster 1,2. Terminal erytropoesen från CFU-E progenitorceller involverar sekventiell erytropoietin-beroende och oberoende steg 2,3. I det tidiga skedet av terminal erytropoes Erytropoietin (Epo) binder till dess receptor på cellytan och inducerar en serie nedströms signalvägar som förhindrar cell apoptos och befrämja snabb celldelning och genuttryck 1,4. I sent skede av terminal erytropoes erytroblaster genomgår terminal cellcykel exit, kromatin och nucleus kondens, och extrudering av de mycket kondenserade kärnor 5.
Vår förståelse av terminalerytropoes har förbättrats avsevärt under de senaste decennierna, vilket till stor del beror på den framgångsrika användningen av flera in vitro och in vivo musmodeller 6-9. Bland dessa modeller, in vitro-kultur av musfosterlever erytroblaster ger många fördelar inklusive enkel cellrening, snabb proliferation och differentiering, samt en närmare härma människors erytropoes 10,11. I detta system kan ett stort antal erytrocyternas stamceller från mus fetala levrar lätt isoleras genom den enda steg reningen av TER119 (en markör för de mogna erytroidceller) negativa erytroblaster. Under tvådagarskultur erytroblasterna, kan differentiering av dessa celler att övervakas av en flödescytometrisk analys baserad på ytan uttryck för transferrinreceptorn (CD71) och TER119 antigen 12. Dessutom kan enucleation av de terminalt differentierings erytroblaster detekteras genom en DNA kokare (Hoechst 33342) 13. Dessutom de renade stamceller kan genetiskt modifieras genom exogen expression av cDNA eller små hårnål RNA (shRNAs) för gener av intresse, vilket underlättar mekanistiska studier av funktioner genuttryck på erytropoies 11,13,14.
Å andra sidan, kan den snabba celltillväxthastigheten vara ett dubbeleggat svärd, eftersom det är svårt att karakterisera genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes. I de flesta fall är det svårt att avgöra om en specifik gen fungerar i det tidiga stadiet av terminal erytropoes sedan när cDNA eller shRNAs uttryckt, de celler som redan passerat tidigt stadium. För att lösa detta problem har vi utvecklat ett unikt system för att dissekera de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. För det tidiga stadiet av terminal erytropoes genmodifierade TER119 negativa erytroblaster odlades i Epo-fritt medium men innehållande stamcellsfaktor (SCF), IL-6 och FLT3ligand att behålla sin stamfader status och låta de omvandlade cDNA eller shRNA till uttryck 13. Cellerna byttes till Epo innehållande medium efter 12 h för att inducera cellproliferation och differentiering. På detta sätt, när cellerna började att differentiera, de transducerade cDNA-sekvensema eller shRNAs redan uttrycks. För sent skede av terminal erytropoes TER119 negativa erytroblaster odlades i Epo innehållande medium omedelbart efter transduktion. Därför kan man analysera funktionerna hos gener av intresse i det sena stadiet av terminal erytropoes. Sammanfattningsvis skulle en bred tillämpning av detta system hjälpa dissekera genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1 Beredning av odlingsmedium
- Förbered fibronektinlösningen. Tillsätt 1 ml vatten till en flaska med humant fibronektin (1 mg). Lämna lösningen i vävnadsodling huva i 30 minuter utan att röra. Överför den totala vätskan till 50 ml PBS för att göra en slutlig koncentration av 20 | ig / ml och försiktigt blanda väl. Gör fibronektinlösningen färska före beläggning plattan (se nedan).
- Förbered 50 ml Epo fritt medium (SCF medium). Kombinera de angivna ingredienserna i tabell 1. Kan Mediet lagras vid 4 ° C under en månad när gjort färskt.
- Bered 50 ml av EPO innehållande medium. Kombinera de angivna ingredienserna i tabell 2. Kan Mediet lagras vid 4 ° C under en månad när gjort färskt. 2. Fibronektin-belagda plattan
- Tillsätt 1 ml fibronektin-lösning till varje brunn i en 6-brunnsplatta (eller 0,5 ml till varje brunn i en 12 brunnars platta). Låt plattan i vävnadsodling huva i 1 timme.
- Skölj brunnar med sterilt vatten två gånger och lufttorka plattan.
- Linda plattan och spara i kylrummet vid 4 ° C.
- Framställning av Total fetala leverceller
- Offra mouse av CO 2 inandning och halsdislokation. Spray buken med 70% etanol för desinficering. Öppna buken med dissekera sax för att ta bort livmodern. Tvätta livmodern i 1x PBS.
