Summary
La ventana de la cámara de pliegue cutáneo dorsal murino presentado visualiza una zona de isquemia aguda persistente de un colgajo musculocutáneo. Intravital permisos de microscopía de fluorescencia para epi-evaluación directa y repetitiva de la microvasculatura y la cuantificación de la hemodinámica. Morfológicas y resultados hemodinámicos más pueden ser correlacionados con los análisis histológicos y moleculares.
Abstract
A pesar de la experiencia profunda y técnicas quirúrgicas avanzadas, las complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la extensa necrosis de los tejidos siguen ocurriendo, sobre todo en la cirugía de colgajo reconstructiva. Se han desarrollado varios modelos experimentales de solapa para analizar las causas y los mecanismos subyacentes e investigar estrategias de tratamiento para prevenir complicaciones isquémicas. El factor limitante de la mayoría de los modelos es la posibilidad de que carecen para visualizar directamente y repetitivamente arquitectura microvascular y la hemodinámica. El objetivo del protocolo es presentar un modelo de ratón bien establecida afiliarse estos elementos carecen antes mencionados. Harder et al. Han desarrollado un modelo de un colgajo musculocutáneo con un patrón al azar de perfusión que sufre la isquemia aguda y persistente resultados en ~ 50% de necrosis después de 10 días si se mantiene sin tratar. Con la ayuda de intravital microscopía de epi-fluorescencia, este modelo de cámara permite la visualización repetitiva demorfología y la hemodinámica en diferentes regiones de interés con el tiempo. Procesos asociados, tales como la apoptosis, la inflamación, la fuga microvascular y la angiogénesis pueden ser investigados y correlacionados con ensayos de proteínas inmunohistoquímicos y moleculares. Hasta la fecha, el modelo ha demostrado la factibilidad y reproducibilidad en varios estudios experimentales publicados que investigaron el efecto de pre, peri y poscondicionamiento de tejido isquémicamente desafiado.
Introduction
Cobertura de material de tendón, hueso y el implante expuesto en la cirugía reconstructiva se basa en el uso de colgajos. Un colgajo es un bloque de tejido que se transfiere en su pedículo vascular que garantiza el flujo arterial y flujo de salida venoso. A pesar de una amplia experiencia y la disponibilidad de una variedad de aletas para ser transferidos, que aún se registran complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la pérdida total del tejido. Mientras que el tratamiento conservador y la curación por segunda intención se puede esperar después de la necrosis del tejido menor, necrosis del colgajo significativa por lo general requiere revisión quirúrgica, incluyendo el desbridamiento, el acondicionamiento de la herida y reconstrucción secundaria. Esto aumenta la morbilidad, prolonga la estancia hospitalaria y en consecuencia conduce a un aumento de los costos de atención de salud.
Flaps con un patrón definido de la vasculatura o áreas perfundidos al azar en la zona distal más alejada del flujo de entrada arterial son particularmente propensos a daño isquémico. Acco rdingly, numerosos estudios experimentales y clínicos han evaluado el desarrollo de necrosis en tanto, colgajos de patrón axial (suministro de sangre definida) y colgajos de patrón aleatorio (suministro de sangre no definido) 3.1. Las principales conclusiones se basan comúnmente en la evaluación macroscópica de la extensión de la zona necrótica. Con el fin de evaluar las causas y mecanismos de la necrosis de los tejidos más en detalle, varios estudios se centraron en el análisis de la microcirculación. Diferentes técnicas han sido utilizadas para medir la perfusión del tejido, incluyendo el análisis de la tensión de oxígeno del tejido usando electrodos polarográficos 4-5, así como la medición del flujo de sangre usando flujometría láser Doppler 6-7, tinte de difusión 8, y las microesferas 9-10. Estas técnicas, sin embargo, sólo permiten medir parámetros indirectos de la perfusión tisular y no permiten ningún análisis morfológico de los procesos microhemodynamic dentro de una zona individual de interés de un colgajo.
