Summary
Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l'analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.
Abstract
Eritropoiesi comporta un processo dinamico che inizia con unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), seguita da rapida divisione eritroide unità formanti colonia (CFU-E). Dopo CFU-Es, le cellule sono morfologicamente riconoscibili e generalmente chiamato eritroblasti terminali. Una delle sfide per lo studio dell'eritropoiesi terminale è la mancanza di approcci sperimentali per analizzare le funzioni del gene in modo cronologico. In questo protocollo, si descrive una strategia unica per determinare le funzioni del gene nelle prime e ultime fasi dell'eritropoiesi terminale. In questo sistema, il mouse TER119 fegato fetale (marker delle cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi sono stati purificati e trasdotto con espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse. Le cellule sono state poi coltivate in terreno contenente fattori di crescita diversi eritropoietina (Epo) per mantenere la loro fase progenitore per 12 ore, consentendo cDNA esogeni o shRNAsdi esprimere. Le cellule sono state modificate per Epo media dopo 12 ore di indurre il differenziamento e la proliferazione cellulare, mentre il materiale genetico esogeno erano già espressi. Questo protocollo facilita l'analisi delle funzioni dei geni nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale. Per studiare terminale eritropoiesi fase tardiva, le cellule sono state coltivate in Epo immediatamente medio dopo trasduzione. In questo modo, le cellule sono state già differenziate per la fase tardiva dell'eritropoiesi terminale quando sono stati espressi i materiali genetici trasdotte. Si consiglia una applicazione generale di questa strategia che potrebbe aiutare a capire le funzioni del gene dettagliate in diverse fasi della eritropoiesi terminale.
Introduction
L'eritropoiesi è il processo di differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche multipotenti a maturare eritrociti. Questo processo graduale prevede la formazione di unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), le unità formanti colonia in rapida divisione eritroidi (CFU-Es), e morfologicamente riconoscibili eritroblasti 1,2. Eritropoiesi Terminal da cellule progenitrici CFU-E coinvolge sequenziale eritropoietina-dipendente e fasi indipendenti 2,3. Nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale, eritropoietina (Epo) si lega al suo recettore sulla superficie cellulare e induce una serie di vie di segnalazione a valle che impediscono l'apoptosi delle cellule e promuovono divisioni cellulari rapidi e l'espressione genica 1,4. Nella fase tardiva dell'eritropoiesi terminale, eritroblasti subiscono uscita cellula terminale del ciclo, cromatina e di nuclei di condensazione, e l'estrusione dei nuclei altamente condensati 5.
La nostra comprensione di terminaleeritropoiesi ha notevolmente migliorato negli ultimi decenni, che è in gran parte dovuto il successo nell'uso di diversi in vitro e in modelli in vivo di topo 6-9. Tra questi modelli, la coltura in vitro di topo fetale eritroblasti fegato fornisce molti vantaggi tra cui la facilità di purificazione delle cellule, la proliferazione e la differenziazione veloce, e una mimica più vicino a eritropoiesi umana 10,11. In questo sistema, un gran numero di cellule progenitrici eritroidi da topo fegati fetali possono essere facilmente isolate dalla purificazione singolo passo di TER119 (un marcatore per le cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi. Durante la cultura di due giorni degli eritroblasti, la differenziazione di queste cellule può essere monitorato da un citometria a flusso basato sulla superficie espressione del recettore della transferrina (CD71) e la TER119 dell'antigene 12. Inoltre, l'enucleazione dei eritroblasti differenziazione terminale può essere rilevata da un produttore di DNA (Hoechst 33342) 13. Inoltre, i progenitori purificati possono essere geneticamente modificati espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse, che facilita gli studi meccanicistici delle funzioni di espressione genica su eritropoiesi 11,13,14.