- Dissekera fostren under sterila förhållanden med en vävnadsodling huva och autoklaveras verktyg och tvätta i 1x PBS.
- Dissekera fetala levrar från fostren. Håll kroppen av fostret med en pincett, försiktigt dra fetal lever (rosa färg) från kroppen med en annan pincett. Rengör fetal lever med pincett för att ta bort de tillhörande fibrotiska vävnader. Placera alla fetala levrar får frisk 1x PBS innehållande 10% fetalt bovint serum.
- Mekaniskt störa fetala levrar genom pipettering upp och ned.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 40 | im cellfilter in i ett 50 ml koniskt rör. Pellets cellerna vid 800 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml PBS med 10% FBS (cirka 8 E13.5 foster levrarper ml).
- Rening av TER119 Negativa erytroblaster
- Blockera cellerna med rått-IgG (0,2 mg / ml) på is under 15 min.
- Utan tvättning eller centrifugering, tillsätt biotinylerad anti-TER119 antikropp till cellsuspensionen (1 | ig / ml). Inkubera under 15 min på is.
- Tvätta i 1x PBS med 10% FBS (01:10) och centrifugera vid 800 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i 1 ml PBS med 10% FBS.
- Lägg 75 l streptavidin konjugerade med magnetiska partiklar och inkubera i 10 minuter på is.
- Lägg volymen till 2,5 ml med PBS innehållande 10% FBS. Överför cellsuspensionen i ett 5 ml polypropylen rundbottnad röret.
- Sätt röret i en magnetisk cellsorteringsanordning och inkubera under 10 min. TER119 positiva celler kommer att fästa till sidan av röret. De lös TER119 negativa erytroblaster kvar i suspension.
- Häll cellsuspensionen till ett nytt 5 ml polypropylen rundbottnad röret.
- Upprepa steg 3.2.6 och 3.2.7 för att avlägsna de återstående TER119 positiva celler.
- Pellets cellerna vid 800 xg under 5 min. Sug bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 ml PBS innehållande 10% FBS och räkna levande celler med trypanblått.
- Plate de renade TER119 negativa fetala leverceller vid 3-5 x 10 5 / brunn i en fibronektin belagd 12-brunnar (justera cellnummer om du använder en annan platta).
- Lägg polybren till en slutlig koncentration av 10 ug / ml för att underlätta viral transduktion. Spin infektera cellerna med lentivirus eller retrovirus, kodar cDNA eller shRNA, vid 800 xg under 1 till 1,5 h vid 37 ° C.
- För att testa genfunktioner i ett tidigt skede av terminal erytropoes (Figur 1 streckade linjer).">
Kultur de transducerade cellerna i Epo fritt medium (SCF-medium) för 12 timmar för att tillåta expressionen av de transducerade generna och underhåll av progenitor tillstånd. - Centrifugera cellerna vid 800 xg under 5 min. Aspirera supematanten. Resuspendera cellerna i 1 ml Epo innehållande medium i varje brunn i en 12-brunnars platta.
- Efter odling under 24 eller 48 h, skörda cellerna för ytterligare analyser.
- Test genfunktioner i det sena stadiet av terminal erytropoes (Figur 1 heldragna linjer).
- Kultur de transducerade cellerna omedelbart i Epo innehållande medium.
- Efter odling under 24 eller 48 h, skörda cellerna för ytterligare analyser.
- Tvätta och resuspendera cellerna i 1x PBS. Harvest 2 x 10 5 odlade celler för flödescytometrisk analys.
- Inkuberacellerna med fluoroforen-konjugerade antikroppar för 20 min vid rumstemperatur i mörker. För att testa differentiering, använd APC konjugerat anti-CD71 och PE konjugerat anti-TER119. För att testa enucleation, använd Hoechst 33342 fläck utöver de andra antikroppar.
- Tvätta cellerna med 1 x PBS. Resuspendera cellerna i 0,5 ml PBS innehållande 1% FBS och propidiumjodid (PI) (1 ug / ml) för att färga döda celler och utesluta dem från analysen.
- Conduct flödes cytrometric analys. Analysera enda färg färgade och ofärgade kontrollceller först för anpassning och kompensation för flödescytometern.
3 Rening av fetala lever erytroblaster
OBS: Använd fetala levrar från E13 till E15 tt dräktiga möss (C57BL / 6). E13.5 levrar är föredragna för att maximera utbytet av CFU-E-progenitorer. För att få de tidsinställda dräktiga möss, var 6 till 8 veckor gamla manliga och kvinnliga möss placerades i en bur (vanligtvis en hane med en eller två honor). Kvinnliga vaginala pluggar kontrollerades nästa morgon för att se om parningen lyckades. Den första dagen av dräktigheten var dagen efter kontakten hittades.
