Summary
Vi præsenterer et in vitro-mus fosterlever erythroblast kultur, der dissekerer de tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese. Dette system letter funktionel analyse af specifikke gener i forskellige udviklingsstadier.
Abstract
Erythropoiesen indebærer en dynamisk proces, der begynder med engagerede erythroid bristdannende enheder (BFU-Es) efterfulgt af hurtigt delende erythroide kolonidannende enheder (CFU-Es). Efter CFU-Es, celler er morfologisk genkendelige og betegnes generelt terminale erythroblaster. En af udfordringerne for studiet af terminalen erythropoiese er manglen på eksperimentelle metoder til at dissekere genfunktioner i kronologisk måde. I denne protokol, beskriver vi en unik strategi for at bestemme genfunktioner i de tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese. I dette system blev mus føtal lever TER119 (moden erythroidcelle markør) negative Erytroblaster oprenset og transduceret med eksogene ekspression af cDNA'er eller små hairpin RNA'er (shRNAs) for generne af interesse. Cellerne blev efterfølgende dyrket i medium indeholdende andre end erythropoietin (Epo) for at opretholde deres stamfader fase i 12 timer samtidig med at de eksogene cDNA'er eller shRNAs vækstfaktorerat udtrykke. Cellerne blev ændret til Epo mediet efter 12 timer for at inducere celledifferentiering og proliferation, mens de eksogene genetiske materiale allerede blev udtrykt. Denne protokol letter analyse af gen-funktioner i den tidlige fase af terminal erythropoiese. At studere sent stadium terminal erythropoiese blev cellerne straks dyrket i Epo mediet efter transduktion. På denne måde blev de celler, der allerede differentierede til den sene fase af terminal erythropoiese når de transducerede genetiske materiale blev udtrykt. Vi anbefaler en generel anvendelse af denne strategi, der ville hjælpe med at forstå detaljerede gen funktioner i forskellige stadier af terminal erythropoiese.
Introduction
Erythropoiese er processen differentiering af multipotente hæmatopoietiske stamceller til modne erythrocytter. Denne trinvise proces omfatter dannelsen af engagerede erythroide bristdannende enheder (BFU-E), de hurtigt delende erythroide kolonidannende enheder (CFU-E), og morfofonologiske genkendelige erythroblaster 1,2. Terminal erytropoiese fra CFU-E stamceller indebærer sekventiel erythropoietin-afhængige og uafhængige trin 2,3. I den tidlige fase af terminal erythropoiese erythropoietin (EPO) bindes til sin receptor på celleoverfladen og fremkalder en række downstream signalveje, der forhindrer celle apoptose og fremme hurtige celledelinger og genekspression 1,4. I den sene fase af terminal erythropoiese erytroblaster undergår terminal cellecyklus exit, kromatin og kerne kondens, og ekstrudering af de stærkt kondenseret kerner 5.
Vores forståelse af terminalerythropoiesen har i høj grad forbedret i de seneste årtier, hvilket i høj grad skyldes den vellykkede brug af flere in vitro og in vivo musemodeller 6-9. Blandt disse modeller in vitro-dyrkning af muse føtal lever Erytroblaster giver mange fordele, herunder den lethed celle oprensning, hurtig proliferation og differentiering, og tættere efterligner den menneskelige erythropoiese 10,11. I dette system kan et stort antal af erythroide stamceller fra mus føtale levere let isoleres ved enkelt trin oprensning af TER119 (en markør for de modne erythroide celler) negative erythroblaster. I løbet af to-dages kultur erythroblaster kan differentieringen af disse celler blive overvåget af en flowcytometrisk analyse baseret på overflade ekspression af transferrin-receptoren (CD71) og TER119 antigenet 12. Desuden kan enucleation af terminalt differentiering erytroblaster påvises ved en DNA-maker (Hoechst 33342) 13. Endvidere de oprensede stamceller kan genetisk modificeret ved exogen ekspression af cDNA'er eller små hårnål RNA'er (shRNAs) for generne af interesse, hvilket letter mekanistiske studier af funktionerne af genekspression på erythropoiese 11,13,14.
