Summary
Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.
Abstract
Eritropoiese envolve um processo dinâmico que começa com unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES) seguido de divisão rápida erythroid unidades formadoras de colônia (UFC-Es). Depois de CFU-Es, as células são morfologicamente reconhecíveis e geralmente denominado eritroblastos terminais. Um dos desafios para o estudo da eritropoiese terminal é a falta de abordagens experimentais para dissecar as funções dos genes de uma forma cronológica. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia única para determinar as funções dos genes nas fases precoces e tardias da eritropoiese terminal. Neste sistema, rato fetal Ter119 fígado (marcador de células eritróides maduras) eritroblastos negativos foram purificados e transduzidas com expressão exógena de cDNAs ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse. As células foram posteriormente cultivadas em outras que a eritropoietina (Epo) para manter a sua fase progenitoras, durante 12 horas, permitindo que os cDNAs exógenos ou shRNAs um meio contendo factores de crescimentopara expressar. As células foram mudadas para meio de EPO depois de 12 horas para induzir a diferenciação e proliferação celular, enquanto os materiais genéticos exógenos, já foram expressos. Este protocolo facilita a análise de funções de genes na fase inicial da eritropoiese terminal. Para estudar tarde fase terminal eritropoiese, as células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Desta forma, as células já foram diferenciadas para a fase tardia da eritropoiese terminal quando os materiais genéticos transduzidas foram expressos. Recomendamos a aplicação geral desta estratégia que ajudaria a entender as funções dos genes detalhadas em diferentes estágios de eritropoiese terminal.
Introduction
Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis 1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes 2,3-dependente e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de 1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas 5.
Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse 6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano 10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) 13. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese 11,13,14.
Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão 13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.
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Protocol
Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Northwestern Animal Care Institucional e Comitê de Uso.
1 Preparação de Meio de Cultura
- Preparar a solução de fibronectina. Adicionar 1 ml de água para um frasco de fibronectina humana (1 mg). Deixar solução em cultura da capa de tecido, durante 30 minutos, sem agitação. Transferir o líquido total a 50 ml de PBS para fazer uma concentração final de 20 ug / ml e suavemente misturar bem. Adicione a solução de fibronectina fresco antes do revestimento da chapa (ver abaixo).
- Prepare 50 ml de Epo meio livre (médio SCF). Combinar os ingredientes listados na Tabela 1. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita.
- Preparar 50 ml de Epo contendo meio. Combinar os ingredientes listados na Tabela 2. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita. 2. Fibronectina placa revestida
- Adicionar 1 ml de solução de fibronectina a cada poço de uma placa de 6 poços (ou 0,5 ml a cada poço de uma placa de 12 poços). Deixar a placa de cobertura na cultura de tecidos durante 1 h.
- Lavar os poços duas vezes com água estéril e secar a placa.
- Enrole a placa e guardar na câmara fria a 4 ° C.
- Preparação das células totais de fígado fetal
- Sacrifique o mouse por inalação de CO 2 e deslocamento cervical. Pulverizar o abdômen com álcool 70% para desinfecção. Abra o abdômen com dissecando tesoura para remover o útero. Lavar o útero em PBS 1x.
- Dissecar os fetos em condições estéreis, utilizando uma capa de cultura de tecidos e ferramentas autoclavados e lave em 1x PBS.
- Dissecar os fígados fetais dos fetos. Segure o corpo do feto com um fórceps, retire com cuidado o fígado fetal (na cor rosa) de distância do corpo com outro fórceps. Limpe o fígado fetal com a pinça para remover os tecidos fibróticos associados. Coloque todos os fígados fetais frescos em 1x PBS contendo 10% de soro fetal bovino.
- Mecanicamente perturbar fígados fetais pipetando para cima e para baixo.
- Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células 40 pm em um tubo de 50 ml. Agregar as células a 800 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS com FBS a 10% (cerca de 8 E13.5 fígados fetaispor ml).
- Purificação de Ter119 Erythroblasts negativos
- Bloquear as células com IgG de rato (0,2 mg / ml) em gelo durante 15 min.
- Sem lavagem ou centrifugação, adicionar anticorpo anti-Ter119 biotinilado para a suspensão de células (1 ug / ml). Incubar durante 15 min em gelo.
