Summary
प्रस्तुत murine पृष्ठीय skinfold कक्ष की खिड़की एक musculocutaneous फ्लैप की तीव्र लगातार ischemia के एक क्षेत्र visualizes. Microvasculature और hemodynamics की मात्रा का ठहराव के प्रत्यक्ष और दोहराव आकलन के लिए intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परमिट. शब्द के भागों और hemodynamic परिणाम आगे ऊतकीय और आणविक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है.
Abstract
गहन विशेषज्ञता और उन्नत सर्जिकल तकनीकों के बावजूद, व्यापक ऊतक परिगलन को घाव टूटने से लेकर ischemia प्रेरित जटिलताओं अभी भी विशेष रूप से पुनर्निर्माण फ्लैप सर्जरी में, होने वाली हैं. एकाधिक प्रयोगात्मक फ्लैप मॉडल मूल कारणों और तंत्र का विश्लेषण करने के लिए और इस्कीमिक जटिलताओं को रोकने के लिए उपचार रणनीतियों की जांच करने के लिए विकसित किया गया है. अधिकांश मॉडल के सीमित कारक सीधे और repetitively microvascular वास्तुकला और hemodynamics कल्पना करने कमी संभावना है. प्रोटोकॉल के लक्ष्य के इन पहले उल्लेख कमी तत्वों सम्बद्ध एक सुस्थापित माउस मॉडल पेश करने के लिए था. कठिन एट अल. अनुपचारित रखा अगर 10 दिनों के बाद 50% गल जाना ~ में तीव्र लगातार ischemia और परिणाम आए है कि एक यादृच्छिक छिड़काव पैटर्न के साथ एक musculocutaneous फ्लैप का एक मॉडल विकसित किया है. Intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की सहायता के साथ, इस चैम्बर मॉडल का दोहराव दृश्य की अनुमति देताआकृति विज्ञान और समय के साथ ब्याज के विभिन्न क्षेत्रों में hemodynamics. ऐसे एपोप्टोसिस, सूजन, microvascular रिसाव और angiogenesis के रूप में जुड़े प्रक्रियाओं की जांच की और immunohistochemical और आणविक प्रोटीन assays के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. तिथि करने के लिए, मॉडल ischemically चुनौती दी ऊतक के पूर्व, पेरी के प्रभाव और postconditioning की जांच कई प्रकाशित प्रयोगात्मक अध्ययन में व्यवहार्यता और reproducibility साबित कर दी है.
Introduction
पुनर्निर्माण सर्जरी में उजागर कण्डरा, हड्डी और प्रत्यारोपण सामग्री की कवरेज फ्लैप के उपयोग पर निर्भर करता है. एक फ्लैप धमनी प्रवाह और शिरापरक बहिर्वाह की गारंटी देता है कि अपने संवहनी डंडी पर स्थानांतरित किया है कि ऊतक का एक ब्लॉक है. व्यापक विशेषज्ञता और स्थानांतरित करने के लिए फ्लैप की एक किस्म की उपलब्धता के बावजूद, कुल ऊतकों को नुकसान के लिए घाव टूटने से लेकर ischemia प्रेरित जटिलताओं अभी भी सामना कर रहे हैं. माध्यमिक इरादे से रूढ़िवादी उपचार और चिकित्सा नाबालिग ऊतक परिगलन के बाद उम्मीद की जा सकती है, जबकि महत्वपूर्ण फ्लैप परिगलन आमतौर पर क्षतशोधन, घाव कंडीशनिंग और माध्यमिक पुनर्निर्माण सहित शल्य संशोधन की आवश्यकता है. यह रुग्णता बढ़ जाती अस्पताल में रहने prolongs और फलस्वरूप वृद्धि की स्वास्थ्य देखभाल की लागत की ओर जाता है.
धमनी आमद से सबसे दूरस्थ बाहर का क्षेत्र में एक vasculature की अपरिभाषित पैटर्न या बेतरतीब ढंग से perfused क्षेत्रों के साथ फ्लैप इस्कीमिक क्षति के लिए विशेष रूप से ग्रस्त हैं. लेखा rdingly, कई प्रयोगात्मक और नैदानिक अध्ययन दोनों में नेक्रोसिस के विकास का मूल्यांकन किया है, अक्षीय पैटर्न फ्लैप (परिभाषित रक्त की आपूर्ति) और यादृच्छिक पैटर्न फ्लैप (अपरिभाषित रक्त की आपूर्ति) 1-3. मुख्य निष्कर्ष सामान्यतः परिगलित क्षेत्र के आकार के macroscopic मूल्यांकन के आधार पर कर रहे हैं. कारणों और ऊतक परिगलन के तंत्र का आकलन करने के क्रम में और अधिक विस्तार में, कई अध्ययनों microcirculation के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया. विभिन्न तकनीकों polarographic इलेक्ट्रोड 4-5 का उपयोग ऊतक ऑक्सीजन तनाव का विश्लेषण, साथ ही लेजर डॉपलर Flowmetry 6-7, डाई प्रसार 8, और microspheres के 9-10 का उपयोग रक्त प्रवाह की माप सहित, ऊतक छिड़काव को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों में, तथापि, केवल ऊतक छिड़काव की अप्रत्यक्ष मापदंडों को मापने के लिए अनुमति देते हैं और एक फ्लैप के हित के एक व्यक्ति के क्षेत्र के भीतर microhemodynamic प्रक्रियाओं के किसी भी रूपात्मक विश्लेषण सक्षम नहीं है.