t "> Sandison es conocido por ser el primero que ha utilizado una cámara transparente para prolongada en los estudios in vivo, que se realizó en conejos 11 En 1943 -. aproximadamente 20 años más tarde - Algire fue el primero en adaptar una cámara de tan transparente que es aplicable en ratones con el fin de estudiar el comportamiento de los micro-implantes de células tumorales 12. Debido al hecho de que los ratones son los llamados animales de piel suelta y después de algunas mejoras técnicas en los años siguientes, Lehr y compañeros de trabajo fueron capaces de adaptar tales una cámara de pliegue cutáneo dorsal desarrollo de una cámara de titanio más pequeño y ligero. Esta cámara de activar la evaluación mediante microscopía de fluorescencia intravital, una técnica que permite la visualización directa y repetitiva de un número de características morfológicas y de la microcirculación y sus cambios en el tiempo bajo diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, tales como la lesión por isquemia-reperfusión 13.En la investigación del PErfusion de colgajos de piel, músculo y hueso en condiciones normales y patológicas dos tendencias se produjo: En primer lugar, los modelos de solapa "agudos" que no utilizan la cámara del pliegue cutáneo dorsal como la oreja pediculado en el ratón 14, el colgajo de piel isla basada lateralmente en el hámster 15 y la solapa de material compuesto pediculado en la rata 16. En segundo lugar, el modelo de aleta "crónica" donde la combinación de una aleta con una cámara lo permite pliegues cutáneos dorsal de la microcirculación repetitivo analiza lo largo de varios días con microscopía de fluorescencia intravital. Se compone de un colgajo musculocutáneo perfundido al azar que está integrado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón 17. Su proporción entre anchura y longitud que se eligió una situación de isquemia aguda persistente como resultado consistentemente en ~ 50% de necrosis tisular aleta 10 a 14 días después de la elevación del colgajo. Esta medida reproducible de necrosis de los tejidos permite una evaluación posterior de ambos, de protección (es decir, el desarrollo de less necrosis) y factores perjudiciales (es decir, desarrollo de más necrosis) en la fisiopatología solapa. Durante los últimos años, varias publicaciones experimentales que demuestren el efecto de diferentes pre, peri y procedimientos post-acondicionamiento, incluyendo la administración de sustancias de protección de tejido 18-24 y la aplicación local de factores de estrés fisiológicos tales como el calor 25 y 26 de ondas de choque, han surgido.
Los análisis cuantitativos de la necrosis, la morfología microvascular y los parámetros de la microcirculación más pueden ser correlacionados a los análisis inmunohistoquímicos y ensayos de proteínas. Diferentes proteínas y moléculas, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), óxido nítrico sintasas (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) y proteínas de choque térmico (HSP-32: hemo-oxigenasa 1 (HO-1) y HSP- 70) han sido demostrado que desempeñan un papel en la protección de los tejidos. Basándose en este modelo tapa de la cámara, dos modificaciones se han desarrollado en order para analizar la neovascularización y la microcirculación de la piel durante la cicatrización del injerto 27 y desarrollos angiogénicos en un colgajo pediculado con el patrón axial perfusión 28. Presentamos un modelo reproducible y fiable que incluye un colgajo musculocutáneo isquémicamente desafiado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón. Este modelo permite la visualización y cuantificación de la microcirculación y la hemodinámica por intravital microscopía de epi-fluorescencia.
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Protocol
NOTA: Antes de la implementación del modelo presentado, las leyes de protección animal correspondiente deben ser consultados y deben obtener permiso de las autoridades locales. En este trabajo, todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios rectores de los animales de investigación que involucra y la legislación alemana sobre protección de los animales. Los experimentos fueron aprobados por el comité local de cuidado de los animales.
1. Preparación de Animales y elevación quirúrgica del colgajo
- Mantener a los animales en jaulas individuales a temperatura ambiente de 22-24 ° C y con una humedad relativa de 60-65% con un ciclo de día y noche de 12 horas. Permitir ratones libre acceso al agua potable y comida estándar de laboratorio. Siempre mantener condiciones estériles durante la cirugía de la supervivencia.
- Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (ip) de inyección de 0,1 ml de solución salina por 10 g de peso corporal que contiene 90 mg / kg de peso corporal clorhidrato de ketamina y 25 mg /kg de peso corporal clorhidrato dihydroxylidinothiazine. La anestesia es necesario para la preparación animal, la cirugía y la microscopía subsiguiente. Confirmar anestesia adecuada por el control de la respuesta a un estímulo doloroso. Durante el tiempo de anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
- Después de la inducción de la anestesia suficiente, depilarse la espalda con una rasuradora eléctrica. De aquí en adelante, aplique crema de depilación a la zona de afeitado para eliminar el resto del cabello.
- Durante el tiempo de residencia de la crema de depilación de ~ 7-10 min, preparar instrumentos, incluyendo fórceps de la piel y micro forceps, tijeras y micro tijeras, material de sutura y un rotulador. Desinfectar y preparar la cámara de titanio mediante la aplicación de los dos tornillos con la tuerca en la base de la cámara y por la fijación autoadhesiva de espuma (Fig. 1 AC) alrededor de la ventana de la contraparte de la cámara para garantizar la estanqueidad del sistema de cámara.
- Quite toda la crema de depilación de la parte posterior por lavadoapagado con agua tibia. Entonces seco y desinfectar la piel con una solución que contiene alcohol.
