Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

إصابة الأنسجة الدماغية في دائرة ثنية الجلد الظهري للماوس: A الجلد رفرف نموذج المعنية بالتحقيق في نقص التروية الحاد الثابتة

doi: 10.3791/51900 Published: November 17, 2014

Summary

نافذة غرفة الفئران الظهرية ثنية الجلد قدمت يتصور منطقة نقص التروية الحاد المستمر لرفرف العضلي الجلدي. حيوي داخلي برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري تصاريح للتقييم المباشر والمتكرر من الأوعية الدموية الدقيقة والقياس الكمي للديناميكا الدم. المورفولوجي ونتائج الدورة الدموية يمكن زيادة المترابطة مع التحليلات النسيجية والجزيئية.

Abstract

على الرغم من الخبرة العميقة والتقنيات الجراحية المتقدمة، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى نخر الأنسجة واسعة لا تزال تحدث، وخاصة في الجراحة الترميمية رفرف. وقد تم تطوير نماذج تجريبية متعددة رفرف لتحليل الأسباب والآليات الكامنة والتحقيق في استراتيجيات العلاج لمنع المضاعفات الدماغية. العامل المحدد لمعظم النماذج هو إمكانية تفتقر إلى تصور بشكل مباشر ومتكرر العمارة الاوعية الدموية الدقيقة وديناميكا الدم. كان الهدف من هذا البروتوكول إلى تقديم نموذج الفأر راسخة الانتماء هذه العناصر تفتقر المذكورة آنفا. أصعب آخرون طوروا نموذجا لرفرف العضلي الجلدي مع نمط نضح العشوائية التي يخضع نقص التروية الحاد والمستمر في النتائج ~ 50٪ نخر بعد 10 يوما إذا أبقى دون علاج. بمساعدة حيوي داخلي المجهري مضان برنامج التحصين الموسع، وهذا النموذج يسمح غرفة التصور المتكرر للمورفولوجيا وديناميكا الدم في مناطق مختلفة من الفائدة مع مرور الوقت. العمليات المرتبطة بها مثل موت الخلايا المبرمج، والتهاب، وتسرب الاوعية الدموية الدقيقة والأوعية الدموية يمكن التحقيق فيها وربطها المقايسات المناعية والجزيئية البروتين. حتى الآن، أثبتت جدوى واستنساخ النموذج في العديد من الدراسات التجريبية التي نشرت التحقيق أثر مسبقا، peri- وpostconditioning من الأنسجة تحدى ischemically.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تغطية تتعرض المواد الوتر والعظام وزرع في جراحة تعتمد على استخدام اللوحات. ورفرف هو كتلة من الأنسجة التي يتم نقلها على عنيق الأوعية الدموية التي تضمن التدفق الشرياني والوريدي تدفق. على الرغم من خبرة واسعة وتوفر مجموعة متنوعة من اللوحات على أن يتم تحويلها، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى إجمالي خسارة الأنسجة لا تزال اجهتها. في حين أن العلاج المحافظ والتئام بالمقصد الثانوية يمكن أن يتوقع بعد نخر الأنسجة طفيفة، نخر رفرف كبير وعادة ما يتطلب مراجعة العمليات الجراحية، بما في ذلك التنضير، تكييف الجرح وإعادة الإعمار الثانوي. هذا يزيد الاعتلال، يطيل الإقامة في المستشفى، وبالتالي يؤدي إلى زيادة تكاليف الرعاية الصحية.

اللوحات مع نمط غير معروف من الأوعية الدموية أو المناطق perfused لعشوائيا في المنطقة البعيدة النائية من تدفق الشرايين معرضة بشكل خاص لأضرار الدماغية. عكا rdingly، وتقييم العديد من الدراسات التجريبية والسريرية تطوير نخر في كل من، اللوحات النمط المحوري (إمدادات الدم محددة) واللوحات نمط عشوائي (إمدادات الدم غير معروف) 1-3. تستند النتائج الرئيسية عادة على تقييم العيانية للحجم المنطقة الميتة. من أجل تقييم أسباب وآليات نخر الأنسجة أكثر في التفاصيل، ركزت العديد من الدراسات على تحليل دوران الأوعية الدقيقة. وقد استخدمت أساليب مختلفة لقياس نضح الأنسجة، بما في ذلك تحليل للتوتر الأوكسجين الأنسجة باستخدام أقطاب البولاروجرافي 4-5، فضلا عن قياس تدفق الدم باستخدام الليزر دوبلر flowmetry 6-7، صبغة نشر والمجهرية 9-10. هذه التقنيات، ومع ذلك، تسمح فقط لقياس المعلمات غير المباشرة للنضح الأنسجة ولا يمكن لأي التحليل الصرفي للعمليات microhemodynamic داخل منطقة الفردية للمصلحة رفرف.