- Lavar com PBS 1x com 10% de FBS (1:10) e centrifugar a 800 xg durante 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de PBS com 10% de FBS.
- Adicionar 75 ul de estreptavidina conjugada com partículas magnéticas e incuba-se durante 10 minutos em gelo.
- Adicionar o volume para 2,5 ml com PBS contendo 10% de FBS. Transferência da suspensão de células em 5 ml de um tubo de polipropileno de fundo redondo.
- Inserir o tubo de um aparelho de triagem celular magnética e incubar durante 10 min. Células positivas Ter119 vai anexar ao lado do tubo. Os eritroblastos negativos Ter119 solta permanece na suspensão.
- Despeje a suspensão de células em 5 ml de um novo tubo de polipropileno redondo inferior.
- Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7 para remover as células positivas para Ter119 residual.
- Agregar as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 10% de FBS e contagem de células viáveis com azul de tripano.
- Placa as células fetais de fígado negativos Ter119 purificada a 3-5 x 10 5 / po de uma fibronectina revestido de 12 poços (ajustar o número de células se utilizando uma placa diferente).
- Adicionar polibreno a uma concentração final de 10 ug / ml para facilitar a transdução virai. Rotação infectar as células com lentivírus ou retrovírus, o ADNc que codifica ou shRNA, a 800 xg durante 1-1,5 h a 37 ° C.
- Para testar as funções dos genes na fase precoce da eritropoiese do terminal (Figura 1 as linhas a tracejado).">
Cultura das células transduzidas em meio isento de Epo (SCF) médio durante 12 horas para permitir a expressão dos genes e manutenção do estado de progenitor transduzidas. - Centrifuga-se as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de Epo contendo o meio em cada poço de uma placa de 12 poços.
- Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para outros ensaios.
- Teste as funções dos genes na fase final da eritropoiese de terminal (Figura 1 linhas sólidas).
- Cultura das células transduzidas imediatamente Epo contendo meio.
- Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para os outros ensaios.
- Lave e ressuspender as células em 1x PBS. Colheita de 2 x 10 5 células em cultura para análise por citometria de fluxo.
- Incubaras células com anticorpos fluoróforos, durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para testar a diferenciação, utilizar APC anti-CD71 conjugado e conjugado com PE anti-Ter119. Para testar a enucleação, utilizar Hoechst 33342 mancha para além dos outros anticorpos.
- Lavar as células com PBS 1x. Ressuspender as células em 0,5 ml de PBS contendo 1% de FBS e o iodeto de propídio (PI) (1 ug / ml) para corar as células mortas e as excluir análise.
- Fluxo de Conduta análise cytrometric. Analise as células de controle de cores coradas e não coradas primeiro single para o ajuste e compensação do citômetro de fluxo.
3 Purificação de fígado fetal Erythroblasts
NOTA: Use fígados fetais de E13 para E15 cronometrado camundongos grávidas (C57BL / 6). E13.5 fígados são preferidas para maximizar o rendimento de progenitores de CFU-E. Para obter as ratas grávidas cronometrados, 6-8 semanas de idade camundongos machos e fêmeas foram colocados em uma gaiola (geralmente um macho com uma ou duas mulheres). Tampões vaginais fêmeas foram verificadas na manhã seguinte para determinar se o acasalamento com sucesso. O primeiro dia de gestação foi no dia seguinte a ficha foi encontrada.