D'altra parte, il tasso di crescita delle cellule veloce può essere una lama a doppio taglio poiché è difficile caratterizzare funzioni geniche nelle diverse fasi di eritropoiesi terminale. Nella maggior parte dei casi, è difficile stabilire se una specifica funzioni del gene nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale fin dal momento in cui il cDNA o shRNAs espresso, le cellule già superato la fase iniziale. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un sistema unico di sezionare prime e ultime fasi dell'eritropoiesi terminale. Per la fase iniziale di eritropoiesi terminale, geneticamente modificati TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno Epo-libero ma contenente fattore delle cellule staminali (SCF), IL-6 e FLT3ligando di mantenere il loro status progenitore e consentire i cDNA trasdotte o shRNA all'espressione 13. Le cellule sono state modificate per Epo contenente medio dopo 12 ore per indurre la proliferazione e differenziazione cellulare. In questo modo, quando le cellule hanno cominciato a differenziarsi, i cDNA trasdotte o shRNAs erano già espressi. Per la fase tardiva dell'eritropoiesi terminale, TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno contenente Epo subito dopo la trasduzione. Pertanto, si può analizzare le funzioni dei geni di interesse nella fase tardiva della eritropoiesi terminale. In sintesi, una vasta applicazione di questo sistema aiuterebbe funzioni geniche sezionare in diverse fasi della eritropoiesi terminale.
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Protocol
Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee.
1 Preparazione del terreno di coltura
- Preparare la soluzione fibronectina. Aggiungere 1 ml di acqua per una fiala di fibronectina umana (1 mg). Lasciare soluzione nel cappuccio coltura tissutale per 30 minuti senza agitazione. Trasferire il liquido totale di 50 ml di PBS per fare una concentrazione finale di 20 mg / ml e mescolare delicatamente bene. Rendere la soluzione fibronectina fresco prima del rivestimento della piastra (vedi sotto).
- Preparare 50 ml di mezzo privo di Epo (SCF medio). Unire gli ingredienti elencati nella Tabella 1. Il terreno può essere conservato a 4 ° C per 1 mese se fatta fresca.
- Preparare 50 ml di terreno contenente Epo. Unire gli ingredienti elencati nella Tabella 2. Il terreno può essere conservato a 4 ° C per 1 mese se fatta fresca. 2 fibronectina piastra ricoperta
- Aggiungere 1 ml di soluzione fibronectina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti (o 0,5 ml a ciascun pozzetto di una piastra ben 12). Lasciare la piastra nella cappa coltura tissutale per 1 ora.
- Sciacquare pozzi con acqua sterile per due volte e asciugare la piastra.
- Avvolgere la piastra e salvare in cella a 4 ° C.
- Preparazione delle cellule totali fetale epatiche
- Sacrifica il mouse da CO 2 inalazione e dislocazione cervicale. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per la disinfezione. Aprire l'addome con dissezione forbici per rimuovere l'utero. Lavare l'utero in 1x PBS.
- Sezionare i feti in condizioni sterili utilizzando una cappa coltura tissutale e strumenti in autoclave e lavare in PBS 1x.
- Sezionare i fegati fetali da feti. Tenere il corpo del feto con una pinza, tirare delicatamente il fegato fetale (di colore rosa) lontano dal corpo con un altro pinze. Pulire il fegato fetale con le pinze per rimuovere i tessuti fibrotici associati. Mettere tutti i fegati fetali in fresco 1x PBS contenente siero fetale bovino al 10%.
- Meccanicamente interrompere fegati fetali pipettando su e giù.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron in una provetta da 50 ml. Agglomerare le cellule a 800 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di PBS con 10% FBS (circa 8 E13.5 fegati fetaliper ml).
- Purificazione di TER119 eritroblasti negativi
- Bloccare le cellule con IgG di ratto (0,2 mg / ml) in ghiaccio per 15 min.
- Senza lavaggio o centrifugazione, aggiungere anticorpo anti-TER119 biotinilato alla sospensione cellulare (1 mg / ml). Incubare per 15 min in ghiaccio.
- Lavare in 1x PBS con 10% FBS (1,10) e centrifugare a 800 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS con 10% FBS.
- Aggiungere 75 microlitri streptavidina coniugata con particelle magnetiche e incubare per 10 minuti in ghiaccio.
- Aggiungere il volume a 2,5 ml con PBS contenente 10% FBS. Trasferire la sospensione cellulare in un 5 ml in polipropilene tondo tubo inferiore.
- Inserire il tubo in un apparato cellulare smistamento magnetico e incubare per 10 min. Cellule positive TER119 potranno allegare al lato del tubo. Gli eritroblasti negativi TER119 distaccato rimarranno in sospensione.
- Versare la sospensione cellulare in un nuovo 5 ml in polipropilene tondo tubo inferiore.