På den anden side kan den hurtige celle vækst være et tveægget sværd, eftersom det er vanskeligt at karakterisere genfunktioner i forskellige stadier af terminal erythropoiese. I de fleste tilfælde er det vanskeligt at afgøre, om et specifikt gen fungerer i den tidlige fase af terminal erythropoiese siden på det tidspunkt, cDNA'erne eller shRNAs udtrykte cellerne allerede passeret den tidlige fase. For at løse dette problem, har vi udviklet et unikt system til at dissekere de tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese. For den tidlige fase af terminal erythropoiese genmodificerede TER119 negative erythroblaster blev dyrket i Epo-frit medium, men som indeholder stamceller (SCF), IL-6 og FLT3ligand til at opretholde deres stamfader status og tillade de transducerede cDNA'er eller shRNA ekspression 13. Cellerne blev ændret til Epo medium efter 12 timer for at inducere celleproliferation og differentiering. På denne måde, når cellerne begyndte at skelne de transducerede cDNA'er eller shRNAs allerede udtrykkes. For sent stadium terminal erythropoiese TER119 negative erythroblaster blev dyrket i Epo holdigt medium umiddelbart efter transduktion. Derfor kan man analysere de funktioner af generne af interesse i den sene fase af terminal erythropoiese. Sammenfattende vil en bred anvendelse af dette system hjælpe dissekere genfunktioner i forskellige stadier af terminal erythropoiese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De i denne protokol beskrevne eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat ved Northwestern University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Fremstilling af Kultur Medium
- Forbered fibronektin løsning. Der tilsættes 1 ml vand til et hætteglas af humant fibronectin (1 mg). Lad opløsningen i vævskultur hætte i 30 minutter uden omrøring. Overfør den samlede væske til 50 ml PBS for at gøre en endelig koncentration på 20 ug / ml og forsigtigt bland godt. Gør fibronektin løsning frisk før overtrække pladen (se nedenfor).
- Forbered 50 ml Epo frit medium (SCF-medium). Kombiner de anførte ingredienser i tabel 1. Kan Mediet opbevares ved 4 ° C i 1 måned, når de gøres frisk.
- Forbered 50 ml Epo holdigt medium. Kombiner de anførte ingredienser i tabel 2. Kan Mediet opbevares ved 4 ° C i 1 måned, når de gøres frisk. 2. Fibronectin overtrukne plade
- Tilsæt 1 ml fibronectin opløsning til hver brønd i en 6-brønds plade (eller 0,5 ml til hver brønd af en 12 brønds plade). Lad pladen i vævskultur hætte i 1 time.
- Brøndene skylles med sterilt vand to gange og lufttørre pladen.
- Pak pladen og gemme i det kolde rum ved 4 ° C.
- Udarbejdelsen af det samlede fosterleverceller
- Sacrifice MOUse af CO 2 indånding og cervikal dislokation. Spray maven med 70% ethanol til desinfektion. Åbn maven med dissekere saks for at fjerne livmoderen. Vask livmoderen i 1x PBS.
- Dissekere fostre under sterile betingelser ved anvendelse af en vævskultur hætte og autoklaveres redskaber og vask i 1x PBS.
- Dissekere føtale levere fra fostre. Hold kroppen af fosteret med en pincet, træk forsigtigt føtal lever (lyserød farve) væk fra kroppen med en anden pincet. Rengør føtal lever med pincet for at fjerne de tilknyttede fibrose væv. Anbring alle føtale lever i frisk 1x PBS indeholdende 10% føtalt bovint serum.
- Mekanisk forstyrre føtale lever ved pipettering op og ned.
- Filtreres cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter i et 50 ml konisk rør. Pelletere cellerne ved 800 xg i 5 minutter.
- Aspirere supernatanten og udeluk cellerne i 1 ml PBS med 10% FBS (ca. 8 E13,5 føtale levereper ml).
- Oprensning af TER119 Negative erythroblaster
- Bloker cellerne med rotte-IgG (0,2 mg / ml) på is i 15 min.
- Uden vask eller centrifugering tilsættes biotinyleret anti-TER119 antistof til cellesuspensionen (1 ug / ml). Inkuber i 15 min på is.
- Vask i 1x PBS med 10% FBS (1:10) og centrifugeres ved 800 xg i 5 minutter. Resuspender cellerne i 1 ml PBS med 10% FBS.