ر "> Sandison هو معروف أن تكون أول شخص يستخدم غرفة شفافة لفترات طويلة في الدراسات المجراة، الذي كان يقوم به في الأرانب 11 في عام 1943 - وبعد ما يقرب من 20 عاما - كان Algire أول من التكيف مع مثل غرفة شفافة قابلة للتطبيق في الفئران بهدف دراسة سلوك يزرع الصغيرة من الخلايا السرطانية (12). ونظرا لحقيقة أن الفئران هي ما يسمى الحيوانات الجلد فضفاضة وبعد بعض التحسينات الفنية على مدى السنوات التالية، كانت لير وزملاء العمل قادرا على التكيف مع مثل على ظهري ثنية الجلد غرفة تطوير غرفة أصغر وأخف وزنا التيتانيوم. مكنت هذه الغرفة تقييم باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي، وهي تقنية تسمح التصور المباشر والمتكرر لعدد من السمات المورفولوجية والأوعية الدقيقة والتغيرات على مر الزمن تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، مثل كما ضخه إصابة نقص التروية-13.

في التحقيق في بيrfusion من الجلد والعضلات والعظام اللوحات تحت الظروف العادية والمرضية وقعت اتجاهين: أولا، "الحادة" نماذج رفرف التي لا تستخدم غرفة الظهرية ثنية الجلد مثل صيوان الأذن pedicled في الماوس 14، ومقرها أفقيا رفرف الجلد جزيرة في الهامستر 15 ورفرف مركب pedicled في الفئران (16). ثانيا، "المزمن" نموذج رفرف فيها مزيج من رفرف مع تصاريح غرفة الظهرية ثنية الجلد الأوعية الدقيقة المتكررة يحلل مدى عدة أيام مع حيوي داخلي المجهري مضان. وهو يتألف من رفرف العضلي الجلدي perfused لعشوائيا التي تتكامل في غرفة ثنية الجلد من الفأرة 17. اختير لها نسبة العرض إلى الطول الذي وضع من نقص التروية الحاد المستمر يؤدي باستمرار في ~ 50٪ نخر الأنسجة رفرف بعد 10 إلى 14 يوما رفرف الارتفاع. هذا الحد استنساخه من نخر الأنسجة يسمح مزيد من التقييم على حد سواء، واقية (أي تطوير ليهS نخر) والعوامل الضارة (أي تطوير المزيد من نخر) على الفيزيولوجيا المرضية رفرف. خلال السنوات الأخيرة، عدة منشورات التجريبية مما يدل على أثر مسبقا مختلفة، peri- والإجراءات اللاحقة للتكييف، بما في ذلك إدارة المواد الأنسجة الواقية 18-24 وتطبيق محلي من الإجهاد الفسيولوجية مثل الحرارة 25 و 26 صدمة، ظهرت.

التحليلات الكمية للنخر، الاوعية الدموية الدقيقة التشكل والمعلمات الدقيق microcirculatory يمكن زيادة ربطها التحاليل المناعية وفحوصات البروتين. البروتينات والجزيئات المختلفة بما في ذلك عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، synthases أكسيد النيتريك (NOS)، العامل النووي كابا B (NF كيلوبايت) وبروتينات الصدمة الحرارية (HSP-32: الهيم أوكسيجيناز-1 (HO-1) وHSP- 70) وقد ثبت أن تلعب دورا في حماية الأنسجة. على أساس هذا النموذج الغرفة رفرف تم وضع تعديلين في أورديr لتحليل اتساع الأوعية الدموية ودوران الأوعية الدقيقة الجلد الكسب غير المشروع خلال 27 الشفاء وعائية التطورات في رفرف pedicled مع نمط محوري الارواء 28. نقدم نموذجا استنساخه وموثوق بها يتضمن رفرف العضلي الجلدي تحدى ischemically في غرفة الماوس ثنية الجلد. هذا النموذج يسمح التصور النوعي والكمي لدوران الأوعية الدقيقة وديناميكا الدم بواسطة برنامج التحصين الموسع حيوي داخلي المجهري مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: قبل تنفيذ النموذج المقدم، وقوانين حماية الحيوان المقابلة يجب أن يستشار، ويجب الحصول على إذن من السلطات المحلية. في هذا العمل، وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث التي تنطوي على الحيوانات والتشريع الألماني على حماية الحيوانات. تمت الموافقة التجارب من قبل لجنة رعاية الحيوان المحلية.