- Ripetere i punti 3.2.6 e 3.2.7 per rimuovere le cellule positive TER119 residuo.
- Agglomerare le cellule a 800 xg per 5 min. Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS contenente 10% FBS e contare le cellule vive con Trypan Blue.
- Piastra le cellule del fegato fetali negativi TER119 purificata a 3-5 x 10 5 / bene in un fibronectina rivestito 12-pozzetti (regolare il numero di cellulare se si utilizza un piatto diverso).
- Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 10 mg / ml per facilitare trasduzione virale. Spin infettare le cellule con lentivirus o retrovirus, cDNA codifica o shRNA, a 800 xg per 1-1,5 ore a 37 ° C.
- Per provare le funzioni del gene nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale (Figura 1 linee tratteggiate).">
Coltivare le cellule trasdotte in Epo mezzo privo (SCF media) per 12 ore per consentire l'espressione dei geni e la manutenzione dello stato progenitore trasdotte. - Centrifugare le cellule a 800 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di Epo contenenti mezzo in ogni pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
- Dopo cultura per 24 o 48 ore, raccogliere le cellule per ulteriori analisi.
- Funzioni del gene Test nella fase tardiva dell'eritropoiesi terminale (Figura 1 linee continue).
- Coltivare le cellule trasdotte immediatamente in terreno contenente Epo.
- Dopo cultura per 24 o 48 ore, raccogliere le cellule per ulteriori analisi.
- Lavare e risospendere le cellule in PBS 1x. Harvest 2 x 10 5 cellule in coltura per l'analisi di citometria di flusso.
- Covarele cellule con anticorpi coniugati fluoroforo per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Per testare la differenziazione, utilizzare APC coniugato anti-CD71 e PE coniugato anti-TER119. Per testare enucleazione, utilizzare Hoechst 33342 macchia in aggiunta agli altri anticorpi.
- Lavare le cellule con PBS 1x. Risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS contenente 1% FBS e ioduro di propidio (PI) (1 mg / ml) per colorare le cellule morte ed escluderli dall'analisi.
- Comportamento analisi dei flussi cytrometric. Analizzare colore macchiato e non colorati cellule di controllo singole primo per la regolazione e la compensazione del citometro a flusso.
3. Purificazione di fegato fetali eritroblasti
NOTA: Utilizzare i fegati fetali da E13 a E15 cronometrati topi in gravidanza (C57BL / 6). Fegati E13.5 sono preferiti per massimizzare il rendimento di CFU-E progenitori. Per ottenere i topi in gravidanza cronometrati, da 6 a 8 settimane di età maschi e femmine di topo sono stati collocati in una gabbia (di solito un maschio con una o due femmine). Tappi vaginali femminili sono state controllate la mattina seguente per determinare se l'accoppiamento ha avuto successo. Il primo giorno di gestazione è stato il giorno dopo che è stata trovata la spina.
4. trasduzione con virus codifica cDNA o shRNA
5. Cultura dei trasdotte TER119 mouse Negativo fetali Fegato eritroblasti
6. colorazione delle cellule in coltura fetale fegato per analisi citofluorimetrica
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Representative Results
La figura 1 illustra le strategie sperimentali. Il protocollo consiste di due condizioni indipendenti per il targeting le funzioni delle molecole di segnalazione nelle prime e ultime fasi della eritropoiesi terminale. TER119 eritroblasti fegato fetale negativi sono stati purificati da topo E13.5 feto. Analisi citofluorimetrica delle cellule eritroidi fegato fetale prima e dopo la purificazione dimostrato che la purificazione era efficiente (Figure 2A e 2B). Per la fase iniziale di eritropoiesi terminale (figura 1, linea tratteggiata), dopo trasduzione virale, le cellule sono state coltivate in terreno Epo-libera (SCF media) per 12 ore. Durante questo periodo, le cellule mostravano minima differenziazione (Figura 2C) senza apoptosi significativa osservata nelle cellule trasdotte (GFP positivo) (Figura 3). Le cellule hanno cominciato a differenziarsi dopo il trasferimento di Epo contenenti medio (Figura 4 strong>), che era simile alle cellule coltivate in terreno contenente Epo subito dopo trasduzione (Figura 1, linee continue e Figura 5). Durante la due giorni di cultura Epo contenente medio in entrambi i metodi, la maggior parte delle cellule progenitrici eritroidi (CD71 basso TER119 basso) esposto l'induzione del recettore della transferrina (CD71) e TER119 il giorno 2 (CD71 alto TER119 alto) (Figura 4A e Figura 5A). Enucleazione avvenuto il giorno 2, come osservato da Hoechst alta TER119 elevati (eritroblasti) e Hoechst basso TER119 elevate (reticolociti) (Figura 4B e Figura 5B). È da notare che le cellule immediatamente coltura in Epo (linea continua) era relativamente più efficiente per la differenziazione e l'enucleazione di cellule coltivate primo a SCF medio (linea tratteggiata).