- Coloque el ratón en posición prona y definir la línea media de la espalda. Sujete la piel de forma centralizada y levántela para crear un pliegue (Fig. 2A). Por trans-iluminación utilizando cualquier tipo de fuente de luz, decidir dónde colocar provisoriamente el marco de titanio (Fig. 2B). Asegúrese de que las ramas distales de la arteria torácica lateral (LTA) craneal y la arteria circunfleja ilíaca profunda (DCIA) caudalmente curso a través del centro de la ventana de la cámara (Fig. 2B-D). Una vez que el posicionamiento de la cámara se hace, perforar ambas capas de la piel en la parte inferior de la tapa para la fijación posterior del marco de titanio. Ahora retire el marco de titanio, coloque el ratón en posición prona y redefinir la línea media de la espalda si es necesario.
- Esquema de la aleta perpendicular a la columna vertebral a partir de la línea media con una relación entre anchura y longitud de 15 x 11 mm para dar como resultado un colgajo de base lateral y perfundido al azar. Luego delinear un área de la piel adicional de 2 mm que se extienden hacia el lado contralateral (Fig. 2C, D). Esta área se recogió con las pinzas y posteriormente se sutura a la estructura de titanio sin interferir con el área de la aleta visible.
- Tras el marcado final, incisión del colgajo. Al hacerlo, seccionar tanto el LTA y DCIA y elevar la tapa (Fig. 2E). No es necesario para la coagulación o la ligadura de los vasos seccionados.
- Coloque el tornillo de la cámara a través de las perforaciones de la piel previamente realizadas (Fig. 2F) y fijar el pliegue cutáneo, tanto anterior y posteriormente dentro del marco de la cámara de la solapa elevada a la parte trasera del bastidor usando los agujeros del marco de la cámara y un 5-0 suturas interrumpidas (Fig. 2G).
- Suturar las extremidades verticales de la solapa posterior a la piel circundante por medio de suturas interrumpidas 5-0 (
- Extirpar una zona de hemi-circular de la piel lateral a la tira pequeña de la piel de 2 mm, es decir, en el otro lado de la aleta para observar la vasculatura del colgajo. Esto permite la visión directa a través de la ventana de observación de la cámara que tiene una superficie de 90 mm 2.
- Retire el tejido areolar suelto gelatinoso del músculo estriado utilizando instrumentos de microcirugía y lente de aumento óptico o microscopio con el fin de mejorar la calidad de la imagen durante la microscopía. Trate de no dañar los vasos dentro de las capas de tejidos musculares.
- Finalmente, sellar la cámara mediante el montaje de la contraparte de la trama que ha sido previamente dotado con tiras auto adherentes de espuma anteriormente, cranealmente y posteriormente, bedew la solapa con bisbenzimide tópica y solución salina (Fig. 2J). A partir de entonces, aplicar la ventana de observación con una cubierta de vidrio utilizando un anillo de retención. Trate de no atrapar ningún ampollas de aire bajo el cristal (fig. 2 K, L). La piel se adhiere a la cubierta de vidrio por las fuerzas de adhesión.
2. intravital microscopía de epifluorescencia
- Espere 24 horas después de la preparación quirúrgica para el primer análisis microscópico de la calidad óptica ideal. Este análisis representa la línea de base de la microscopía y se repite en el día 3, 5, 7 y 10 después de la cirugía. Cada vez, anestesiar el ratón como se describe en el paso 1.2. Colocar el animal en posición decúbito lateral en un soporte de plexiglás hechos a medida. De esa manera, las capas de tejido musculares del colgajo se adhiere a la cubierta de vidrio queden mirando hacia arriba-hacia.
- Inyectar 0,05 ml de 5% de dextrano de fluorescencia verde (peso molecular 150.000) y 0,05 ml de 1% de colorante de la familia altamente fluorescente Rodamina en una vena de la cola o el plexo venoso retro-bulbar. El dextrano fluorescente verde tiñe los componentes no celulares de la sangre si se aplica por vía intravenosa (iv). El fluorescente rodamina manchas de leucocitos y plaquetas que puede ser distinguished de otros componentes celulares y no celulares. Finalmente, bisbenzimide tiñe componentes nucleares que emiten más o menos la fluorescencia de acuerdo con el estado de la condensación.
- Posteriormente, colocar el ratón bajo el microscopio. Asegúrese de que el microscopio incluye un sistema de LED - LED para combinaciones de haces 470 y 425 nm, 365 y 490 nm, y 540 y 580 nm, así como los conjuntos de filtros correspondientes (62 HE BFP / GFP / HcRed, rango de 1: 350 a 390 nm longitud de onda de excitación, divide 395 nm / 402-448 nm; intervalo de 2: 460-488 nm, divide 495 nm / 500 hasta 557 nm, rango 3: 567-602 nm, divide 610 nm / 615 nm a 20 Rodamina infinita, gama. : 540-552 nm, divide 560 nm, emisión de 575 a 640 nm).