1. إعداد الحيوانية والارتفاع الجراحي للرفرف

  1. تبقى الحيوانات في أقفاص واحدة في درجة حرارة الغرفة من 22-24 درجة مئوية، وعلى الرطوبة النسبية من 60-65٪ مع حلقة اليوم والليل لمدة 12 ساعة. السماح الفئران حرية الوصول إلى مياه الشرب وطعام المختبر القياسية. دائما الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة.
  2. تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن 0.1 مل من محلول ملحي في 10 غرام من وزن الجسم تحتوي على 90 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين هيدروكلوريد و 25 ملغ /كغم من وزن الجسم هيدروكلوريد dihydroxylidinothiazine. التخدير هو ضروري لإعداد الحيوان والجراحة والفحص المجهري لاحق. تأكيد التخدير السليم عن طريق فحص ردا على بالألم. خلال فترة التخدير، وتطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف.
  3. بعد التخدير الكافي، يزيل الشعر من الخلف مع ماكينة حلاقة كهربائية. الآخرة، وتطبيق كريم إزالة الشعر من منطقة حلق لإزالة الشعر المتبقي.
  4. خلال فترة إقامته من كريم إزالة الشعر من ~ 7-10 دقائق، وإعداد الأدوات، بما في ذلك الجلد وملقط ملقط الصغيرة، مقص والمقص الصغير، مواد خياطة الجروح والقلم علامة. تطهير وإعداد غرفة التيتانيوم من خلال تطبيق المسمارين مع الجوز في قاعدة الغرفة وتحديد ذاتية اللصق رغوة (الشكل 1 AC) حول نافذة من نظيره الغرفة لضمان ضيق من نظام الغرفة.
  5. إزالة جميع كريم إزالة الشعر من الخلف من قبل الغسلتشغيله مع الماء الفاتر. ثم الجافة وتطهير الجلد مع محلول التي تحتوي على الكحول.
  6. ضع الماوس في موقف المعرضة وتحديد خط الوسط من الخلف. فهم الجلد مركزيا ورفعه إلى إنشاء حظيرة (الشكل 2A). بواسطة العابرة للإضاءة باستخدام أي نوع من مصدر الضوء، وتقرر أين تضع provisorily إطار التيتانيوم (الشكل 2B). تأكد من أن الفروع البعيدة للشريان الصدري الجانبي (LTA) cranially والشريان المنعطف الحرقفي العميق (DCIA) نحو caudally بالطبع من خلال مركز نافذة الغرفة (الشكل 2B-D). وبمجرد الانتهاء من تحديد المواقع للغرفة، خرم كل من طبقات من الجلد في أسفل جدا من حظيرة للتثبيت في وقت لاحق من الإطار التيتانيوم. الآن إزالة التيتانيوم الإطار، ضع الماوس في موقف المعرضة وإعادة تعريف خط الوسط من الظهر إذا لزم الأمر.
  7. الخطوط العريضة رفرف عمودي على العمود الفقري بدءا من خط الوسط مع نسبة عرض إلى طول 15 × 11 ملم الى يؤدي إلى رفرف أساس أفقيا وperfused لعشوائيا. ثم تحدد مساحة إضافية من 2 ملم تمتد إلى الجانب المقابل الجلد (الشكل 2C، D). يتم اختيار هذا المجال مع ملقط وخياطة في وقت لاحق إلى الإطار التيتانيوم دون التدخل في المنطقة رفرف مرئية.
  8. بعد وضع العلامات النهائية، شق رفرف. في القيام بذلك، القطع كل من الجمعية اللبنانية لتعزيز وDCIA ورفع رفرف (الشكل 2E). ليست هناك حاجة للتخثر أو ربط الأوعية مقطوع.
  9. وضع المسمار الغرفة من خلال ثقوب الجلد بها سابقا (الشكل 2F) ويحملق في ثنية الجلد على حد سواء الأمامية والخلف داخل إطار الغرفة من رفرف مرتفع إلى الجزء الخلفي من الإطار باستخدام الثقوب الإطار الغرفة و5-0 خيوط متقطعة (الشكل 2G).
  10. خياطة أطرافه العمودي للرفرف الخلفي على الجلد المحيطة عن طريق الغرز 5-0 توقف (
  11. استئصال منطقة HEMI-دائري من الجلد الوحشي لقطاع صغير من الجلد 2 ملم، أي على الجانب الآخر من رفرف لمراقبة الأوعية الدموية في صيوان. وهذا يسمح عرض مباشر من خلال نافذة مراقبة الغرفة التي تحتوي على سطح 90 مم 2.
  12. إزالة الأنسجة الهالي فضفاضة تشبه الجيلاتين من العضلات المخططة باستخدام أدوات المجهرية والعدسة المكبرة أو المجهر الضوئي من أجل تحسين جودة الصورة من خلال المجهر. حاول أن لا تتلف الأوعية داخل طبقات الأنسجة العضلية.
  13. أخيرا، ختم الغرفة من خلال تركيب نظيره من الإطار الذي سبق موهوب مع الذات التمسك شرائط من الرغوة الأمامية، cranially والخلف، أندى رفرف مع bisbenzimide موضعي والمالحة (الشكل 2J). بعد ذلك، وتطبيق النافذة الملاحظة مع غطاء زجاجي باستخدام حلقة مبكرة. ليس محاولة للإيقاع أي بثور الهواء تحت الزجاج (الشكل 2K، L). سوف الجلد التمسك الزجاج غطاء من قبل قوات التصاق.