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Figura 1 Schema della strategia sperimentale. Tratteggiate e linee continue rappresentano i metodi per studiare molecole di segnalazione nelle prime e ultime fasi della eritropoiesi terminale, rispettivamente.
Figura 2 analisi citofluorimetrica di topo cellule eritroidi fegato fetale prima e dopo la purificazione di TER119 eritroblasti negativi. (A) Totale cellule epatiche fetali colorate con TER119 e CD71. (B) purificata TER119 cellule negative colorate con TER119 e CD71. (C) purificata TER119 cellule negative dopo la cultura 12 ore in SCF medio. Motivie clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi citofluorimetrica dell'apoptosi dopo coltura in terreno Epo-free (SCF media) per 12 ore. (AB) Le TER119 eritroblasti negativi sono stati trasdotte con lentivirus di controllo (A) o lentivirus che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) (B). La percentuale delle cellule trasdotte positive GFP è stato presentato dopo 12 ore di coltura in SCF media. (CD) Analisi dell'apoptosi in GFP negativo (C) e (D) cellule positive da (B).
Figura 4. analisi citofluorimetrica di differenziazione e di enucleazione del erythrobla trasdotteSts coltivate in SCF medio seguito da Epo media. (A) come in figura 3, cellule negative e positive GFP sono stati gating per l'analisi mediante differenziazione CD71 e TER119 dopo che le cellule sono state modificate per Epo medio e coltivate per ulteriori 48 ore. (B) dosaggio enucleazione utilizzando Hoechst e TER119 della indicata cellule dopo 48 ore in media Epo.
Figura 5 analisi citofluorimetrica di differenziazione e di enucleazione dei eritroblasti trasdotte direttamente coltivate in mezzo di Epo. (A) Le cellule negative TER119 sono state trasdotte con lentivirus codificanti GFP. Le cellule sono state coltivate in Epo immediatamente medio dopo trasduzione. Cella analisi differenziazione delle cellule negativi e positivi GFP è stata effettuata utilizzando CD71 e TER119 dopo 48 ore di coltura. (B) enucleazione dosaggio dile celle indicate con Hoechst e TER119 dopo 48 ore di coltura.
| Ingrediente | Quantità |
| IMDM | 41,385 ml |
| Siero fetale bovino (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-mercaptoetanolo (10 -4 M) | 50 ml (10 -1 m stock in IMDM) |
| Penicillina-streptomicina (1%) | 500 microlitri |
| Glutammina (2 mM) | 500 microlitri |
| Stem Cell Factor (50 ng / ml) | 25 microlitri di 100 ng magazzino / ml |
| FLT3 Ligand (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 ml da 50 ng magazzino / ml |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 microlitri di 100 ng magazzino / ml |
Tabella 1 Ingrediente for SCF medio (Epo medio gratuito).
| Ingrediente | Quantità |
| IMDM | 36.3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Albumina di siero bovino (BSA, 10%) | 5 ml (10% stock in IMDM) |
| Insulina (10 mg / ml) | 50 ml da 4 ° C magazzino |
| Holo-transferrina (200 mg / ml) | 200 ml (50 mg / ml in acqua, -20 ° C magazzino) |
| b-mercaptoetanolo (10 -4 M) | 50 ml (10 -1 m stock in IMDM) |
| Penicillina-streptomicina (1%) | 500 microlitri |
| 2 mM glutammina | 500 microlitri |
| EPO (2 U / ml) | 33 microlitri (3.000 U / ml magazzino) |
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Discussion
Qui vi presentiamo un sistema unico per analizzare cronologicamente topo fetale eritropoiesi terminale del fegato. Attraverso l'applicazione di diverse condizioni di coltura, abbiamo sezionato con successo l'eritropoiesi terminale in fase precoce e tardiva. Ciò è particolarmente importante per determinare i meccanismi di geni con funzioni multiple. Ad esempio, GTPasi Rac svolgono un ruolo importante in diverse fasi della eritropoiesi terminale. Inibizione della Rac GTPasi nella fase iniziale della differenziazione e proliferazione influenze eritropoiesi terminali delle cellule. D'altra parte, l'inibizione dell'attività di Rac GTPasi nella fase tardiva della terminale blocchi enucleazione eritropoiesi senza alterare la differenziazione cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza o 13.