- Registre las imágenes fijas y en movimiento-imágenes usando una cámara de vídeo del dispositivo de acoplamiento de carga y guardarlos en un disco duro de la computadora para el análisis adicional fuera de línea.
- Utilice diferentes objetivos (2.5 veces, NA (apertura numérica) = 0,06 para las vistas panorámicas de la cámara; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) para las grabaciones de las regiones de interés.
- Prácticamente, dividir la superficie de la pestaña que es visible a través de la ventana de la cámara en tres áreas de igual altura, es decir, una proximal, una central, y una zona distal más alejada de la entrada vascular (Fig. 3F). Para la adquisición de imágenes, proceda de la siguiente manera en cada punto de tiempo de observación:
- Escanear la imagen del tejido por imagen dentro de la ventana de la cámara de proximal a distal usando el objetivo de 5X.
- En cada área de la solapa, seleccione las arteriolas de segundo o tercer orden y sus vénulas acompañan con patrones de ramificación fácilmente identificables. Usando el objetivo de 5X, 10X, 20X o, hacer impresiones de los haces de arteriovenosas con el fin de volver a localizar fácilmente los haces durante todo el período de observación.
- Con el objetivo de 20X y el objetivo 50X, otros campos capilares récord de 5-6 y "apoptótica"campos por área de la aleta, respectivamente. Todas las imágenes grabadas con la 10X y 20X objetivos usan la luz azul (dextrano fluorescente) y la luz verde (rodamina) filtro, mientras que las imágenes grabadas con el 5X y 50X uso objetivo de color azul claro (dextrano fluorescente) y la luz blanca (bisbenzimide) filtro, respectivamente .
3. El análisis de los datos registrados
NOTA: Con el uso de un sistema de análisis de imagen asistido por ordenador cuantificar todos los parámetros registrados fuera de línea 29 de la siguiente manera.
- Medición de la zona de no-perfundido, el tejido necrótico, respectivamente (mm 2).
- Utilice la imagen completa cámara de escaneado ventana grabado con el objetivo de 5X (de 2.6.1) y el dextrano fluorescente para medir tejido no perfundido respectivamente necrótico. Utilice la función "AreaBo" para medir el área no perfundida oscuro: Frontera de la zona para no perfundido y calcular el área en mm 2 mediante el uso de algoritmos de medición de área del software.
- Medición de diámetro microvascular en las arteriolas, capilares y vénulas (M).
- Carga de vídeo o imágenes de los AV-haces grabados o los campos de capilares en el software. Para obtener los mejores resultados, utilice los alambiques o videos con la más alta magnificación, donde las fronteras definitivas de la embarcación son claramente visibles.
- Utilice la función "DiamPe" del software para asegurarse de que las mediciones se realizan perpendicular a la pared del vaso. Para ello marca de dos puntos en la pared del recipiente y con la tercera marca clic el diámetro perpendicular de la embarcación. El software realizará la medición en micras.
- Repita las mediciones en los mismos buques de todas las grabaciones en el mismo lugar. Mida múltiples capilares para acumular diámetro medio.
- Análisis de la velocidad de glóbulos rojos (RBC) en las arteriolas, capilares unnd vénulas (mm / seg).
- Para las arteriolas de glóbulos rojos (RBC) de velocidad (mm / s) mediciones utilizan la función "VeloLSD" del software y eligen los mismos buques en la ventana de dextrano fluorescente para el que se han medido los diámetros.
- Analizar con el sistema de análisis de imagen asistido por ordenador usando el método de desplazamiento de la línea, que está en la base de la medición del desplazamiento (mm) de un patrón de nivel de gris intravascular individuo con el tiempo (sec).
- Medición del flujo sanguíneo en los vasos volumétrica (pl / seg).
- Calcular el flujo volumétrico de la sangre (pl / seg) en las arteriolas, vénulas y capilares a partir de la velocidad y el recipiente de área de sección transversal RBC (π * r 2) de acuerdo con la ecuación de Gross y Aroesty, es decir, Q = V * π * r 2 , suponiendo un recipiente de forma cilíndrica 30.
- Medida de la densidad capilar funcional de los capilares perfundidos-RBC (perfusión nutritivo: cm / cm
- Cargar un campo capilar fluorescente grabado con 20X aumento del objetivo en el software. Utilice la función "DensLA" para medir la densidad capilar funcional de microvasos perfundidos-RBC.
- Traza los capilares perfundidos con el cursor y marcar los vasos perfundidos. No marque no perfundido capilares, arteriolas o vénulas. El software medir la densidad capilar funcional de los capilares perfundidos en cm / cm 2. Repita los pasos para los otros campos capilares registrados.