2. حيوي داخلي المجهري epifluorescence

  1. انتظر 24 ساعة بعد الجراحة لإعداد أول تحليل مجهري للجودة بصرية مثالية. ويمثل هذا التحليل الأساس من المجهري ويتكرر في اليوم 3 و 5 و 7 و 10 بعد الجراحة. في كل مرة، تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.2. وضع الحيوان في موقف استلقائي الجانبي على حسب الطلب زجاجي الناقل. بهذه الطريقة، وطبقات الأنسجة العضلية للرفرف التمسك الزجاج غطاء تواجه ما يصل عنابر.
  2. حقن 0.05 مل من 5٪ ديكستران الأخضر مضان (150،000 الوزن الجزيئي) و 0.05 مل 1٪ الفلورسنت عالية رودامين الصبغة العائلية في الوريد الذيل أو الضفيرة الوريدية الرجعية الصلبية. وديكستران الفلورية الخضراء بقع المكونات غير الخلوية من الدم عن طريق الوريد إذا ما طبقت (رابعا). الفلورسنت رودامين البقع الكريات البيضاء والصفائح الدموية التي يمكن أن تكون حيinguished من المكونات الخلوية وغير الخلوية الأخرى. أخيرا، bisbenzimide البقع المكونات النووية التي تنبعث منها أكثر أو أقل مضان وفقا لحالة من التكثيف.
  3. بعد ذلك، ضع الماوس تحت المجهر. ضمان المجهر يشمل نظام LED - مجموعات شعاع LED ل470 & 425 نانومتر و 365 نانومتر و490 و540 و580 نانومتر فضلا عن مجموعات مرشح المقابلة (62 BFP سعادة / GFP / HcRed، مجموعة 1: 350-390 نانومتر الإثارة الطول الموجي، تقسيم 395 نانومتر / 402-448 نانومتر، مجموعة 2: 460-488 نانومتر، 495 نانومتر تقسيم / 500-557 نانومتر، مجموعة 3: 567-602 نانومتر، 610 نانومتر تقسيم / 615 نانومتر لانهائية 20 رودامين، النطاق. : 540-552 نانومتر، 560 نانومتر تقسيم، والانبعاثات 575-640 نانومتر).
  4. تسجيل اللقطات والصور المتحركة، باستخدام جهاز كاميرا الفيديو إلى جانب تهمة وحفظها على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر لمزيد من خارج خط التحليل.
  5. استخدام أهداف مختلفة (2.5X، NA (الفتحة العددية) = 0.06 لمشاهدة بانوراما للغرفة، 5X،NA = 0.16. 10X، NA = 0.32. 20X، NA = 0.50. 50X، NA = 0.55) لتسجيلات من المناطق المثيرة للاهتمام.
  6. عمليا، تقسم السطح رفرف أن يكون مرئيا من خلال نافذة الغرفة إلى ثلاث مناطق من ارتفاع متساو، أي الأقرب، مركزية، ومنطقة القاصي أبعد من تدفق الأوعية الدموية (الشكل 3F). لاقتناء الصورة، والمضي قدما على النحو التالي في كل نقطة زمنية الملاحظة:
    1. مسح الصورة الأنسجة حسب الصورة داخل نافذة الغرفة من الداني إلى القاصي باستخدام الهدف 5X.
    2. في كل مجال من مجالات رفرف، اختر الشرايين ثاني أو ثالث ترتيب والأوردة المصاحبة لها مع أنماط المتفرعة التي يسهل التعرف عليها. باستخدام الهدف 5X، 10X، أو 20X، وجعل النسخ المطبوعة من حزم شريني وريدي من أجل إعادة توطين بسهولة، وحزم طوال فترة الملاحظة كلها.
    3. مع الهدف 20X 50X والهدف، المزيد من 5-6 سجل المجالات الشعرية و"أفكارك"حقول في منطقة رفرف على التوالي. جميع الصور المسجلة مع 10X 20X وأهداف استخدام الضوء الأزرق (ديكستران الفلورسنت) والضوء الأخضر (رودامين) مرشح، في حين أن الصور المسجلة مع 5X 50X واستخدام موضوعي الضوء الأزرق (ديكستران الفلورسنت) والضوء الأبيض (Bisbenzimide) مرشح على التوالي .

3. تحليل البيانات المسجلة

ملاحظة: مع استخدام صورة نظام التحليل بمساعدة الحاسوب الكمي جميع المعلمات سجلت خارج الخط على النحو التالي 29.