टी "> संडिसन वह खरगोश 11 में प्रदर्शन किया जो vivo अध्ययन में लंबे समय तक के लिए एक पारदर्शी चैम्बर इस्तेमाल किया गया है जो पहले हो जाता है 1943 में -. लगभग 20 साल बाद - Algire लागू होने के लिए इस तरह के एक पारदर्शी चैम्बर अनुकूलित करने के लिए पहली बार था ट्यूमर कोशिकाओं 12 की सूक्ष्म प्रत्यारोपण के व्यवहार का अध्ययन करने के क्रम में चूहों में. कारण चूहों ढीली त्वचा जानवरों तथाकथित कर रहे हैं और बाद के वर्षों में कुछ तकनीकी शोधन के बाद, लेहर और सह कार्यकर्ताओं ऐसे अनुकूलित करने में सक्षम थे कि इस तथ्य को एक छोटे और लाइटर टाइटेनियम कक्ष विकासशील एक पृष्ठीय skinfold चैम्बर. यह चैम्बर intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, एक शब्द के भागों और microcirculatory सुविधाओं की संख्या और विभिन्न शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत समय के साथ अपने में परिवर्तन का सीधा और दोहराव दृश्य की अनुमति देता है कि एक तकनीक है, इस तरह का प्रयोग कर मूल्यांकन सक्षम ischemia-reperfusion की चोट के रूप में 13.पीई की जांच मेंसामान्य और रोग की स्थिति के तहत त्वचा, मांसपेशियों और हड्डियों फ्लैप के rfusion दो प्रवृत्तियों हुई: पहला, ऐसे माउस 14 में pedicled कान फ्लैप के रूप में पृष्ठीय skinfold कक्ष का उपयोग नहीं करते कि "गंभीर" फ्लैप मॉडल, पार्श्व आधारित द्वीप त्वचा फ्लैप हैम्स्टर 15 और चूहे 16 में pedicled समग्र फ्लैप में. दूसरा, एक पृष्ठीय skinfold कक्ष परमिट दोहराव microcirculatory साथ एक फ्लैप के संयोजन intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कई दिनों से अधिक का विश्लेषण करती है, जहां "पुरानी" फ्लैप मॉडल. यह माउस 17 की skinfold कक्ष में एकीकृत है कि एक बेतरतीब ढंग से perfused musculocutaneous फ्लैप के होते हैं. इसकी चौड़ाई से लंबाई अनुपात तीव्र लगातार ischemia के एक स्थिति लगातार 10 से 14 दिनों के फ्लैप पदोन्नति के बाद 50% फ्लैप ऊतक परिगलन ~ में यह परिणाम है कि चुना गया था. ऊतक परिगलन की यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हद, सुरक्षात्मक (यानी, के विकास लेस दोनों के आगे मूल्यांकन की अनुमति देता हैएस गल जाना) और हानिकारक कारकों (यानी, फ्लैप pathophysiology पर अधिक परिगलन का विकास). पिछले वर्षों के दौरान, विभिन्न पेरी पूर्व, और ऊतक-सुरक्षात्मक पदार्थ 18-24 के प्रशासन और ऐसी गर्मी 25 और आश्चर्य 26 के रूप में शारीरिक तनाव के स्थानीय आवेदन सहित पद कंडीशनिंग प्रक्रियाओं, के प्रभाव का प्रदर्शन कई प्रयोगात्मक प्रकाशनों, उभरा है.
गल जाना, microvascular आकृति विज्ञान और microcirculatory मापदंडों का मात्रात्मक विश्लेषण आगे immunohistochemical विश्लेषण और प्रोटीन assays के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), नाइट्रिक ऑक्साइड synthases (ओपन स्कूल), परमाणु कारक कापा बी (एनएफ-κB) और गर्मी झटका प्रोटीन (HSP-32 सहित विभिन्न प्रोटीन और अणुओं: हीम-oxygenase 1 (हो-1) और HSP- 70) ऊतक संरक्षण में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. इस कक्ष फ्लैप मॉडल के आधार पर, दो संशोधनों orde में विकसित किया गया हैआर अक्षीय पैटर्न छिड़काव 28 के साथ एक pedicled फ्लैप में त्वचा भ्रष्टाचार चिकित्सा 27 और एन्जियोजेनिक घटनाक्रम के दौरान neovascularization और microcirculation का विश्लेषण करने के लिए. हम माउस skinfold कक्ष में एक ischemically चुनौती दी musculocutaneous फ्लैप भी शामिल है कि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय मॉडल प्रस्तुत करते हैं. इस मॉडल intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा microcirculation और hemodynamics के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
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Protocol
नोट: पहले प्रस्तुत मॉडल के कार्यान्वयन के लिए, इसी पशु संरक्षण कानून परामर्श किया जाना चाहिए और अनुमति के स्थानीय अधिकारियों से प्राप्त किया जाना चाहिए. इस काम में, सभी प्रयोगों अनुसंधान से जुड़े जानवरों के लिए मार्गदर्शक सिद्धांत और जानवरों के संरक्षण पर जर्मन कानून के अनुरूप प्रदर्शन किया गया. प्रयोगों स्थानीय पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. पशु तैयारी और फ्लैप के सर्जिकल ऊंचाई
- 22-24 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर कमरे और एक 12-घंटे दिन और रात के चक्र के साथ 60-65% की सापेक्ष आर्द्रता में एकल पिंजरों में जानवरों रखें. पीने के पानी और मानक प्रयोगशाला चाउ करने के लिए चूहों नि: शुल्क प्रवेश की अनुमति दें. हमेशा जीवित रहने की सर्जरी के दौरान बाँझ शर्तों बनाए रखें.
- 90 मिलीग्राम / किग्रा BW Ketamine हाइड्रोक्लोराइड और 25 मिलीग्राम / युक्त 10 ग्राम BW प्रति 0.1 मिलीलीटर खारा समाधान की intraperitoneal द्वारा माउस anesthetize इंजेक्शन (आईपी)किलो BW dihydroxylidinothiazine हाइड्रोक्लोराइड. संज्ञाहरण पशु तैयारी, सर्जरी और बाद माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है. एक दर्दनाक उत्तेजना के जवाब की जाँच करके उचित anesthetization की पुष्टि करें. संज्ञाहरण के समय के दौरान, सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू होते हैं.
- पर्याप्त संज्ञाहरण के शामिल होने के बाद, एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ वापस बाल हटाना. इसके बाद, शेष बाल हटाने के लिए मुंडा क्षेत्र के लिए depilation क्रीम लागू होते हैं.
- 7-10 मिनट ~ की depilation क्रीम के निवास समय के दौरान, त्वचा संदंश और सूक्ष्म संदंश, कैंची और सूक्ष्म कैंची, सीवन सामग्री और एक मार्कर पेन सहित उपकरणों, तैयार करते हैं. कीटाणुरहित और चैम्बर के आधार पर अखरोट के साथ दो शिकंजा लगाने से और चैम्बर प्रणाली की तंगी की गारंटी करने के चैम्बर के समकक्ष की खिड़की के आसपास स्वयं चिपकने वाला फोम (छवि. 1 एसी) फिक्सिंग से टाइटेनियम कक्ष तैयार करते हैं.
- धोने से पीछे से सब depilation क्रीम निकालेंगुनगुना पानी के साथ बंद. तो सूखी और एक शराब युक्त समाधान के साथ त्वचा कीटाणुरहित.