- Cargar vídeos o marcos de campos capilares fluorescentes registró en el software. Identificar los vasos Gyrose y utilizar la función de "TorqIx" del software. Trazar el flujo recipiente definitivo con el curso y terminar con un clic derecho. El software lo harádibujar una línea recta por el camino directo y pondrá en relación con el camino trazado.
NOTA: Tenga cuidado con los signos de la angiogénesis tales como yemas, brotes y capilares recién formados, que por lo general emanan perpendicularmente desde los capilares preexistentes. Medir la densidad de estos vasos recién formados como se describe en el paso 3.5.
- Cargar vídeos grabados-bisbenzimide (objetivo 50X) en el software. Utilice la función "DenseNA". Marque las células apoptóticas de acuerdo con las características mencionadas, tales como la condensación nuclear, la fragmentación y la marginación con un clic izquierdo.
- Después de marcar todas las células característicos de todo el video, haga clic en "N / A" en el software, que contará de forma automática todas las células marcadas y se divide en toda la zona. El resultado será apoptóticacélulas / mm 2.
- Analizar la respuesta inflamatoria mediante el recuento del número de leucocitos de rodamina que se adhirieron al revestimiento endotelial de las vénulas post-capilares para un período de tiempo de ≥30 seg ("pegatinas") y los leucocitos se adhieren de forma intermitente marcado (<30 seg, "rodillos") . La adhesión de leucocitos venular se expresa como células por mm 2 de superficie endotelial.
- Evaluar l macromoleculareakage como un parámetro de la permeabilidad microvascular después de una inyección iv de un dextrano fluorescente. Densitométricamente determinar múltiples niveles de gris en el tejido directamente adyacente a la pared del vaso capilar (E1), así como en el plasma libre de células marginal del recipiente (E2). A continuación, calcular la extravasación macromolecular (E) como la relación de E1 / E2 31.
4. Cuidado Postoperatorio
- Volver al animal en una jaula separada para evitar la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener el decúbito esternal. Monitorear los animales todos los días para el sangrado, local y signos sistémicos de infección y la posición de la cámara.
- Evaluar el estado general del animal mediante la observación de la actividad motora, el peso corporal, signos de dolor, la tolerancia al apósito y auto-mutilación.
- Mantener los ratones uno por jaula para evitar Mutual manipulación de la cámara. En cualquier señal de dolor, aplique buprenorfina a una dosis de 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea en intervalos de 8 h.
5. La eutanasia y Explantación de la Cámara de los pliegues cutáneos
- En el día 10, sacrificar los animales utilizando una sobredosis de un fármaco anestésico (150 mg / kg de pentobarbital).
- Retire la cámara y muestra el tejido colgajo para ensayos de proteínas inmunohistoquímicos y moleculares. Tejidos de muestra para histología convencional (formol) y ensayos de proteínas cuantificables (nitrógeno líquido o hielo seco).
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Representative Results
Necrosis
El objetivo principal de este modelo - necrosis de tejidos después de la elevación del colgajo (es decir, la inducción de la isquemia aguda persistente) - se mide y se ilustra macroscópicamente como se muestra en la Figura 3 durante un período de 10 días repetidamente. Demarcación final de necrosis del colgajo ocurre generalmente entre 5 y 7 días después de la cirugía y se caracteriza por una franja roja, es decir, la zona de la vasodilatación y la remodelación microvascular, que se desarrolla entre la fundamental proximal y la zona necrótica distal de la aleta (Fig. 3D-F ). Los ratones de control no tratados suelen desarrollar un área necrótica de alrededor del 50% después de 10 días que se pueden dividir en tres áreas distintas: la proximales bien perfundido, la zona central intercalado y perfundido crítica y de la zona distal necrótico (Figura 3F.). Estudios anteriores de nuestro grupo, como se mencionó en la introducción, han mostrado protectora efectos después de diferentes procedimientos de preacondicionamiento, que se caracterizan por un desplazamiento de la zona de perfundido críticamente desde la zona central hacia la zona distal de la aleta.
Parámetros de Buques
Diámetros microvascular y de glóbulos rojos (RBC) -velocity de las arteriolas y vénulas de varios diámetros, así como de los capilares vecinos se miden y el flujo de sangre volumétrica resultante se calculan fuera de línea. Esto permite correlacionar los cambios tanto morfológicas y funcionales de los microvasos distintas desde el día 1 hasta el día 10 (Fig. 4A-B). Además, la densidad funcional de los capilares perfundidos-RBC, el parámetro para la perfusión del tejido nutritivo, se analiza. Los capilares están orientados generalmente en paralelo y presente con diámetros entre 3-5 micras bajo condiciones fisiológicas (Fig. 4C). El flujo de sangre, la densidad capilar funcional y, finalmente, la tensión de oxígeno del TISSUe disminuir gradualmente desde proximal a distal para llegar a un umbral "de la viabilidad" (Fig. 4C-E), donde los capilares no son perfundidos más (Fig. 4E).