  1. قياس مجال غير perfused ل، الأنسجة الميتة على التوالي (2 ملم).
    1. استخدام غرفة كاملة الصورة الممسوحة ضوئيا نافذة سجلت بهدف 5X (من 2.6.1) وديكستران الفلورسنت لقياس الأنسجة غير perfused لنخرية على التوالي. استخدام "AreaBo" وظيفة لقياس المجال غير perfused لالداكنة: الحدود في منطقة غير perfused لوحساب مساحة في مم 2 باستخدام خوارزميات قياس المساحة في البرنامج.
  2. قياس قطرها الاوعية الدموية الدقيقة في الشرايين، الأوردة والشعيرات الدموية (ميكرون).
    1. تحميل الفيديو أو الصور من تسجيلها AV-حزم أو مجالات الشعرية في البرنامج. للحصول على أفضل النتائج استخدام اللقطات أو الفيديو وفقا لأعلى التكبير فيها الحدود واضحة للسفينة هي واضحة للعيان.
    2. استخدام "DiamPe" وظيفة من البرنامج للتأكد من إجراء القياسات عمودي على جدار السفينة. للقيام بذلك بمناسبة نقطتين على جدار السفينة وبنقرة العلامة الثالثة القطر العمودي للسفينة. يقوم البرنامج بإجراء قياس في ميكرون.
    3. تكرار القياسات على نفس السفن لجميع التسجيلات في نفس المكان. قياس الشعيرات متعددة تتراكم متوسط ​​القطر.
  3. تحليل خلايا الدم الحمراء (RBC) سرعة في الشرايين، والشعيرات الدمويةالثانية الأوردة (ملم / ثانية).
    1. لتصلب خلايا الدم الحمراء (RBC) السرعة (مم / ث) القياسات استخدام "VeloLSD" وظيفة من البرنامج واختيار نفس السفن في نافذة ديكستران الفلورسنت التي تم قياسها في قطر.
    2. نحللها مع نظام تحليل الصور بمساعدة الحاسوب باستخدام طريقة القسط التحول، الذي هو على أساس قياس التحول (مم) من نمط مستوى رمادي داخل الأوعية الأفراد على مر الزمن (ثانية).
  4. قياس تدفق الدم في الأوعية الحجمي (PL / ثانية).
    1. حساب تدفق الدم الحجمي (PL / ثانية) في الشرايين، الأوردة والشعيرات الدموية من سرعة السفينة ومنطقة عبر قطاعات RBC (π * ص 2) وفقا لمعادلة غروس وAroesty، وهذا هو، Q = V * π * ص 2 ، على افتراض وعاء اسطواني الشكل 30.
  5. قياس الكثافة الشعرية وظيفية من الشعيرات الدموية RBC perfused ل(نضح المغذي: سم / سم
  6. تحميل الحقل الشعري الفلورسنت سجلت مع التكبير 20X موضوعي في البرنامج. استخدام وظيفة "DensLA" لقياس الكثافة الشعرية وظيفية من microvessels RBC perfused ل.
  7. تتبع الشعيرات الدموية مع perfused المؤشر وبمناسبة السفن perfused ل. لا يعلم غير perfused ل-الشعيرات الدموية، الشرايين أو الأوردة. يقوم البرنامج بقياس الكثافة الشعرية وظيفية من الشعيرات الدموية في perfused لسم / سم 2. كرر الخطوات للحقول الشعرية المسجلة الأخرى.
  • قياس تعرج من microvessels (إعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة)، مؤشرات مبكرة على الأوعية الدموية مثل برعم وبرعم، وتشكيل microvessels التي شكلت حديثا.
    1. سجلت تحميل أشرطة الفيديو أو إطارات من المجالات الشعرية الفلورسنت في البرنامج. تحديد السفن ذو حلقات واستخدام "TorqIx" وظيفة من البرنامج. تتبع تدفق السفن واضح مع المسار وينتهي فوق الحق. سوف يقوم البرنامجرسم خط مستقيم على الطريق مباشرة وسيتم تعيينها في العلاقة مع مسار تتبعها.
      ملاحظة: احترس من علامات الأوعية الدموية مثل براعم، براعم والشعيرات الدموية التي شكلت حديثا، والتي عادة ما تنطلق عموديا من الشعيرات الدموية الموجودة مسبقا. قياس كثافة هذه السفن التي شكلت حديثا كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  • تحديد خصائص لموت الخلايا أفكارك، مثل التكثيف النووي، تجزئة و / أو تهامش (خلية / ملم 2).
    1. تحميل أشرطة الفيديو المسجلة Bisbenzimide (الهدف 50X) في البرنامج. استخدام وظيفة "DenseNA". بمناسبة خلايا أفكارك وفقا للخصائص المذكورة مثل التكثيف النووي، التفتت وتهامش بنقرة الأيسر.
    2. بعد وضع العلامات المميزة جميع الخلايا في جميع أنحاء الفيديو، انقر فوق "N / A" في البرنامج، والتي سوف نعتمد تلقائيا كل خلايا تميز وتفرق في جميع أنحاء المنطقة. ستكون النتيجة أفكاركخلية / ملم 2.
  • تحليل الكريات البيض التمسك البطانة الوعائية تمثل الالتهاب. الالتزام المتقطع من الكريات البيضاء (الكريات البيض المتداول، تمسك <30 ثانية: عدد بكرات / مم 2 سطح البطانية) والالتزام الراسخ من كريات الدم البيضاء (الكريات البيض الشائكة، التزام> 30 ثانية: عدد ملصقات / مم 2 سطح البطانية).
    1. تحليل الاستجابة الالتهابية من خلال إحصاء عدد رودامين الكريات البيضاء التي انضمت إلى بطانة البطانية من الوريدات بعد الشعرية لفترة زمنية من ≥30 ثانية ("ملصقات") والكريات البيض الالتزام بشكل متقطع المسمى (<30 ثانية، "بكرات") . وأعرب Venular الكريات البيض كما تمسك خلايا لكل ملم 2 سطح البطانية.
  • قياس مستويات الرمادي داخل الأوعية الدموية والخلالي كمعلمة لتسرب الاوعية الدموية الدقيقة (الجزيئات تسرب E = E1 / E2).
    1. تقييم الجزيئات لeakage كمعلمة من نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة بعد حقن الرابع من ديكستران الفلورسنت. Densitometrically تحديد مستويات الرمادي متعددة في الأنسجة المجاورة مباشرة لجدار الوعاء الدموي الشعري (E1)، وكذلك في هامشي بلازما خالية من الخلايا السفينة (E2). ثم حساب تسرب الجزيئات (E)، ونسبة E1 / E2 31.
  • 4. بعد العملية الجراحية العناية