- Tilføj 75 pi streptavidin konjugeret med magnetiske partikler og inkuberes i 10 minutter på is.
- Tilsæt volumen til 2,5 ml med PBS indeholdende 10% FBS. Overfør cellesuspensionen i et 5 ml polypropylen rundbundet rør.
- Sæt røret i et magnetisk apparat celle-sortering og inkuberes i 10 min. TER119 positive celler vil vedhæfte til den side af røret. De løstliggende TER119 negative erythroblaster vil forblive i suspension.
- Hæld cellesuspensionen i en ny 5 ml polypropylen rundbundet rør.
- Gentag trin 3.2.6 og 3.2.7 til at fjerne de resterende TER119 positive celler.
- Pelletere cellerne ved 800 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml PBS indeholdende 10% FBS og tælle levende celler med trypanblåt.
- Plate de oprensede TER119 negative fosterleverceller på 3-5 x 10 5 / brønd i en fibronectin overtrukket plade med 12 brønde (justere celleantal hvis hjælp af en anden plade).
- Tilføj polybren til en endelig koncentration på 10 ug / ml for at lette viral transduktion. Spin inficere cellerne med lentivirus eller retrovirus, der koder cDNA eller shRNA ved 800 xg i 1-1,5 timer ved 37 ° C.
- For at teste genfunktioner i den tidlige fase af terminal af røde blodlegemer (figur 1 stiplede linjer).">
Kultur de transducerede celler i Epo frit medium (SCF medium) i 12 timer for at tillade ekspression af transducerede gener og vedligeholdelse af stamfader tilstand. - Centrifugeres cellerne ved 800 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml Epo indeholdende medium i hver brønd i en 12-brønds plade.
- Efter dyrkning i 24 eller 48 timer, høstes cellerne til yderligere analyser.
- Test genfunktioner i den sene fase af terminal af røde blodlegemer (figur 1 optrukne linier).
- Kultur de transducerede celler straks i Epo holdigt medium.
- Efter dyrkning i 24 eller 48 timer, høstes cellerne til yderligere analyser.
- Vask og udeluk cellerne i 1x PBS. Høst 2 x 10 5 dyrkede celler til flowcytometrisk analyse.
- Inkubercellerne med fluoroforen-konjugerede antistoffer i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke. For at teste differentiering bruge APC-konjugeret anti-CD71 og PE-konjugeret anti-TER119. For at teste enucleation bruge Hoechst 33342 plet i tillæg til de andre antistoffer.
- Vask cellerne med 1x PBS. Resuspender cellerne i 0,5 ml PBS indeholdende 1% FBS og propidiumiodid (PI) (1 ug / ml) at farve døde celler og udelukke dem fra analysen.
- Conduct flow cytrometric analyse. Analyser ensfarvede farves og ufarvede kontrol celler først til justering og erstatning af flowcytometeret.
3. Oprensning af fosterlever erythroblaster
BEMÆRK: Brug føtale levere fra E13 til E15 timet gravide mus (C57BL / 6). E13,5 lever foretrækkes for at maksimere udbyttet af CFU-E stamceller. For at opnå de tidsindstillede gravide mus var 6 til 8 uger gamle mandlige og kvindelige mus anbragt i et bur (som regel en mand med en eller to hunner). Kvindelige vaginale propper blev kontrolleret næste morgen for at afgøre, om parring var vellykket. Den første dag i drægtighedsperioden var dagen efter stikket blev fundet.