Remodelación microvascular y la angiogénesis
Remodelación con dilatación y aumento de la tortuosidad de los microvasos puede ser observado en todos los grupos experimentales sometidos a la preparación aleta (es decir, la inducción de la isquemia aguda persistente: Fig. 4F). Sin embargo, en este modelo, el estímulo isquémico por sí sola no es suficiente para inducir la angiogénesis como, por ejemplo visto en una variedad de experimentos de preacondicionamiento con la hormona eritropoyetina (Fig. 4G-H). Las nuevas redes microvasculares funcional que por lo general se desarrollan a partir de yemas y brotes microvasculares que emanan perpendicularmente desde la preexistente en paralelo dispuestas capilares son de primera visibles entre el día 3 y 5.
La respuesta inflamatoria (interacción leucocito-endotelio y la apoptosis)
Isquemia persistente aguda generalmente induce una considerable respuesta inflamatoria en los animales no tratados que se representa mediante la adhesión de leucocitos al endotelio microvascular. Esta respuesta inflamatoria se caracteriza por la rodadura (es decir, la adhesión intermitente de los leucocitos al endotelio vascular) y pegarse (es decir, la adhesión firme de los leucocitos al endotelio vascular) los leucocitos (Fig. 5A-B). Además, un aumento de la isquemia inducida de células apoptóticas se puede ver en todos los animales de control con los signos característicos de la condensación nuclear, la fragmentación y marginación (Fig. 5C-D). Ambos, la interacción leucocito-endotelio y la apoptosis son las señales para la respuesta inflamatoria inducida por isquemia y aumentan gradualmente con la disfunción microvascular progresivo y disminución de la tensión de oxígeno del tejido (es decir, (Fig. 5A-D)).
Figura 1. Ilustración de la trama de cámara de titanio y todas sus piezas de trabajo. (A) desensamblado marco que consta de dos partes de bastidor, tres tornillos, tuercas, cinco de una pieza de espuma, una cubierta de vidrio y un anillo de retención. (B) las herramientas necesarias para montar el bastidor que incluye una llave de tuercas hexagonal, una pinza para seguros y un cortador de alambre. Un destornillador no se requiere pero se recomienda si las cámaras se utilizarán varias veces. (C) Montado partes de una cámara. Izquierda: El lado trasero del bastidor con dos tornillos y tuercas adjunta en los dos orificios inferiores. El lado trasero se utiliza para suturar el marco sobre la piel y lleva el colgajo. Derecha: parte frontal de ensambladoel marco con espuma adjunta para garantizar la estanqueidad. Tenga en cuenta que los tres agujeros de los tornillos se mantienen libres de la espuma. Asegúrese de que ninguno de la espuma será presionado en la ventana de observación, que lleva la cubierta de vidrio. (D) Esquema montado marco cámara sin pliegue cutáneo dorsal.
Figura 2. Ilustración del procedimiento de colgajo quirúrgico y su aplicación en la cámara del pliegue cutáneo dorsal de titanio del ratón. (A) elevada trans iluminado-doble pliegue cutáneo dorsal del ratón para visualizar la arquitectura vascular para delinear la posición de la cámara del pliegue cutáneo dorsal. (B) La parte trasera del marco de titanio de la cámara ha sido posicionado y alineado con los vasos. La incisión de dos agujeros para tornillos para fijar la parte delantera del bastidor has han hecho. (C y D) Esquema de la solapa en la piel dorsal lateralmente: La proporción entre anchura y longitud es de 15 mm a 11 mm, mientras que la centralización de los dos buques perpendicularmente surjan. Una distancia de 2 mm en el lado contralateral (zona sin marcar entre contorno delgado colgajo y borde grueso) se utiliza para captar la piel con unas pinzas para elevar el colgajo. Para la observación de la parte trasera de la piel a través de la ventana de la cámara, el tejido adicional tiene que ser eliminado (área sombreada). (E) elevada basa lateralmente colgajo de piel, lo que demuestra la arquitectura vascular dispuestos aleatoriamente procedente de la base de la aleta. La zona sombreada se ha reducido, pero sigue conectado a la solapa y se retiró en el paso siguiente (colgando de la piel por debajo de las pinzas). (F) Montaje de la parte trasera del bastidor de la cámara. La superficie de la piel de la aleta está en la parte trasera y la superficie "en bruto" bajo el lado de la ventana de vidrio. Los tornillos chamber`s están atrapados through los agujeros en ambos lados de la incisión del pliegue cutáneo dorsal. (G) La piel que rodea, anterior y posteriormente, de la aleta se fija en los orificios de la llanta cámara superior. (H) El colgajo de piel se estira hacia fuera y también se sutura a la parte posterior del marco. Para evitar la deshidratación de la aleta, solución de cloruro sódico al 0,9% se goteó sobre la solapa repetidamente. (I) El colgajo y la piel que lo rodea es completamente fijo en los agujeros de la llanta cámara superior. El colgajo se sutura lateralmente en la piel dorsal adyacente para garantizar la estanqueidad de la cámara. (J) Montaje de la contraparte de espuma de cojinete del marco, que rodea la ventana de observación. Cámara (K) montado completamente: Una cubierta de cristal se une a las ventanas de observación y sellado con un anillo de retención. Un tercer tornillo se fija a la parte superior del marco de estanqueidad adicional. La ventana de la cámara permite que los análisis repetidos de la microvasculature de la aleta por microscopía intravital. Para un acceso más fácil durante la microscopía se acortan los tres tornillos. (L) de ratón despierto y en movimiento con la cámara del pliegue cutáneo dorsal montado.