- प्रवण स्थिति में माउस प्लेस और वापस के midline परिभाषित. केन्द्र त्वचा समझ और एक गुना (छवि. 2A) बनाने के लिए इसे उठा. प्रकाश स्रोत के किसी भी प्रकार का उपयोग कर पार रोशनी से, provisorily टाइटेनियम फ्रेम (छवि. 2 बी) के लिए जगह है, जहां फैसला. सुनिश्चित करें कि cranially पार्श्व वक्ष धमनी (एलटीए) और कक्ष की खिड़की के केंद्र के माध्यम से दुमदारी कोर्स गहरी सिकमफ़्लक्स श्रोणिफलक धमनी (DCIA) के बाहर शाखाओं (छवि. 2 बी डी). कक्ष की स्थिति बार किया जाता है, टाइटेनियम फ्रेम के बाद निर्धारण के लिए गुना के बहुत नीचे त्वचा की दोनों परतों छेदना. अब, टाइटेनियम फ्रेम हटाने प्रवण स्थिति में माउस जगह है और यदि आवश्यक हो तो वापस के midline को फिर से परिभाषित.
- रीढ़ की हड्डी 15 एक्स 1 की चौड़ाई के लिए लंबाई के अनुपात के साथ midline पर शुरू करने के लिए सीधा फ्लैप को रेखांकित करें1 मिमी एक पार्श्व आधारित और बेतरतीब ढंग से perfused फ्लैप में परिणाम. तब contralateral पक्ष को विस्तार 2 मिमी की एक अतिरिक्त त्वचा क्षेत्र रूपरेखा (छवि. -2 सी, डी). इस क्षेत्र संदंश के साथ उठाया और बाद में दिखाई फ्लैप क्षेत्र के साथ हस्तक्षेप किए बिना टाइटेनियम फ्रेम करने के लिए sutured है.
- अंकन अंतिम के बाद, फ्लैप काटकर अलग कर देना. ऐसा करने में, एलटीए और DCIA दोनों आड़ा काट और फ्लैप (छवि. 2 ई) तरक्की. Transected जहाजों की जमावट या बंधाव के लिए कोई जरूरत नहीं है.
- पहले किए गए त्वचा छेद (छवि. 2 एफ) के माध्यम से चैम्बर के पेंच प्लेस और चैम्बर के फ्रेम के छेद और 5-0 का उपयोग कर फ्रेम की पीठ भाग को ऊंचा फ्लैप के चैंबर की सीमा के भीतर दोनों पूर्व से और पीछे skinfold fixate बाधित टांके (छवि. 2 जी).
- (5-0 बाधित टांके के माध्यम से आसपास के त्वचा के लिए वापस फ्लैप के ऊर्ध्वाधर अंग सीवन
- फ्लैप के वाहिका निरीक्षण करने के लिए फ्लैप के दूसरे पक्ष पर, यानी 2 मिमी के छोटे त्वचा पट्टी करने के लिए त्वचा पार्श्व की एक अर्ध-वृत्ताकार क्षेत्र आबकारी. यह 90 मिमी 2 की सतह है कि चैंबर के अवलोकन खिड़की के माध्यम से प्रत्यक्ष देखने की अनुमति देता है.
- माइक्रोस्कोपी के दौरान छवि गुणवत्ता में सुधार लाने के क्रम में microsurgical उपकरणों और ऑप्टिकल आवर्धक लेंस या माइक्रोस्कोप का उपयोग धारीदार मांसपेशी से जिलेटिन की तरह ढीला areolar ऊतक निकालें. पेशी ऊतक परतों के भीतर जहाजों को नुकसान नहीं की कोशिश करें.
- अंत में, सामयिक bisbenzimide और खारा (छवि. 2J) के साथ फ्लैप भिगोना, cranially और पीछे, पहले पूर्व से फोम का स्वयं पालन स्ट्रिप्स के साथ endued किया गया है कि फ्रेम के समकक्ष बढ़ते द्वारा चैम्बर सील. इसके बाद, एक तस्वीर अंगूठी का उपयोग कर एक गिलास को कवर के साथ अवलोकन खिड़की लागू होते हैं. कांच के तहत किसी भी हवाई छाले फंसाने के लिए नहीं की कोशिश करें (छवि. 2K, एल). त्वचा आसंजन बलों द्वारा कवर कांच का पालन करना होगा.
2. intravital epifluorescence माइक्रोस्कोपी
- आदर्श ऑप्टिकल गुणवत्ता के लिए पहली सूक्ष्म विश्लेषण के लिए शल्य चिकित्सा की तैयारी के बाद 24 घंटे तक प्रतीक्षा करें. इस विश्लेषण माइक्रोस्कोपी के आधारभूत प्रतिनिधित्व करता है और सर्जरी के बाद दिन 3, 5, 7 और 10 में दोहराया है. कदम 1.2 में वर्णित के रूप में हर बार, माउस anesthetize. एक कस्टम बनाया Plexiglas वाहक पर एक पार्श्व decubital स्थिति में पशु रखें. इस तरह, कांच कवर का पालन फ्लैप की पेशी ऊतक परतों ऊपर से वार्ड सामना कर रहे हैं.
- एक पूंछ नस या रेट्रो कंदाकार शिरापरक जाल में 5% हरी प्रतिदीप्ति dextran (आण्विक वजन 150,000) और 0.05 मिलीग्राम 1% अत्यधिक फ्लोरोसेंट Rhodamine परिवार डाई का 0.05 मिलीलीटर इंजेक्षन. हरी फ्लोरोसेंट dextran नसों के द्वारा लागू अगर रक्त की गैर सेलुलर घटक दाग (चतुर्थ). जिला हो सकता है कि फ्लोरोसेंट Rhodamine दाग leukocytes और प्लेटलेट्सअन्य सेलुलर और गैर सेलुलर घटकों से inguished. अंत में, संक्षेपण की स्थिति के अनुसार कम या ज्यादा प्रतिदीप्ति फेंकना कि परमाणु के घटकों bisbenzimide दाग.
- इसके बाद, खुर्दबीन के नीचे माउस जगह है. माइक्रोस्कोप एक एलईडी प्रणाली शामिल है सुनिश्चित करें - 470 और 425 एनएम, 365 और 490 एनएम, और 540 और 580 एनएम के लिए एलईडी बीम संयोजन के साथ-साथ इसी फिल्टर सेट (62 महामहिम BFP / GFP / HcRed, सीमा 1: 350-390 एनएम , 460-488 एनएम 495 एनएम / 500-557 एनएम विभाजित; सीमा: 3: सीमा 2; उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, 395 एनएम / 402-448 एनएम विभाजित 567-602 एनएम, अनंत के लिए 610 एनएम / 615 एनएम विभाजित 20 Rhodamine, रेंज. : 540-552 एनएम) उत्सर्जन 575-640 एनएम, 560 एनएम विभाजित.