4. Transduktion med virus som kodar för cDNA eller shRNA
5. Kultur av den omvandlade TER119 Negativ musfosterlever erytroblaster
6. Färgning av odlade fetala leverceller för flödescytometrianalyser
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar vilka experimentella strategier. Protokollet består av två oberoende villkor för inriktning funktionerna hos de signalmolekyler i de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. TER119 negativa fetala lever erytroblaster renades från E13.5 mus foster. Flödescytometrisk analys av fetala lever erytroida celler före och efter reningen visade att reningen var effektiv (figurerna 2A och 2B). För det tidiga stadiet av terminal erytropoes (fig 1, streckade linjer), efter viral transduktion, odlades cellerna i Epo-fritt medium (SCF-medium) för 12 tim. Under denna period cellerna uppvisade minimal differentiering (figur 2C) utan signifikant apoptos observerats i de omvandlade cellerna (GFP positiva) (Figur 3). Cellerna började att differentiera efter överföring på Epo-innehållande medium (Figur 4 strong>), som liknade de celler odlade i Epo innehållande medium omedelbart efter transduktion (Figur 1, heldragna linjer och Figur 5). Under två dagars kultur i Epo innehållande medium i båda metoderna, uppvisade de flesta av de erytroida progenitorceller (CD71 låg TER119 låg) induktion av transferrinreceptorn (CD71) och TER119 på dag 2 (CD71 hög TER119 hög) (figur 4A och figur 5A). Enucleation inträffade på dag 2, som observerats av Hoechst hög TER119 hög (erytroblaster) och Hoechst låg TER119 hög (retikulocyter) (Figur 4B och figur 5B). Det är noterbart att celler omedelbart kultur i Epo (heldragen linje) var relativt effektivare för differentiering och enucleation än celler odlade först i SCF medium (streckad linje).
gur 1 "fo: content-width =" 5in "width =" 500 "src =" / filer / ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg "/>
Figur 1 Schematisk översikt av den experimentella strategin. Streckad och heldragna linjerna representerar metoder för att studera signalmolekyler i de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes, respektive.
Figur 2 Flödescytometrisk analys av mus fetala lever erytroidceller före och efter rening av TER119 negativa erytroblaster. (A) Totala fetala leverceller färgade med TER119 och CD71. (B) Renat TER119 negativa celler färgade med TER119 och CD71. (C) Renade TER119 negativa celler efter 12 h odling i SCF medium. Grundere Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flödescytometrisk analys av apoptos efter odling i Epo-fritt medium (SCF-medium) för 12 tim. (Ab) TER119 negativa erytroblaster transducerades med kontroll lentivirus (A) eller lentivirus som kodar grönt fluorescent protein (GFP) (B). Andelen GFP positiva omvandlade celler presenterades efter 12 timmar av kultur i SCF-medium. (CD) Analys av apoptos i GFP negativ (C) och positiva (D)-celler från (B).
Figur 4 Flödescytometrisk analys av differentiering och enucleation den omvandlade erythroblam odlas i SCF medium följt av Epo medium. (A) När det i fig 3, var GFP-negativa och positiva celler gated för differentieringsanalys med användning av CD71 och TER119 efter att cellerna har ändrats på Epo-medium och odlades under ytterligare 48 tim. (B) Enucleation analys med användning av Hoechst och TER119 av den angivna celler efter 48 timmar i Epo medium.
Figur 5 Flödescytometrisk analys av differentiering och enucleation av de omvandlade erytroblaster direkt odlade i Epo medium. (A) De TER119 negativa celler transducerades med lentivirus kodar GFP. Cellerna omedelbart odlas i Epo medium efter transduktion. Celldifferentiering analys av GFP negativa och positiva celler utfördes med hjälp av CD71 och TER119 efter 48 timmar i kultur. (B) Enucleation analys avde angivna cellerna med hjälp av Hoechst och TER119 efter 48 timmar i kultur.
| Ingrediens | Mängd |
| IMDM | 41,385 ml |
| Fetalt bovint serum (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 ^ (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-streptomycin (1%) | 500 | il |
| Glutamin (2 mM) | 500 | il |
| Stamcellsfaktor (50 ng / ml) | 25 | il från 100 ng / ml stam |
| FLT3 Ligand (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 | il från 50 ng / ml stam |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 | il från 100 ng / ml stam |
Tabell 1 Ingrediens for SCF medium (Epo fritt medium).