Diversi passi importanti in questo protocollo dovrebbero essere tenuti a mente. Innanzitutto, E13.5 topo fegati fetali sono preferiti per la purificazione di TER119 cellule negative. Embrioni più vecchi possono essere utilizzati, ma la proportisu dei progenitori calcolata sul totale delle cellule del fegato fetale sarà basso. In secondo luogo, è importante utilizzare partire BSA endotossine nel Epo medio poiché è critico per l'enucleazione, anche se il meccanismo non è chiaro. In terzo luogo, anche se la fibronectina è stato segnalato per essere importante per l'eritropoiesi 15, abbiamo scoperto che l'uso di placca rivestita fibronectina era facoltativo. Essa non pregiudica la proliferazione cellulare, differenziamento, o enucleazione nel nostro sistema. Tuttavia, fibronectina può essere utile per le cellule di allegare alla piastra che potrebbe essere importante per alcune applicazioni come immunocolorazione. In quarto luogo, una piccola percentuale di reticolociti o eritroblasti fase avanzata può perdere il segnale GFP che è stata effettuata con le cellule trasdotte. In alternativa usiamo CD4 umano come un marcatore per monitorare le cellule trasdotte. Infine, i rapporti precedenti raccomandato la rimozione di eritropoietina dalla cultura al giorno 1 11. Abbiamo scoperto che non era necessario farlo in quanto non vi era alcuna differenza significativa sul cellularedifferenziazione, proliferazione, o enucleazione con o senza rimozione di eritropoietina. Al contrario, il cambiamento del terreno può causare la perdita di cellule.
Utilizzando la stessa strategia, abbiamo recentemente scoperto più di 30 geni che svolgono funzioni innovative in diverse fasi di eritropoiesi terminale (Zhao et al., Risultati non pubblicati). Come Rac GTPasi, molti di questi geni svolgono una doppia funzione in entrambe le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Ciò indica che le vie di segnalazione in eritropoiesi terminale sono strettamente interconnessi. I geni coinvolti nel citoscheletro di actina rimodellamento e la condensazione nucleare sono quelli che tendono a svolgere una duplice funzione a causa dei ruoli critici di queste vie di segnalazione in tutta l'eritropoiesi terminale. D'altra parte, i geni coinvolti nelle vie quali la sintesi dell'eme e generazione di membrana plasmatica specifico eritroide tendono ad essere più limitato nella fase iniziale del terminale eritropoiesi 16,17. Anche se there sono alcune limitazioni di questa strategia sperimentale, come la relativamente bassa efficienza di infezione rispetto alla trasduzione di linee cellulari, e la difficoltà di abbattere le proteine con lunga emivita, si consiglia una pratica di routine per utilizzare il nostro sistema data l'importanza della dissezione funzioni geniche nelle diverse fasi di eritropoiesi terminale. Inoltre, questa strategia sperimentale può essere usato anche per altre applicazioni. Ad esempio, utilizzando la condizione SCF terreno di coltura, i geni che sono coinvolti nel mantenimento delle proprietà delle cellule staminali come il self-renewal o differenziazione potrebbero essere analizzati. Utilizzando il metodo di analisi fase eritropoiesi in ritardo, si potrebbe anche determinare la funzione dei geni che potrebbero essere coinvolti in autofagia per la rimozione di organelli.
In generale, questa strategia sperimentale può essere applicata alle indagini funzionali di altri sistemi ematopoietici quali Megacariopoiesi e mielopoiesi. Applicazione di successo di questa sSTRATEGIA potrebbe anche rivelare il lato nascosto dei meccanismi molecolari di geni specifici nelle diverse fasi di sviluppo di cellule del sangue.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da NIH R00HL102154, e un American Society of Hematology premio studioso P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
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