- चित्र और एक आरोप डिवाइस युग्मित वीडियो कैमरे का उपयोग गति-चित्र रिकार्ड और आगे बंद लाइन विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर हार्ड डिस्क पर उन्हें बचाने के लिए.
- विभिन्न उद्देश्यों (2.5X, एनए (संख्यात्मक एपर्चर) = चैंबर के पैनोरमा विचारों के लिए 0.06 का प्रयोग करें, 5X,एनए = 0.16; 10X, एनए 0.32 =; 20X, एनए 0.50 =; ब्याज के क्षेत्रों की रिकॉर्डिंग के लिए 50X, एनए = 0.55).
- वस्तुतः, बराबर ऊंचाई, यानी, एक समीपस्थ, एक केंद्रीय, और सबसे दूरस्थ संवहनी प्रवाह (छवि. 3F) से एक बाहर का क्षेत्र के तीन क्षेत्रों में कक्ष की खिड़की के माध्यम से दिखाई दे रहा है कि फ्लैप सतह विभाजित करते हैं. छवि अधिग्रहण के लिए, प्रत्येक अवलोकन समय बिंदु पर निम्नलिखित तरीके से आगे बढ़ना:
- 5X उद्देश्य का उपयोग बाहर करने के लिए समीपस्थ से कक्ष की खिड़की के भीतर छवि से ऊतक छवि स्कैन करें.
- फ्लैप के प्रत्येक क्षेत्र में, आसानी से पहचाना शाखाओं में बंटी पैटर्न के साथ दूसरे या तीसरे क्रम धमनियों और उनके साथ venules का चयन करें. 5X, 10X, या 20x उद्देश्य का उपयोग, आसानी से पूरे अवलोकन अवधि के दौरान बंडलों को पुनः स्थानीयकरण के क्रम में arteriolovenular बंडलों का प्रिंटआउट बनाने.
- 20X उद्देश्य और 50X उद्देश्य, आगे रिकॉर्ड 5-6 केशिका क्षेत्रों और "apoptotic साथक्रमशः फ्लैप के क्षेत्र के प्रति "क्षेत्र. 10X और 20X उद्देश्यों के साथ दर्ज की गई सभी छवियों हरे प्रकाश (Rhodamine) फिल्टर, जबकि, 5X और 50X उद्देश्य प्रयोग नीले प्रकाश (फ्लोरोसेंट dextran) और सफेद प्रकाश (Bisbenzimide) फिल्टर के साथ दर्ज की छवियों क्रमशः नीले प्रकाश (फ्लोरोसेंट dextran) और प्रयोग .
दर्ज आंकड़ों की 3. विश्लेषण
नोट: 29 निम्नानुसार एक कंप्यूटर की मदद से छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग बंद लाइन सभी रिकॉर्ड मापदंडों यों के साथ.
- के क्षेत्र के मापन गैर perfused, क्रमशः परिगलित ऊतक (2 मिमी).
- (2.6.1) से 5X उद्देश्य से दर्ज की पूर्ण स्कैन किया चैम्बर खिड़की छवि और गैर perfused क्रमशः परिगलित ऊतक को मापने के लिए फ्लोरोसेंट dextran का प्रयोग करें. गैर perfused क्षेत्र सीमा और मीटर में क्षेत्र की गणना: गैर perfused अंधेरे क्षेत्र को मापने के लिए "AreaBo" समारोह का उपयोग करेंसॉफ्टवेयर के क्षेत्र माप एल्गोरिदम का उपयोग करके मी 2.
- धमनियों, केशिकाओं और venules (माइक्रोन) में microvascular व्यास का मापन.
- दर्ज ए वी-बंडलों या सॉफ्टवेयर में केशिका क्षेत्रों से लोड वीडियो या तस्वीरें. सबसे अच्छा परिणाम उच्चतम बढ़ाई साथ तस्वीर या वीडियो उपयोग के लिए जहाज की निश्चित सीमाओं स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जहां.
- माप पोत की दीवार को सीधा प्रदर्शन कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए सॉफ्टवेयर की "DiamPe" समारोह का उपयोग करें. ऐसा करने के लिए पोत का सीधा व्यास पोत की दीवार पर और तीसरा क्लिक चिह्न के साथ दो अंक निशान. सॉफ्टवेयर माइक्रोन में माप प्रदर्शन करेंगे.
- एक ही स्थान पर सभी रिकॉर्डिंग के लिए एक ही जहाजों पर माप दोहराएँ. औसत व्यास जमा करने के लिए कई केशिकाओं उपाय.
- धमनियों में लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग का विश्लेषण, केशिकाओं एकएन डी venules (मिमी / सेक).
- Arteriolar लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग के लिए (मिमी / एस) माप सॉफ्टवेयर की "VeloLSD" समारोह का उपयोग करें और व्यास मापा गया है जिसके लिए फ्लोरोसेंट dextran खिड़की में ही जहाजों का चयन करें.
- समय (एसईसी) के ऊपर एक व्यक्ति intravascular ग्रे स्तर पैटर्न की पारी (मिमी) की माप के आधार पर है, जो लाइन शिफ्ट विधि का उपयोग कर कंप्यूटर की मदद से छवि विश्लेषण प्रणाली के साथ यह विश्लेषण.
- जहाजों में बड़ा रक्त प्रवाह (PL / सेक) के मापन.
- आरबीसी वेग और पोत पार के अनुभागीय क्षेत्र से धमनियों, venules और केशिकाओं में बड़ा रक्त प्रवाह (PL / सेक) की गणना (π * आर 2) सकल और Aroesty, कि है, क्यू = वी * π * आर 2 के समीकरण के अनुसार एक बेलनाकार पोत आकार 30 संभालने.
- आरबीसी perfused केशिकाओं के कार्यात्मक केशिका घनत्व के मापन (पोषक छिड़काव: सेमी / सेमी
- सॉफ्टवेयर में 20X उद्देश्य बढ़ाई के साथ एक रिकॉर्ड फ्लोरोसेंट केशिका क्षेत्र लोड करें. आरबीसी perfused microvessels के कार्यात्मक केशिका घनत्व को मापने के लिए "DensLA" समारोह का उपयोग करें.
- कर्सर के साथ perfused केशिकाओं का पता लगाने और perfused जहाजों निशान. चिह्नित नहीं करते केशिकाओं, धमनियों या venules गैर perfused. सॉफ्टवेयर सेमी / 2 सेमी में perfused केशिकाओं के कार्यात्मक केशिका घनत्व उपाय करेंगे. अन्य दर्ज केशिका क्षेत्रों के लिए चरणों को दोहराएँ.