Figura 3. Presentación del desarrollo morfológico y demarcación de la necrosis del colgajo al día 0 (inmediatamente después de la preparación del colgajo, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) y 10 (F) . necrótico demarcación final se lleva a cabo entre los días 5 y 7 (D y E). Controles muestran una zona distinta de demarcación dentro de la zona central de la aleta, incluyendo una franja roja y una hoz blanco (punta de flecha doble y asterisco en E), lo que refleja una respuesta hiperémica y remodelación microvascular, así como un tejido no perfundido pero potencialmente viable área delinear el desarrollo de necrosis distal (E). En el panel F, el colgajoel tejido se divide en tres áreas distintas por 2 líneas horizontales: la zona proximal bien perfundido (en la base de la imagen), la zona central críticamente perfundido (incluyendo la franja roja un blanco "hoz lunatica" correspondiente a la penumbra isquémica en el cerebro tejido después de la lesión accidente cerebrovascular) y la zona distal necrótico (circunferencialmente marcada por la frontera roja). Aumentos 16X.
Figura 4. intravital epi-microscopía de fluorescencia se presentan imágenes de arteriovenular (AV) Los bloques (A, B), campos de capilares (C, D, E) y los cambios morfológicos tales como la remodelación (F) y la angiogénesis (G, H). Microscopía intravital que muestra la misma AV-haz en un animal de control (A, B) en el día 1 (A) y 10 (B). Obsérvese la ausencia de la respuesta dilatoria en los controles durante todo el período de observación tanto en arteriolar (a) y venular (v) de diámetro. Imágenes C, D y E demuestran dispuestos paralelamente capilares en la zona de buena perfusión proximal (C), la zona de transición central críticamente perfundido (D) y la zona no perfundida necrótico distal (E) de la solapa de tejido isquémico. En los ratones perfundidos críticamente de la zona central de control sólo muestran la remodelación vascular (F), que se caracteriza por en paralelo dispuestas capilares con dilatación y tortuosidad aumentado. En contraste, los ratones que recibieron eritropoyetina antes de la elevación del colgajo como un régimen de preacondicionamiento muestran recién formadas y que surge de forma perpendicular capilares, que son claramente distinguibles de los capilares preexistentes normales (G, H). Esta respuesta angiogénica no se ha observado en los controles. Contraste mejora con dextrano fluorescente 150.000. Aumentos 80X.
Figura 5. </ Strong> intravital epi-fluorescencia microscopía mostrando AV-paquetes en la zona de buena perfusión proximal solapa (A) y la zona central isquémica perfundido críticamente transición del tejido (B). Tenga en cuenta el aumento de la presencia de la adhesión de leucocitos (flechas) en vénulas postcapilares (v) y arteriolas (a) dentro de la zona de la aleta isquémica (B) cuando se compara la zona proximal sana (A). Contraste mejora con rodamina. Aumentos 80X. Intravital microscopía de epi-fluorescencia se presentan condensación nuclear que indica la muerte apoptótica de células dentro de la proximal (C) y el área central de la aleta perfundido críticamente (D) de los controles. Se observa un aumento del número de células apoptóticas (flechas blancas) dentro de la zona de transición central más isquémico (D) en comparación con la zona proximal (C). Contraste mejora con bisbenzimide. Ampliación 250X.
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Discussion
Con el fin de disminuir las complicaciones isquémicas y así mejorar el resultado clínico, se requiere un conocimiento más detallado de los procesos fisiopatológicos en el tejido perfundido aleta críticamente. El desarrollo de nuevos modelos animales que imitan la isquemia aguda persistente tanto, es obligatorio. En consecuencia, hemos sido capaces de desarrollar un modelo fácilmente reproducible y fiable que permite repetitivo evaluación morfológica, dinámica y funcional en tiempo real de varios parámetros de músculo y la vasculatura de la piel que se puede correlacionar con el análisis inmunohistoquímico y molecular de la solapa de tejido muestreado.