| Ingrediens | Mängd |
| IMDM | 36,3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA, 10%) | 5 ml (10% lager i IMDM) |
| Insulin (10 mg / ml) | 50 ^ från 4 ° C lager |
| Holo-transferrin (200 mg / ml) | 200 ^ (50 mg / ml i vatten, -20 ° C lager) |
| b-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 ^ (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-streptomycin (1%) | 500 | il |
| 2 mM glutamin | 500 | il |
| Epo (2 U / ml) | 33 pl (3,000 U / ml lager) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett unikt system för att kronologiskt analysera musfosterlever terminal erytropoes. Genom tillämpningen av olika odlingsbetingelser, framgångsrikt dissekerade vi terminal erytropoes i tidiga och sena stadier. Detta är särskilt viktigt för att bestämma mekanismerna i gener med flera funktioner. Exempelvis Rac GTPases spelar viktiga roller i olika stadier av terminal erytropoes. Hämning av Rac GTPases i det tidiga stadiet av terminal erytropoesstimulerande påverkar celldifferentiering och proliferation. Å andra sidan, hämning av aktiviteten av Rac GTPases i sent skede av terminal erytropoesstimulerande block enucleation utan att påverka celldifferentiering, proliferation eller överlevnad 13.
Flera viktiga steg i detta protokoll bör hållas i åtanke. Först är E13.5 mouse fetala levrar föredrages för rening av TER119 negativa celler. Äldre embryon kan användas, men det proportipå de stamfäder av de totala fetala leverceller kommer att vara låg. För det andra är det viktigt att använda låga endotoxin BSA i Epo-medium eftersom det är avgörande för enucleation, men verkningsmekanismen är inte klart. För det tredje, även om fibronektin rapporterades vara viktigt för erytropoes 15, fann vi att användningen av fibronektin-belagda plattan var valfri. Det påverkar inte celltillväxt, differentiering eller enucleation i vårt system. Däremot kan fibronektin vara användbart för cellerna att fästa till plattan som kan vara viktigt för vissa applikationer såsom immunfärgning. För det fjärde kan en liten andel av retikulocyter eller sen erytroblaster förlora GFP signal som genomfördes med de omvandlade cellerna. Alternativt använder vi humant CD4 som en markör för att spåra de transducerade cellerna. Slutligen tidigare rapporter rekommenderade borttagning av erytropoietin från kulturen på dag 1 11. Vi fann att det inte var nödvändigt att göra det eftersom det inte fanns någon signifikant skillnad på celldifferentiering, proliferation eller enucleation med eller utan avlägsnande av erytropoietin. Tvärtom kan byte av medium orsaka cellförlust.
Genom att använda samma strategi, upptäckte vi nyligen mer än 30 gener som spelar nya funktioner i olika stadier av terminal erytropoes (Zhao et al., Opublicerade resultat). Liksom Rac GTPases, många av dessa gener spelar dubbla funktioner i både tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. Detta tyder på att signalvägar i terminal erytropoes är nära sammankopplade. Gener som är involverade i aktin cytoskelettet ombyggnad och nukleära kondens är de som brukar spela dubbla funktioner på grund av de kritiska roller i dessa signalvägar i hela terminal erytropoes. Å andra sidan, gener involverade i vägar såsom hemsyntesen och generering av erytroid specifik plasmamembranet tenderar att vara mer begränsad i det tidiga skedet av terminal erytropoes 16,17. Även there finns vissa begränsningar i denna experimentella strategi, till exempel relativt låg infektionseffektivitet jämfört med transduktion av cellinjer, och svårigheten att knacka ner proteiner med lång halveringstid, rekommenderar vi en rutin praxis att använda vårt system med tanke på betydelsen av dissekera genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes. Dessutom kan detta experimentella strategin även användas för andra tillämpningar. Till exempel med hjälp av SCF medelkulturtillstånd, gener som är involverade i upprätthållandet av stamcellsegenskaper såsom självförnyelse eller differentiering kunde analyseras. Genom att använda förfarandet för analys av sent stadium erytropoes kunde en också bestämma funktionen hos gener som kan vara inblandade i autophagy för avlägsnande av organeller.
I stora drag kan denna experimentella strategi tillämpas på funktionell undersökning av andra hematopoietiska system såsom megakaryopoiesis och myelopoes. Framgångsrik tillämpning av denna sTRATEGI skulle också avslöja den dolda sidan av de molekylära mekanismerna hos specifika gener i olika utvecklingsstadier i blodceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH R00HL102154 och en American Society of Hematology lärd utmärkelse till P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