- लोड सॉफ्टवेयर में वीडियो या फ्लोरोसेंट केशिका क्षेत्रों के तख्ते दर्ज की गई. Gyrose वाहिकाओं को पहचानें और सॉफ्टवेयर की "TorqIx" समारोह का उपयोग करें. कोर्स के साथ निश्चित पोत प्रवाह का पता लगाने और एक सही क्लिक के साथ खत्म होता है. सॉफ्टवेयर होगासीधे रास्ते के लिए एक सीधी रेखा खींचना और पता लगाया पथ के साथ संबंध में यह सेट हो जाएगा.
नोट: आमतौर पर पहले से मौजूद केशिकाओं से लंबरूप निर्गत होना है जो इस तरह की कलियों, अंकुरित और नवगठित केशिकाओं के रूप में angiogenesis के संकेत, के लिए बाहर देखो. कदम 3.5 में वर्णित के रूप में इन नवगठित वाहिकाओं के घनत्व को मापने.
- सॉफ्टवेयर में Bisbenzimide दर्ज वीडियो (50X उद्देश्य) लोड. "DenseNA" समारोह का उपयोग करें. इस तरह के एक छोड़ दिया क्लिक के साथ परमाणु संक्षेपण, विखंडन और margination के रूप में उल्लेख किया विशेषताओं के अनुसार apoptotic कोशिकाओं निशान.
- वीडियो भर में सभी लक्षण कोशिकाओं अंकन करने के बाद स्वचालित रूप से सभी चिह्नित कोशिकाओं गिनती और क्षेत्र भर में विभाजित होगा, जो सॉफ्टवेयर में "एन / ए 'पर क्लिक करें. परिणाम apoptotic हो जाएगाकोशिकाओं / 2 मिमी.
- Rhodamine की संख्या की गणना के द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया विश्लेषण (<30 सेकंड, "रोलर्स") ≥30 सेकंड के एक समय अवधि ("स्टिकर") के लिए पोस्ट-केशिका venules के endothelial अस्तर का पालन किया है कि leukocytes और रहकर पालन ल्यूकोसाइट्स लेबल . Venular ल्युकोसैट पालन मिमी 2 endothelial सतह प्रति कोशिकाओं के रूप में व्यक्त किया जाता है.
- Macromolecular एल आकलनएक फ्लोरोसेंट dextran के एक चतुर्थ इंजेक्शन के बाद microvascular पारगम्यता की एक पैरामीटर के रूप में eakage. Densitometrically सीधे केशिका पोत दीवार (ई 1) के निकट है, साथ ही पोत (E2) के सीमांत सेल मुक्त प्लाज्मा में ऊतक में कई ग्रे स्तर निर्धारित करते हैं. तब E1 / E2 31 के अनुपात के रूप में macromolecular परिस्त्राव (ई) की गणना.
4. पश्चात की देखभाल
- पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी से बचने के लिए एक अलग पिंजरे में पशु लौटें. यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर मत छोड़ो. खून बह रहा है, स्थानीय और संक्रमण के प्रणालीगत लक्षण और कक्ष की स्थिति के लिए दैनिक जानवरों मॉनिटर.
- ड्रेसिंग और ऑटो विकृति को मोटर गतिविधि, शरीर के वजन, दर्द के लक्षण, सहिष्णुता देख कर जानवर की सामान्य स्थिति का मूल्यांकन.
- Mutu से बचने के लिए पिंजरे प्रति चूहों एक रखेंचैंबर के अल हेरफेर. दर्द के किसी भी संकेत पर, 8 घण्टे के अंतराल में subcutaneously, 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा BW की एक खुराक पर Buprenorphine लागू होते हैं.
5. इच्छामृत्यु और skinfold चैंबर के Explantation
- 10 दिन में, एक संवेदनाहारी दवा (150 मिलीग्राम / किग्रा pentobarbital) की अधिक मात्रा का उपयोग पशुओं का बलिदान.
- कक्ष निकालें और immunohistochemical और आणविक प्रोटीन assays के लिए फ्लैप ऊतक का नमूना. पारंपरिक ऊतक विज्ञान (formalin) और quantifiable प्रोटीन assays के (तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ) के लिए नमूना ऊतकों.
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Representative Results
गल जाना
इस मॉडल की मुख्य समापन बिंदु - ऊतक परिगलन निम्नलिखित फ्लैप ऊंचाई (यानी, तीव्र लगातार ischemia के प्रेरण) - बार बार मापा जाता है और 10 दिनों की अवधि में 3 चित्र में दिखाया गया के रूप में macroscopically सचित्र. फ्लैप नेक्रोसिस के अंतिम सीमांकन आमतौर पर सर्जरी के बाद दिन 5 और 7 के बीच होता है और छवि. 3 डी एफ (समीपस्थ महत्वपूर्ण और फ्लैप के बाहर का परिगलित क्षेत्र के बीच विकासशील, वाहिकाप्रसरण और microvascular remodeling के एक लाल किनारे, यानी, क्षेत्र की विशेषता है ). अच्छी तरह से perfused समीपस्थ, intercalated और समीक्षकों perfused केंद्रीय क्षेत्र और परिगलित बाहर का क्षेत्र (छवि 3F.): अनुपचारित नियंत्रण चूहों आमतौर पर तीन अलग क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है कि 10 दिनों के बाद के बारे में 50% की एक परिगलित क्षेत्र विकसित करना. शुरूआत में उल्लेख किया है के रूप में हमारे समूह की पिछले अध्ययनों, सुरक्षात्मक ई से पता चला हैफ्लैप के बाहर का क्षेत्र की ओर सेंट्रल जोन से गंभीर रूप से perfused क्षेत्र की एक पारी की विशेषता है जो अलग शर्त प्रक्रियाओं, के बाद ffects.