El procedimiento quirúrgico no requiere habilidades quirúrgicas específicas, aunque es necesaria la práctica y cierta destreza manual. Una curva de aprendizaje de unos 25-30 animales operados normalmente es necesario dominar el montaje de la cámara de pliegue cutáneo dorsal y preparación aleta correctamente. En manos experimentadas, el tiempo para obtener los promedios de cirugía 35 minutos. Crucialpasos de la preparación colgajo incluyen la colocación correcta y el esquema de la solapa en el centro de la ventana de la cámara con la colocación exacta de los vasos principales a ser seccionado (usando trans-iluminación) y la eliminación meticulosa de la capa gelatinosa sobre el panículo carnoso usando la imagen a ampliación para mejorar la calidad de la imagen.
Desde las dimensiones de la aleta se dan en milímetros, se recomienda utilizar un pie de rey para marcar aleta correcta. Si hay alguna dificultad, mientras que el posicionamiento de los buques dominantes dispuestos horizontalmente dentro de la ventana de la cámara, se debe más bien elegir una más distal de una posición más proximal de los vasos. El posicionamiento correcto de estos vasos que atraviesan la ventana de la cámara, garantiza la transección de éstos, mientras que la elevación de la solapa de distal a proximal y resultados en una solapa perfundido al azar. En otras palabras, insuficiencia seccionar estos vasos mayores darán como resultado una perfusión axialpatrón sin necrosis del tejido debajo de la ventana. El paso crucial final durante la preparación quirúrgica se refiere a la eliminación de la capa de tejido areolar gelatinoso. La experiencia ha demostrado que los daños excesivos de eliminación de la panículo carnoso subyacente y así la delicada dispuestos horizontalmente capilares musculares. Por el contrario, los resultados de eliminación de conservadores en el edema-formación y la visibilidad con el tiempo limitado de las regiones de interés durante la microscopía. Si todos estos pasos se dominan con cuidado, la solapa se desarrolla muy constantemente aproximadamente el 50% de necrosis 10 días después de la elevación del colgajo. Esto permite el estudio de las diversas estrategias terapéuticas que pueden mejorar o empeorar la supervivencia del tejido colgajo. Finalmente, el método de microscopía de fluorescencia intravital es un procedimiento bien establecido para evaluar la perfusión tisular microvascular y se puede aprender muy rápidamente.
El mayor inconveniente de este modelo es el tiempo de observación limitada del tejido dentro de la cámara217; s ventana de aproximadamente 10 a 14 días después de la preparación del colgajo. Esto es debido a la relajación progresiva de la piel proximal a la cámara de pliegue cutáneo dorsal que finalmente resulta en la inclinación lateral de la cámara. En raras ocasiones, la, piel fija sándwich como se saca del marco de la cámara y hace imposible la microscopía. Desde la necrosis es más a menudo totalmente demarcada entre el día 5 y 7 después de la cirugía, esto realmente no compromete la adquisición de datos antes de la inclinación de la cámara o tirando de la piel dentro de la cámara.
Ventajas del modelo incluyen fácil reproducibilidad y el uso potencial de animales modificados genéticamente. El tamaño relativamente pequeño de la ventana que se puede evaluar sin embargo pudiera comprometer el significado en la traducción de los resultados en las condiciones humanas. Además, hay diferencias anatómicas entre animales y seres humanos de piel sueltas. Mientras que los animales y las herramientas quirúrgicas tienen una relación coste-eficacia razonable, la harD- y software necesario para llevar a cabo la microscopía (microscopio de epi-iluminación, cámara de alta resolución, tintes fluorescentes y un software especial para el análisis de datos fuera de línea) representa una inversión más grande.
Conclusión:
Se presenta un modelo animal el tiempo y coste-efectiva en ratones que permite la visualización y cuantificación de los parámetros de la microcirculación a alta resolución. Este enfoque representa un método ideal para analizar críticamente tejido perfundido colgajo musculocutáneo y los mecanismos celulares subyacentes. Los cambios morfológicos de las regiones de interés pueden ser investigados y correlacionados con los cambios funcionales en un microvascular y nivel celular en repetidas ocasiones. Después de intravital microscopía de epi-fluorescencia, el tejido puede procesarse adicionalmente usando histológico y enfoques moleculares.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Katharina Haberland para la edición de imágenes. Financiación: El autor principal, recibió una subvención de KKF la Technische Universität München, para establecer un nuevo laboratorio de investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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