    1. العودة للحيوان في قفص منفصل لتجنب الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. مراقبة الحيوانات يوميا لنزيف والمحلية وعلامات الإصابة النظامية وموقف الغرفة.
    2. تقييم الحالة العامة للحيوان من خلال مراقبة النشاط الحركي، ووزن الجسم، وعلامات الألم والتسامح لخلع الملابس والسيارات والتشويه.
    3. إبقاء الفئران في قفص واحد لتجنب موتوآل التلاعب في الغرفة. في أي علامة على الألم، وتطبيق البوبرينورفين بجرعة 0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ من وزن الجسم، تحت الجلد في فترات 8 ساعة.

    5. القتل الرحيم وExplantation غرفة ثنية الجلد

    1. في يوم 10، تضحية الحيوانات باستخدام جرعة زائدة من دواء مخدر (150 ملغ / كغ بنتوباربيتال).
    2. إزالة الغرفة وأخذ عينات من الأنسجة رفرف لفحوصات البروتين المناعية والجزيئية. الأنسجة لعينة الأنسجة التقليدية (الفورمالين) وفحوصات قياس الكمي البروتين (النتروجين السائل أو الثلج الجاف).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    نخر

    نقطة النهاية الرئيسية لهذا النموذج - نخر الأنسجة بعد ارتفاع رفرف (أي تحريض نقص التروية الحاد المستمر) - يقاس مرارا ويتضح ظاهريا كما هو مبين في الشكل (3) على مدى 10 يوما. الترسيم النهائي للرفرف نخر يحدث عادة بين 5 و 7 أيام بعد الجراحة ويتميز هامش أحمر، أي منطقة من توسع الأوعية وإعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة، ووضع بين الداني حيوية والمنطقة الميتة البعيدة للرفرف (الشكل 3D-F ). السيطرة على الفئران غير المعالجة عادة ما تتطور منطقة نخرية نحو 50٪ بعد 10 يوما التي يمكن تقسيمها إلى ثلاث مناطق: الأقرب perfused لجيدا، المنطقة الوسطى مقحم وperfused لنقدي والمنطقة الميتة البعيدة (الشكل 3F). ، كما ذكر في المقدمة، وقد أظهرت الدراسات السابقة مجموعتنا البريد واقيةأثر بعض شروط مسبقة بعد إجراءات مختلفة، والتي تتميز التحول من منطقة خطيرة perfused لمن المنطقة الوسطى باتجاه المنطقة البعيدة للرفرف.

    المعلمات السفينة

    يتم قياس أقطار الاوعية الدموية الدقيقة وخلايا الدم الحمراء (RBC) -velocity في الشرايين والأوردة من مختلف الأقطار وكذلك من الشعيرات الدموية المجاورة ويتم احتساب الناتج من تدفق الدم الحجمي خارج الخط. هذا يتيح ربط التغيرات المورفولوجية والوظيفية على حد سواء من microvessels متميزة من يوم 1 إلى يوم 10 (الشكل 4A-B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن الكثافة الوظيفية من الشعيرات الدموية RBC perfused ل، المعلمة لنضح المغذية للأنسجة، ويتم تحليل. وعادة ما تكون موجهة الشعيرات الدموية في موازاة والحاضر بأقطار بين 3-5 ميكرون في ظل الظروف الفسيولوجية (الشكل 4C). تدفق الدم، والكثافة الشعرية الوظيفية وأخيرا توتر الأوكسجين من TISSUE خفض تدريجيا من الأقرب إلى البعيدة للوصول إلى عتبة "الجدوى" (الشكل 4C-E)، حيث لا و perfused الشعيرات الدموية بعد الآن (الشكل 4E).

    إعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة والأوعية الدموية

    إعادة عرض مع تمدد ويمكن ملاحظة زيادة تعرج من microvessels في كل المجموعات التجريبية تمر إعداد رفرف (أي تحريض نقص التروية الحاد المستمر: 4F الشكل). ومع ذلك، في هذا النموذج، والتحفيز الدماغية وحده لا يكفي للحث على الأوعية الدموية وعلى سبيل المثال رأينا في مجموعة متنوعة من التجارب شروط مسبقة مع هرمون الإريثروبويتين (الشكل 4G-H). شبكات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية جديدة من شأنها تطوير عادة من براعم وبراعم الاوعية الدموية الدقيقة المنبثقة عموديا من قبل القائمة في وبالتوازي ترتيب الشعيرات الدموية الأولى للعيان بين 3 و 5 أيام.