पोत मापदंडों
Microvascular व्यास और धमनियों की लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) -velocity और विभिन्न व्यास के साथ ही पड़ोसी केशिकाओं की venules मापा जाता है और जिसके परिणामस्वरूप बड़ा रक्त प्रवाह बंद लाइन में गणना की है. इस दिन 10 (छवि. -4 ए-बी) के लिए 1 दिन से अलग microvessels की रूपात्मक और कार्यात्मक दोनों परिवर्तन correlating की अनुमति देता है. इसके अलावा, आरबीसी perfused केशिकाओं के कार्यात्मक घनत्व, ऊतक के पोषक छिड़काव के लिए पैरामीटर, विश्लेषण किया है. केशिकाओं आमतौर पर में समानांतर और शारीरिक शर्तों (छवि. 4C) के तहत 3-5 माइक्रोन के बीच व्यास के साथ मौजूद उन्मुख होते हैं. रक्त प्रवाह, Tiss के अंत में कार्यात्मक केशिका घनत्व और ऑक्सीजन तनावधीरे-धीरे "व्यवहार्यता की" एक सीमा तक पहुंचने के लिए बाहर करने के लिए समीपस्थ से कमी Ue (छवि. 4C-ई) केशिकाओं अब (छवि. 4E) perfused नहीं कर रहे हैं, जहां.
Microvascular remodeling और एन्जियोजिनेसिस
फैलाव के साथ Remodeling और microvessels की वृद्धि हुई टेढ़ा-मेढ़ापन फ्लैप तैयारी के दौर से गुजर सभी प्रयोगात्मक समूहों में देखा जा सकता है (यानी, तीव्र लगातार ischemia के प्रेरण:. अंजीर 4F). हालांकि, इस मॉडल में, अकेले इस्कीमिक प्रोत्साहन हार्मोन erythropoietin (छवि. 4G-एच) के साथ शर्त प्रयोगों की एक किस्म में देखा उदाहरण के लिए के रूप में angiogenesis के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं है. आमतौर पर से लंबरूप निकलती microvascular कलियों और अंकुरित से है कि विकसित नई कार्यात्मक microvascular नेटवर्क पहले से मौजूद व्यवस्था की केशिकाओं दिन 3 और 5 के बीच दिखाई दे रहे हैं पहले समानांतर में.
भड़काऊ प्रतिक्रिया (ल्युकोसैट endothelial बातचीत और apoptosis)
एक्यूट लगातार ischemia के आम तौर पर microvascular अन्तःचूचुक को ल्यूकोसाइट्स पालन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है कि इलाज जानवरों में काफी भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. इस भड़काऊ प्रतिक्रिया (यानी, रुक-रुक कर संवहनी अन्तःचूचुक को leukocytes के आसंजन) और चिपके हुए (यानी, नाड़ी अन्तःचूचुक को leukocytes की फर्म आसंजन) ल्यूकोसाइट्स (छवि. 5A-बी) रोलिंग की विशेषता है. इसके अलावा, apoptotic कोशिकाओं की एक ischemia प्रेरित वृद्धि परमाणु संक्षेपण, विखंडन और margination (छवि. 5C-डी) के लक्षण के संकेत के साथ सभी नियंत्रण पशुओं में देखा जा सकता है. दोनों ल्युकोसैट endothelial बातचीत और apoptosis ischemia प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए संकेत मिल रहे हैं और धीरे-धीरे प्रगतिशील microvascular रोग के साथ वृद्धि और ऊतकों की ऑक्सीजन तनाव में कमी आई है (यानी (छवि. 5A-डी)).
चित्रा 1. टाइटेनियम चैम्बर फ्रेम के चित्रण और अपने काम के टुकड़े के सभी. (ए) के दो फ्रेम भागों, तीन शिकंजा, पांच पागल, एक फोम का टुकड़ा, एक कवर गिलास और एक तस्वीर अंगूठी से मिलकर disassembled फ्रेम. (बी) एक हेक्स अखरोट ड्राइवर, एक तस्वीर अंगूठी plier और एक तार कटर सहित फ्रेम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक उपकरण. कक्षों में कई बार इस्तेमाल किया जाएगा अगर एक शराबी की आवश्यकता है, लेकिन अनुशंसित नहीं है. (सी) एकल कक्ष भागों इकट्ठे हुए. दो शिकंजा के साथ फ्रेम के पीछे की ओर और कम दो छेद पर पागल संलग्न: वाम. पीछे की ओर त्वचा पर फ्रेम सीवन के लिए इस्तेमाल किया और फ्लैप भालू है. अधिकार: के सामने की ओर इकट्ठेसंलग्न फोम के साथ फ्रेम तंगी की गारंटी करने के लिए. सभी तीन पेंच छेद फोम से मुक्त रखा जाता है कि ध्यान दें. फोम से कोई कवर गिलास भालू जो अवलोकन खिड़की, में दबाया होगा कि सुनिश्चित करें. (डी) योजनाबद्ध पृष्ठीय skinfold बिना चैम्बर फ्रेम इकट्ठे हुए.
ऑपरेटिव फ्लैप प्रक्रिया और माउस का टाइटेनियम पृष्ठीय skinfold कक्ष में इसके कार्यान्वयन की चित्रा 2. चित्रण. (ए) ऊंचा पार प्रबुद्ध पृष्ठीय skinfold कक्ष की स्थिति रूपरेखा के लिए संवहनी वास्तुकला कल्पना करने के लिए माउस के पृष्ठीय skinfold दोगुनी. (बी) के चैम्बर के टाइटेनियम फ्रेम की पीठ तैनात है और जहाजों के साथ गठबंधन किया गया है. शिकंजा लिए दो छेद का चीरा फ्रेम हेक्टेयर के सामने की ओर संलग्न करने के लिएएस किया गया. चौड़ाई से लंबाई अनुपात 11 मिमी से 15 मिमी दो लंबरूप उत्पन्न होने वाले जहाजों centralizing जबकि है: पार्श्व पृष्ठीय त्वचा पर फ्लैप की रूपरेखा (सी और डी). Contralateral पक्ष (पतली फ्लैप रूपरेखा और मोटी सीमा के बीच अगोचर क्षेत्र) के लिए एक 2 मिमी दूरी फ्लैप तरक्की संदंश के साथ त्वचा काबू करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कक्ष की खिड़की के माध्यम से पीठ त्वचा के अवलोकन के लिए, अतिरिक्त ऊतक (रची क्षेत्र) हटा दिया जाना चाहिए. (ई) ऊंचा पार्श्व फ्लैप के आधार से होने वाले बेतरतीब ढंग से व्यवस्था की नाड़ी वास्तुकला का प्रदर्शन, त्वचा फ्लैप आधारित. रची क्षेत्र बाहर कटौती की गई है, लेकिन अभी भी फ्लैप से जुड़ा हुआ है और (संदंश नीचे त्वचा लटक) अगले चरण में निकाल दिया जाता है. चैम्बर फ्रेम के पीछे की ओर बढ़ते (एफ). फ्लैप की त्वचा की सतह पीठ और कांच की खिड़की की ओर के तहत "कच्चे" सतह पर है. chamber`s शिकंजा thr के फंस रहे हैंough पृष्ठीय skinfold के दोनों ओर छेद छिन्न. फ्लैप के पूर्व से और पीछे (जी) के आस-पास की त्वचा, ऊपरी सदन रिम के छेद में तय हो गई है. (एच) त्वचा फ्लैप बाहर फैला और भी फ्रेम के पीछे की ओर करने के लिए sutured है. फ्लैप का निर्जलीकरण से बचने के लिए, 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान बार बार फ्लैप पर dripped है. (मैं) फ्लैप और आसपास त्वचा पूरी तरह से ऊपरी सदन रिम के छेद में तय हो गई है. फ्लैप कक्ष की तंगी की गारंटी करने के लिए आसन्न पृष्ठीय त्वचा में पार्श्व वापस sutured है. (जम्मू) अवलोकन खिड़की आसपास, फ्रेम के फोम असर समकक्ष बढ़ते. (कश्मीर) पूरी तरह से चैम्बर घुड़सवार: एक गिलास को कवर अवलोकन खिड़कियों से जुड़ी है और एक तस्वीर की अंगूठी के साथ बंद है. एक तीसरा पेंच अतिरिक्त तंगी के लिए फ्रेम के ऊपर से जुड़ा हुआ है. कक्ष में खिड़की microvasculatur के दोहराया विश्लेषण की अनुमति देता हैintravital माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लैप के ई. माइक्रोस्कोपी के दौरान आसान पहुँच के लिए तीन शिकंजा छोटा कर रहे हैं. (एल) घुड़सवार पृष्ठीय skinfold कक्ष के साथ जाग और चलती माउस.