4. Transdução com vírus Encoding cDNA ou shRNA
5. Cultura das transduzidas Ter119 Negative mouse fígado fetal Erythroblasts
6 A coloração das células cultivadas de fígado fetal para Análise Citometria de Fluxo
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Representative Results
A Figura 1 descreve as estratégias experimentais. O protocolo consiste em duas condições independentes para alvejar as funções das moléculas sinalizadoras nas fases precoce e tardia da eritropoiese terminal. Ter119 eritroblastos de fígado fetal negativos foram purificados a partir do rato E13.5 feto. A análise por citometria de fluxo de células eritróides fetais de fígado antes e após purificação demonstrado que a purificação foi eficiente (Figuras 2A e 2B). Para a fase inicial de eritropoiese de terminal (Figura 1, as linhas tracejadas), após a transdução virai, as células foram cultivadas em meio livre de Epo (SCF meio) durante 12 horas. Durante este período, as células mostraram diferenciação minimal (Figura 2C) com nenhuma apoptose significativa observada nas células transduzidas (GFP positivo) (Figura 3). As células se diferenciaram após a transferência para meio contendo EPO (Figura 4 forte>), o que foi semelhante para as células cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução (Figura 1, as linhas sólidas e Figura 5). Durante a cultura de 2 dias em meio contendo EPO em ambos os métodos, a maior parte das células progenitoras eritróides (CD71 baixo Ter119 baixo) exibiram uma indução do receptor de transferrina (CD71) e Ter119 no dia 2 (CD71 alta Ter119 alto) (Figura 4A e figura 5A). Enucleação ocorreu no dia 2, como observado pela Hoechst alta Ter119 elevadas (eritroblastos) e Hoechst baixo Ter119 elevadas (reticulócitos) (Figura 4B e Figura 5B). É notável que as células de cultura imediatamente em Epo (linha sólida) foi relativamente mais eficiente para a diferenciação e enucleação de células cultivadas em meio de SCF primeiro (linha tracejada).
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Figura 1: Sinopse da estratégia experimental. Tracejado e linhas contínuas representam métodos para estudar moléculas sinalizadoras nos estágios precoces e tardias da eritropoiese terminal, respectivamente.
Figura 2 a análise de citometria de fluxo de rato células eritróides fetais de fígado antes e após a purificação de Ter119 eritroblastos negativos. (A) Total de células do fígado fetal corados com Ter119 e CD71. Células negativas (B) purificada Ter119 corados com Ter119 e CD71. (C) purificados Ter119 células negativas após 12 horas de cultura em meio SCF. Fundamentose clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 Fluxo de análise por citometria de apoptose após cultura em meio Epo-free (meio SCF) para 12 horas. (AB) Os Ter119 eritroblastos negativos foram transduzidas com lentivírus de controlo (A) ou de lentivírus que codificam a proteína fluorescente verde (GFP) (B). A percentagem de células positivas para GFP transduzidas foi apresentado após 12 horas de cultura em meio de SCF. (CD) Análise de apoptose em GFP negativo (C) e (D), as células positivas a partir de (B).
Figura 4 Fluxo de análise por citometria de diferenciação e enucleação do erythrobla transduzidassts cultivados em meio SCF seguido por meio de Epo. (D) Tal como na Figura 3, as células negativas e positivas para GFP foram fechado para a análise e diferenciação utilizando CD71 Ter119 depois as células foram mudadas para meio de Epo e cultivadas por mais 48 horas adicionais. (B) Ensaio de enucleação com Hoechst e Ter119 do indicado células após 48 horas em meio de EPO.
Figura 5 Fluxo de análise por citometria de diferenciação e enucleação dos eritroblastos transduzidas diretamente em meio de cultura Epo. (A) o Ter119 células negativas foram transduzidas com lentivírus que codificam GFP. As células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Análise de diferenciação celular de células negativas e positivas para GFP foi realizada utilizando CD71 e Ter119 após 48 h em cultura. (B) A enucleação de ensaioas células indicadas com Hoechst e Ter119 após 48 horas em cultura.
| Ingrediente | Quantidade |
| MDMI | 41,385 ml |
| De soro fetal bovino (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-mercaptoetanol (10 -4 M) | 50 ul (10 -1 M estoque em IMDM) |
| Penicilina-Estreptomicina (1%) | 500 ul |
| Glutamina (2 mM) | 500 ul |
| Factor de células estaminais (50 ng / ml) | 25 l de 100 ações ng / ml |
| Ligando FLT3 (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 mL de 50 estoque ng / ml |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 ml de 100 ações ng / ml |
Tabela 1 Ingrediente fomédio r SCF (Epo meio livre).