    استجابة التهابية (تفاعل الكريات البيض البطانية وموت الخلايا المبرمج)

    استمرار نقص التروية الحاد عادة ما يؤدي الى استجابة التهابية كبيرة في الحيوانات غير المعالجة التي تتمثل من خلال الالتزام الكريات البيض في البطانة الاوعية الدموية الدقيقة. وتتميز هذه الاستجابة الالتهابية من قبل المتداول (أي التصاق الكريات البيض متقطعة إلى البطانة الوعائية) والالتصاق (أي التصاق متين من الكريات البيض إلى البطانة الوعائية) الكريات البيض (الشكل 5A-B). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينظر إلى زيادة الناجم عن نقص التروية للخلايا أفكارك في جميع الحيوانات التحكم مع علامات مميزة من التكثيف النووي، التفتت وتهامش (الشكل 5C-D). كلا، الكريات البيض البطاني التفاعل وموت الخلايا المبرمج علامات للاستجابة الناجم عن نقص التروية التهابات وزيادة تدريجيا مع ضعف الاوعية الدموية الدقيقة التدريجي وانخفاض توتر الأوكسجين للأنسجة (أي (الشكل 5A-D)).

    الشكل 1
    الشكل 1. توضيحات من الإطار غرفة التيتانيوم وجميع القطع عملها. (A) إطار مفكك يتكون من جزأين الإطار، ثلاثة مسامير، خمسة والمكسرات، وقطعة واحدة من رغوة، والزجاج غطاء وحلقة مبكرة. (ب) الأدوات المطلوبة لتجميع إطار بينهم سائق عرافة الجوز، ذو طيات حلقة الخاطف وقطع الأسلاك. غير مطلوب مفك لكن إذا أوصى سيتم استخدام غرف عدة مرات. (ج) تجميع قطع من غرفة واحدة. اليسار: الجانب الخلفي من الإطار مع اثنين من البراغي والصواميل تعلق على أقل اثنين من الثقوب. ويستخدم الجانب الخلفي لخياطة إطار على الجلد وتحمل رفرف. الحق: تجميعها الجانب الأمامي للالإطار مع رغوة المرفقة لضمان ضيق. لاحظ أن جميع الثقوب المسمار ثلاث وتحفظ خالية من الرغوة. تأكد من أن أي من رغوة سيتم الضغط في إطار المراقبة التي تحمل غطاء زجاجي. (D) تخطيطي تجميعها إطار الغرفة دون الظهرية ثنية الجلد.

    الرقم 2
    الشكل 2. توضيحات من إجراء الجراحة رفرف وتنفيذها في ظهري التيتانيوم ثنية الجلد غرفة من الفأرة. (A) ارتقى عبر مضيئة تضاعف الظهرية ثنية الجلد من الفأرة لتصور بنية الأوعية الدموية لتحدد موقف الغرفة الظهرية ثنية الجلد. (ب) مساعدات من التيتانيوم الإطار الغرفة قد تم وضعه وتتماشى مع السفن. شق اثنين من الثقوب للمسامير إرفاق الجانب الأمامي من الإطار هكتاربذلت S. (C و D) مخطط تفصيلي للرفرف على الجلد ظهري أفقيا: نسبة العرض إلى الطول هو 15 ملم الى 11 ملم في حين مركزية السفينتين الناشئة عموديا. وسيتم استخدام 2 مم المسافة إلى الجانب المقابل (منطقة لا تحمل علامات مميزة بين الخطوط العريضة رفرف رقيقة وسميكة الحدود) لفهم الجلد مع ملقط لرفع رفرف. لمراقبة الجلد المؤخر من خلال نافذة الغرفة، والنسيج إضافية لابد من إزالتها (منطقة تحاك). (E) المرتفعة مقرها أفقيا رفرف الجلد، مما يدل على بنية الأوعية الدموية مرتبة بشكل عشوائي مصدره قاعدة رفرف. وقد تم خفض المساحة التي تحاك بها، ولكن لا تزال تعلق على رفرف وتتم إزالة في الخطوة التالية (شنقا الجلد تحت ملقط). (F) تصاعد الجانب الخلفي من الإطار الغرفة. سطح الجلد من اللوحه على مساعدات والسطح "الخام" تحت الجانب زجاج النافذة. عالقون مسامير chamber`s عبتيough الثقوب على جانبي ثنية الجلد الظهرية قطعي. (G) والجلد المحيطة، الأمامية والخلف، ورفرف هو ثابت في ثقوب غرفة الحافة العليا. ويمتد (H) رفرف الجلد خارجا وخياطة أيضا إلى الجانب الخلفي من الإطار. لتجنب الجفاف من رفرف، يتم تنقيط 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم على رفرف مرارا وتكرارا. (I) ورفرف والجلد المحيط بها وثابتة تماما في الثقوب من غرفة الحافة العليا. خياطة رفرف الخلفي أفقيا في الجلد الظهري المجاور لضمان ضيق الغرفة. (J) تصاعد النظير الحاملة للرغوة الإطار، تحيط نافذة المراقبة. (K) التي شنت تماما الغرفة: يتم إرفاق كوب غطاء للنوافذ المراقبة ومختومة مع عصابة مبكرة. ومرفق المسمار الثالث إلى الجزء العلوي من الإطار لضيق إضافي. نافذة في غرفة يسمح التحليلات المتكررة من microvasculatur(ه) من رفرف من قبل intravital المجهري. لتسهيل الوصول خلال المجهر وتقصير ثلاثة مسامير. (L) الماوس مستيقظا ويتحرك مع شنت غرفة الظهرية ثنية الجلد.