दिन में फ्लैप परिगलन की रूपात्मक विकास और सीमांकन के चित्रा 3. प्रस्तुति 0, 1 (बी), 3 (सी), 5 (डी), 7 (ई) और 10 (तुरंत फ्लैप तैयारी, एक के बाद) (एफ) . अंतिम परिगलित सीमांकन दिन 5 और 7 (डी और ई) के बीच होता है. नियंत्रण एक hyperemic प्रतिक्रिया और microvascular remodeling के साथ ही एक perfused गैर लेकिन संभावित रूप से व्यवहार्य क्षेत्र वर्णन किया ऊतक को दर्शाती है, एक लाल फ्रिंज और (ई में डबल नोक और तारक) एक सफेद दात्र सहित केंद्रीय फ्लैप क्षेत्र में सीमांकन का एक अलग क्षेत्र है, दिखाने परिगलन distally (ई) के विकास. पैनल में एफ, फ्लैपऊतक 2 क्षैतिज लाइनों द्वारा तीन अलग क्षेत्रों में बांटा गया है: (छवि के आधार पर) अच्छी तरह से perfused समीपस्थ क्षेत्र, लाल फ्रिंज इस्कीमिक मस्तिष्क में Penumbra के लिए इसी "lunatica दात्र" एक सफेद सहित समीक्षकों perfused केंद्रीय क्षेत्र ( स्ट्रोक चोट) और circumferentially लाल बॉर्डर से चिह्नित परिगलित बाहर का क्षेत्र () के बाद ऊतक. आवर्धन 16X.
Arteriovenular की छवियों को प्रदर्शित चित्रा 4. intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ए वी) बंडलों (ए, बी), केशिका क्षेत्रों (सी, डी, ई) और ऐसे remodeling (एफ) और angiogenesis (जी, एच) के रूप में रूपात्मक परिवर्तन. एक नियंत्रण जानवर (ए, बी) दिन 1 (ए) और 10 (बी) में में एक ही ए वी-बंडल दिखा intravital माइक्रोस्कोपी. दोनों arteriol में पूरी अवलोकन अवधि में नियंत्रण में टालमटोल प्रतिक्रिया के अभाव नोटएआर (एक) और venular (वी) व्यास. छवियाँ सी, डी और ई parallelly अच्छी तरह से perfused समीपस्थ क्षेत्र (सी), समीक्षकों perfused केंद्रीय संक्रमण क्षेत्र (डी) और इस्कीमिक फ्लैप ऊतक की गैर perfused परिगलित बाहर का क्षेत्र (ई) में केशिकाओं की व्यवस्था प्रदर्शित करता है. केवल संवहनी remodeling दिखा गंभीर रूप से perfused सेंट्रल जोन नियंत्रण चूहों (एफ) में, फैलाव और बढ़ टेढ़ा-मेढ़ापन साथ समानांतर व्यवस्था की केशिकाओं में से होती है. इसके विपरीत, चूहों एक शर्त आहार नवगठित शो के रूप में फ्लैप ऊंचाई से पहले erythropoietin प्राप्त और लंबरूप सामान्य पूर्व मौजूदा केशिकाओं (जी, एच) से स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है जो केशिकाओं, उत्पन्न होने वाली. इस एन्जियोजेनिक प्रतिक्रिया नियंत्रण में नहीं देखा गया है. फ्लोरोसेंट dextran 150,000 से वृद्धि विरोध करें. आवर्धन 80X.
चित्रा 5. </ Strong> intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से perfused समीपस्थ फ्लैप क्षेत्र (ए) और ऊतक (बी) की समीक्षकों perfused इस्कीमिक केंद्रीय संक्रमण क्षेत्र में ए वी-बंडलों प्रदर्शित. Postcapillary venules में leukocytes (तीर) पालन की वृद्धि की उपस्थिति नोट (वी) और स्वस्थ समीपस्थ क्षेत्र (ए) की तुलना में जब इस्कीमिक फ्लैप क्षेत्र (बी) के भीतर धमनियों (एक). Rhodamine साथ वृद्धि विरोध करें. आवर्धन 80X. नियंत्रण के समीपस्थ (सी) के भीतर apoptotic कोशिका मृत्यु और गंभीर रूप से perfused केंद्रीय फ्लैप क्षेत्र (डी) का संकेत परमाणु संक्षेपण प्रदर्शित intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. समीपस्थ क्षेत्र (सी) की तुलना में जब apoptotic कोशिकाओं (सफेद तीर) की बढ़ती संख्या अधिक इस्कीमिक केंद्रीय संक्रमण क्षेत्र (डी) के भीतर मनाया जाता है. Bisbenzimide साथ वृद्धि विरोध करें. बढ़ाई 250X.