4. Transduktion med virus cDNA eller shRNA
5. Kultur af de transducerede TER119 Negativ Mus fosterlever erythroblaster
6. Farvning af de dyrkede fosterleverceller for flowcytometrianalyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skitserer de eksperimentelle strategier. Protokollen består af to uafhængige betingelser for at målrette de funktioner, som signalmolekyler i de tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese. TER119 negative fosterleverceller Erytroblaster blev oprenset fra E13.5 mus fosteret. Flowcytometrisk analyse af føtale lever erythroide celler før og efter oprensning viste, at rensningen var effektiv (figur 2A og 2B). På det tidlige stadium af terminale erythropoiese (figur 1, stiplede linjer), efter viral transduktion dyrkedes cellerne i Epo-frit medium (SCF-medium) i 12 timer. I denne periode viste cellerne minimal differentiering (figur 2C) med ingen signifikant apoptose observeres i de transducerede celler (GFP-positive) (figur 3). Cellerne begyndte at differentiere efter overførsel til Epo-holdigt medium (figur 4 strong>), der var i lighed med celler dyrket i Epo indeholdende medium umiddelbart efter transduktion (figur 1, fuldt optrukne linier og figur 5). Under 2 dages kultur i Epo holdigt medium i begge metoder, de fleste af de erythroide progenitorceller (CD71 lav TER119 lav) udviste induktion af transferrin-receptoren (CD71) og TER119 på dag 2 (CD71 høj TER119 høj) (figur 4A og figur 5A). Enucleation skete på dag 2, som observeret af Hoechst høj TER119 høj (erytroblaster) og Hoechst lav TER119 høj (reticulocytter) (figur 4B og 5B). Det er bemærkelsesværdigt at celler straks kultur i Epo (fuldt optrukket linie) var relativt mere effektiv til at differentiere og enucleation end celler dyrket først i SCF-medium (stiplet linie).
gur 1 "FO: indhold-width =" 5in "width =" 500 "src =" / filer / ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Skematisk oversigt over den eksperimentelle strategi. Stiplet og fuldt optrukne linier repræsenterer metoder til at studere signalmolekyler i de tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese hhv.
Figur 2. Flow-cytometrisk analyse af muse-føtal lever erythroide celler før og efter oprensning af TER119 negative erythroblaster. (A) Total fosterleverceller farvet med TER119 og CD71. (B) Renset TER119 negative celler farvet med TER119 og CD71. (C) Renset TER119 negative celler efter 12 timers kultur i SCF medium. Anbringendere Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flow cytometrisk analyse af apoptose efter dyrkning i Epo-frit medium (SCF-medium) i 12 timer. (Ab) TER119 negative Erytroblaster blev transduceret med kontrol lentivirus (A) eller lentivirus koder grønt fluorescerende protein (GFP) (B). Den procentdel af GFP-positive transducerede celler blev præsenteret efter 12 timer af kulturen i SCF-medium. (CD) Analyse af apoptose i GFP negativ (C) og positive (D) celler fra (B).
Figur 4. Flowcytometrisk analyse af differentiering og enucleation af transducerede erythroblam dyrket i SCF medium efterfulgt af Epo medium. (A) i figur 3, blev GFP negative og positive celler gated for differentiering analyse under anvendelse af CD71 og TER119 efter at cellerne blev ændret til Epo-medium og dyrket i yderligere 48 timer. (B) Enucleation assay under anvendelse af Hoechst og TER119 af den angivne celler efter 48 timer i Epo medium.
Figur 5. Flow-cytometrisk analyse af differentiering og enucleation af de transducerede erythroblaster direkte dyrket i Epo-medium. (A) TER119 negative celler blev transduceret med lentivira koder for GFP. Cellerne blev straks dyrket i Epo mediet efter transduktion. Celledifferentiering analyse af GFP-negative og-positive celler blev udført under anvendelse af CD71 og TER119 efter 48 timer i kultur. (B) Enucleation assayde angivne celler ved hjælp Hoechst og TER119 efter 48 timer i kultur.
| Ingrediens | Mængde |
| IMDM | 41,385 ml |
| Føtalt bovint serum (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-mercaptoethanol (10 -4 M) | 50 pi (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-streptomycin (1%) | 500 pi |
| Glutamin (2 mM) | 500 pi |
| Stem Cell Factor (50 ng / ml) | 25 pi fra 100 ng / ml lager |
| FLT3 ligand (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 pi fra 50 ng / ml stamopløsning |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 pi fra 100 ng / ml stamopløsning |
Tabel 1. Ingrediens FOr SCF medium (Epo frit medium).