| Ingrediente | Quantidade |
| MDMI | 36,3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Albumina de soro bovino (BSA, 10%) | 5 ml (10% de ações em IMDM) |
| Insulina (10 mg / ml) | 50 ul de 4 ° C estoque |
| Holo-transferrina (200 mg / ml) | 200 ul (50 mg / ml em água, -20 ° C estoque) |
| b-mercaptoetanol (10 -4 M) | 50 ul (10 -1 M estoque em IMDM) |
| Penicilina-Estreptomicina (1%) | 500 ul |
| Glutamina 2 mM | 500 ul |
| EPO (2 U / ml) | 33 mL (3,000 L estoque / ml) |
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Discussion
Aqui apresentamos um sistema único para analisar cronologicamente rato fetal eritropoiese terminal de fígado. Através da aplicação de diferentes condições de cultivo, dissecamos sucesso eritropoiese terminais em fases precoces e tardias. Isto é particularmente importante para determinar os mecanismos de genes com funções múltiplas. Por exemplo, GTPases Rac desempenham papéis importantes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Inibição de Rac GTPases na fase inicial de diferenciação e proliferação celular influências eritropoiese terminais. Por outro lado, a inibição da actividade de Rac GTPases na fase tardia do terminal de blocos da eritropoiese enucleação sem afectar a diferenciação celular, proliferação, sobrevivência ou 13.
Vários passos importantes neste protocolo deve ser mantido em mente. Em primeiro lugar, os fígados de rato E13.5 fetais são preferidas para a purificação de células Ter119 negativos. Embriões mais velhos podem ser usados, mas o proportisobre os progenitores para fora do total de células de fígado fetal será baixo. Em segundo lugar, é importante o uso de baixa endotoxina BSA em meio EPO, uma vez que é crítico para a enucleação, embora o mecanismo não é claro. Em terceiro lugar, embora a fibronectina foi relatada como sendo importante para a eritropoiese 15, verificou-se que o uso de fibronectina placa revestida foi opcional. Ele não afecta a proliferação celular, diferenciação, ou enucleação no nosso sistema. No entanto, a fibronectina pode ser útil para as células se fixem a placa que pode ser importante para certas aplicações, tais como imunomarcação. Em quarto lugar, uma pequena percentagem de reticulócitos ou eritroblastos fase tardia pode perder o sinal GFP que foi realizado com as células transduzidas. Alternativamente podemos usar CD4 humana como um marcador para acompanhar as células transduzidas. Por fim, os relatórios anteriores recomenda remoção de eritropoietina da cultura no dia 1 11. Descobrimos que não era necessário fazê-lo já que não houve diferença significativa no celulara diferenciação, a proliferação, ou a enucleação com ou sem remoção de eritropoietina. Pelo contrário, as alterações de forma podem causar perda de células.
Usando a mesma estratégia, que recentemente descobriu mais de 30 genes que desempenham novas funções em diferentes estágios de eritropoiese terminais (Zhao et al., Resultados não publicados). Como Rac GTPases, muitos destes genes desempenham uma função dupla em ambas as fases precoce e tardia da eritropoiese terminal. Isso indica que as vias de sinalização em eritropoiese terminais estão intimamente interligados. Os genes envolvidos na remodelação citoesqueleto de actina e a condensação nuclear estão aqueles que tendem a desempenhar uma dupla função, devido aos papéis críticos destas vias de sinalização ao longo da eritropoiese terminal. Por outro lado, os genes envolvidos em vias, tais como a síntese de heme e geração de membrana do plasma específico eritróide tendem a ser mais restrita na fase precoce da eritropoiese terminais 16,17. Embora there certas limitações desta estratégia experimental, como relativamente baixa eficiência de infecção em comparação com a transdução de linhas celulares, e dificuldade de derrubar proteínas com meia-vida longa, recomenda-se uma prática rotineira para usar nosso sistema, dada a importância de dissecar as funções dos genes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Além disso, esta estratégia experimental também pode ser utilizado para outras aplicações. Por exemplo, usando a condição de SCF meio de cultura, os genes que estão envolvidos na manutenção de propriedades de células estaminais, tais como a auto-renovação ou de diferenciação pode ser analisado. Utilizando o método de análise de fase tardia a eritropoiese, pode-se também determinar a função de genes que poderiam estar envolvidos na autofagia para a remoção de organelos.
Em termos gerais, esta estratégia experimental pode ser aplicada ao estudo funcional de outros sistemas hematopoiéticos, tais como megacariopoiese e mielopoese. A aplicação bem sucedida desta sESTRATÉGIA também revelam o lado oculto dos mecanismos moleculares de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento de células do sangue.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo NIH R00HL102154, e um da American Society of Hematology prêmio estudioso a P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
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