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Discussion
नैदानिक परिणाम इस्कीमिक जटिलताओं को कम करने और इस तरह सुधार करने के लिए, समीक्षकों perfused फ्लैप ऊतक में pathophysiologic प्रक्रियाओं का अधिक विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है. तीव्र लगातार ischemia के नकल कि नए पशु मॉडल का विकास इसलिए अनिवार्य है. तदनुसार, हम नमूना फ्लैप ऊतक के immunohistochemical और आणविक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है कि मांसपेशियों और त्वचा vasculature की विभिन्न मापदंडों का दोहराव, रूपात्मक गतिशील और कार्यात्मक वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है एक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय मॉडल विकसित करने में सक्षम थे.
अभ्यास और कुछ मैनुअल निपुणता आवश्यक है, हालांकि शल्य प्रक्रिया, किसी भी विशिष्ट शल्य कौशल की आवश्यकता नहीं है. के बारे में 25-30 संचालित जानवरों की एक सीखने की अवस्था ठीक से पृष्ठीय skinfold कक्ष और फ्लैप तैयारी के बढ़ते मास्टर करने के लिए आम तौर पर आवश्यक है. अनुभवी हाथों में, सर्जरी के औसत से 35 मिनट के लिए समय है. महत्वपूर्णफ्लैप तैयारी के इस कदम को सही स्थान और रूपरेखा मुख्य जहाजों की सही स्थिति के साथ कक्ष की खिड़की के केंद्र में फ्लैप के (ट्रांस-रोशनी का उपयोग) transected किया जाना है और panniculus carnosus ऊपर जिलेटिन की तरह परत का सावधानीपूर्वक हटाने शामिल छवि बढ़ाई उपयोग कर छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए.
फ्लैप आयाम मिलीमीटर में दिया जाता है, हम सही फ्लैप अंकन के लिए एक रपट कैलीपर का उपयोग करना चाहिये. कक्ष की खिड़की के भीतर क्षैतिज व्यवस्था प्रमुख जहाजों स्थिति है, जबकि किसी भी कठिनाइयों कर रहे हैं, एक नहीं बल्कि जहाजों की एक अधिक समीपस्थ स्थिति की तुलना में एक अधिक बाहर का चयन करना चाहिए. बाहर से फ्लैप उठाने समीपस्थ और एक बेतरतीब ढंग से perfused फ्लैप में परिणाम के लिए, जबकि कक्ष की खिड़की अनुप्रस्थ कि इन जहाजों की सही स्थिति, इनमें से transection की गारंटी देता है. दूसरे शब्दों में, विफलता इन प्रमुख वाहिकाओं एक अक्षीय छिड़काव में परिणाम होगा आड़ा काट के लिएखिड़की के नीचे ऊतक की परिगलन बिना पैटर्न. शल्य चिकित्सा की तैयारी के दौरान अंतिम महत्वपूर्ण कदम जिलेटिन की तरह areolar ऊतक की परत को हटाने का सवाल है. अनुभव अत्यधिक हटाने हर्जाना अधोवर्ती panniculus carnosus और इतने नाजुक क्षैतिज पेशी केशिकाओं की व्यवस्था की है कि दिखाया गया है. उल्टे, शोफ-गठन में रूढ़िवादी हटाने के परिणाम और माइक्रोस्कोपी के दौरान ब्याज के क्षेत्रों के अंत में सीमित दृश्यता. इन सभी चरणों का सावधानी से महारत हासिल कर रहे हैं, फ्लैप बहुत लगातार फ्लैप पदोन्नति के बाद 50% परिगलन 10 दिन लगभग विकसित करता है. यह सुधार या फ्लैप ऊतक के अस्तित्व खराब हो सकता है कि विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियों का अध्ययन की अनुमति देता है. अंत में, intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की विधि microvascular ऊतक छिड़काव का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रिया है और बहुत जल्दी से सीखा जा सकता है.
इस मॉडल की बड़ी खामी कक्ष के भीतर ऊतक के सीमित अवलोकन समय है217; फ्लैप तैयारी निम्नलिखित लगभग 10 से 14 दिनों की खिड़की. यह अंत में चैंबर के बग़ल में झुकने में यह परिणाम है कि पृष्ठीय skinfold चैम्बर के लिए त्वचा समीपस्थ की प्रगतिशील ढीला की वजह से है. शायद ही कभी, सैंडविच की तरह, तय त्वचा कक्ष के फ्रेम से बाहर खींचती है और माइक्रोस्कोपी असंभव बना देता है. गल जाना सबसे अधिक बार पूरी तरह से सर्जरी के बाद दिन 5 और 7 के बीच सीमांकन जाता है, यह वास्तव में चैंबर के झुकने या कक्ष के भीतर त्वचा से बाहर खींच से पहले डाटा अधिग्रहण समझौता नहीं करता.
मॉडल के लाभ के लिए आसान reproducibility और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के संभावित उपयोग शामिल है. हालांकि मानव की स्थिति में परिणाम का अनुवाद करने में महत्व समझौता हो सकता मूल्यांकन किया जा सकता है कि खिड़की के अपेक्षाकृत छोटे आकार. इसके अलावा, ढीली चमड़ी पशुओं और मनुष्यों के बीच शारीरिक मतभेद हैं. जानवरों और शल्य चिकित्सा उपकरणों के लिए एक उचित लागत प्रभावशीलता है, वहीं हरियाणाडी और आवश्यक सॉफ्टवेयर (बंद लाइन डेटा विश्लेषण के लिए महामारी रोशनी खुर्दबीन, उच्च संकल्प कैमरा, फ्लोरोसेंट रंगों और विशेष सॉफ्टवेयर) माइक्रोस्कोपी एक बड़ा निवेश का प्रतिनिधित्व करने के लिए.
निष्कर्ष:
हम उच्च संकल्प पर दृश्य और microcirculatory मापदंडों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एक समय और चूहों में लागत प्रभावी पशु मॉडल प्रस्तुत करते हैं. यह दृष्टिकोण समीक्षकों perfused musculocutaneous फ्लैप ऊतक और अंतर्निहित सेलुलर तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक आदर्श तरीका का प्रतिनिधित्व करता है. ब्याज के क्षेत्रों की morphological परिवर्तन बार-बार जांच की और एक microvascular और सेलुलर स्तर पर कार्यात्मक परिवर्तनों के साथ जोड़ा जा सकता है. Intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद, ऊतक आगे ऊतकीय और आणविक दृष्टिकोण का उपयोग संसाधित किया जा सकता है.
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Acknowledgments
हम छवि संपादन के लिए Katharina Haberland धन्यवाद. अनुदान: वरिष्ठ लेखक एक नए शोध प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए Technische Universität München से एक KKF अनुदान प्राप्त किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