| Ingrediens | Mængde |
| IMDM | 36.3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA, 10%) | 5 ml (10% aktier i IMDM) |
| Insulin (10 mg / ml) | 50 pi fra 4 ° C lager |
| Holo-transferrin (200 mg / ml) | 200 pi (50 mg / ml i vand, -20 ° C lager) |
| b-mercaptoethanol (10 -4 M) | 50 pi (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-streptomycin (1%) | 500 pi |
| 2 mM glutamin | 500 pi |
| EPO (2 U / ml) | 33 pi (3000 U / ml lager) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi et unikt system til kronologisk analysere mus fosterlever terminal erythropoiese. Gennem anvendelse af forskellige dyrkningsbetingelser, vi med succes dissekeret terminal erytropoiese i tidlige og sene stadier. Dette er især vigtigt for at bestemme de mekanismer af gener med flere funktioner. For eksempel Rac GTPaser spille vigtige roller i forskellige stadier af terminal erythropoiese. Hæmning af Rac GTPaser i den tidlige fase af terminale erytropoiese påvirkninger celledifferentiering og proliferation. På den anden side, inhibering af aktiviteten af Rac GTPaser i den sene fase af terminal erythropoiese blokke enucleation uden at påvirke celle differentiering, proliferation eller overlevelse 13.
Adskillige vigtige skridt i denne protokol bør holdes for øje. Først E13.5 mus føtale levere foretrækkes til oprensning af TER119 negative celler. Ældre embryoer kan anvendes, men proportipå af progenitorer ud af de samlede fosterleverceller vil være lav. For det andet er det vigtigt at anvende lavt endotoksin BSA i Epo mediet, da det er kritisk for enucleation, selvom mekanismen ikke er klar. For det tredje, selv om fibronektin blev rapporteret at være vigtigt for erythropoiesis 15, fandt vi, at anvendelsen af fibronectin overtrukket plade var valgfri. Det påvirker ikke celleproliferation, differentiering eller enucleation i vores system. Dog kan fibronectin være nyttige for cellerne at fastgøre til pladen, der kan være vigtige for visse anvendelser, såsom immunfarvning. For det fjerde kan en lille procentdel af reticulocytter eller sent stadie erytroblaster miste GFP signal, der blev gennemført med de transducerede celler. Alternativt kan vi bruge humant CD4 som en markør til at spore de transducerede celler. Endelig tidligere rapporter anbefales fjernelse af erythropoietin fra kulturen på dag 1 11. Vi fandt, at det ikke var nødvendigt at gøre dette, da der ikke var nogen signifikant forskel på celledifferentiering, proliferation eller enucleation med eller uden fjernelse af erythropoietin. Tværtimod kan ændre mediet forårsage celle tab.
Ved hjælp af samme strategi, for nylig opdagede vi mere end 30 gener, der spiller nye funktioner i forskellige stadier af terminal erythropoiese (Zhao et al., Upublicerede resultater). Ligesom Rac GTPaser mange af disse gener spiller dobbeltfunktioner i både tidlige og sene stadier af terminal erythropoiese. Dette indikerer, at signalveje i klemme erythropoiese er tæt forbundne. Gener involveret i actincytoskelettet remodellering og nuklear kondens er dem, der har tendens til at spille to funktioner på grund af de kritiske roller i disse signalveje hele terminalen erythropoiese. På den anden side, gener involveret i veje såsom hæm syntese og generering af erythroide specifik plasmamembranen tendens til at være mere begrænset i den tidlige fase af terminal erythropoiese 16,17. Selvom there er visse begrænsninger i denne eksperimentelle strategi, såsom relativt lav infektion virkningsgrad sammenlignet med transduktion af cellelinier, og vanskeligheden ved at vælte proteiner med lang halveringstid, anbefaler vi en rutinemæssig praksis at anvende vores system i betragtning af betydningen af at dissekere genfunktioner i forskellige stadier af terminal erythropoiese. Derudover kan også anvendes denne eksperimentelle strategi til andre anvendelser. For eksempel ved hjælp af SCF medie kultur betingelse, gener, der er involveret i vedligeholdelse af stamceller egenskaber, såsom selv-fornyelse eller differentiering kunne analyseres. Ved anvendelse af fremgangsmåden til analyse sent erythropoiese kunne man også bestemme funktionen af gener, der kan være involveret i autofagi til fjernelse af organeller.
I store træk kan anvendes denne eksperimentelle strategi til den funktionelle undersøgelse af andre hæmatopoietiske systemer såsom megakaryopoiesen og myelopoiese. Vellykket anvendelse af denne sTRATEGI vil også afsløre skjulte side af de molekylære mekanismer i specifikke gener i forskellige udviklingsstadier i blodceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH R00HL102154, og en American Society of Hematology lærd tildeling til P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