    الرقم 3
    الشكل 3. عرض لتطور المورفولوجية وترسيم نخر رفرف في أيام 0 (مباشرة بعد إعداد رفرف، A) (1)، (B)، 3 (C) و 5 (D) و 7 (E) و 10 (F) . يأخذ ترسيم نخرية النهائي في الفترة بين 5 و 7 أيام (D و E). وتبين الضوابط منطقة متميزة من ترسيم الحدود داخل منطقة رفرف المركزية، بما في ذلك هامش أحمر ومنجل الأبيض (رأس السهم المزدوج والنجمة في E)، مما يعكس استجابة متعلق بفرط الدم والاوعية الدموية الدقيقة، وكذلك إعادة عرض الأنسجة غير perfused لولكن يحتمل أن تكون قابلة للحياة ترسيم المنطقة نخر تطوير بشكل أقصى (E). F في لوحة، ورفرفوتنقسم الأنسجة في ثلاثة مجالات متميزة بنسبة 2 خطوط أفقية: المنطقة القريبة perfused لجيدا (على قاعدة من الصورة)، المنطقة الوسطى perfused لنقدي (بما في ذلك هامش الأحمر والأبيض "منجل lunatica" المقابلة لغبش في الدماغ الدماغية الأنسجة بعد الإصابة بجلطة) والمنطقة الميتة البعيدة (ملحوظ من قبل محيطي الحدود الحمراء). التكبير 16X.

    الرقم 4
    الرقم 4. حيوي داخلي برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري عرض الصور من arteriovenular (AV) حزم (A، B)، وحقول الشعرية (C، D، E) والتغيرات المورفولوجية مثل إعادة عرض (F) والأوعية الدموية (G، H). intravital المجهري تظهر نفس AV-ربطة في حيوان السيطرة (A، B) في يوم 1 (أ) و 10 (ب). لاحظ عدم وجود استجابة التعطيلية في الرقابة على مدى فترة الملاحظة كلها في كل arteriolع (أ) و venular (V) قطر. الصور C، D و E تبرهن ترتيب parallelly الشعيرات الدموية في منطقة perfused لبئر القريبة (C)، perfused لمنطقة انتقالية حرجة المركزية (D) والمنطقة غير perfused لالميتة البعيدة (E) من الأنسجة رفرف الدماغية. في الفئران perfused لمنطقة خطيرة وسط سيطرة تظهر فقط الأوعية الدموية إعادة عرض (F)، وتتميز بالتوازي ترتيب الشعيرات الدموية مع اتساع وزيادة تعرج. في المقابل، الفئران تلقي الإريثروبويتين قبل رفرف ارتفاع بمثابة نظام شروط مسبقة تظهر المشكلة حديثا والناشئة عموديا الشعيرات الدموية، والتي يمكن تمييزها بوضوح من الشعيرات الدموية الموجودة مسبقا العادية (G، H). لم يلاحظ هذا الرد عائية في الضوابط. تعزيز النقيض مع ديكستران الفلورسنت 150000. التكبير 80X.

    الرقم 5
    الرقم 5. </ قوي> حيوي داخلي برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري عرض AV-حزم في المنطقة القريبة جيدا perfused لرفرف (A) ونقص تروية منطقة انتقالية حرجة المركزية perfused لمن الأنسجة (B). لاحظ وجود زيادة الانضمام الكريات البيض (الأسهم) في الأوردة للشعيرات (ت) والشرايين (أ) داخل المنطقة رفرف الدماغية (ب) إذا ما قورنت المنطقة القريبة صحية (A). تعزيز النقيض مع رودامين. التكبير 80X. حيوي داخلي المجهري برنامج التحصين الموسع ومضان عرض التكثيف النووي مشيرا الموت أفكارك خلية داخل الداني (C) وperfused لمنطقة خطيرة رفرف المركزي (D) من ضوابط. لوحظ زيادة عدد الخلايا أفكارك (السهام البيضاء) ضمن أكثر الدماغية منطقة انتقالية المركزية (D) بالمقارنة مع المنطقة القريبة (C). تعزيز النقيض مع Bisbenzimide. التكبير 250X.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    من أجل تقليل المضاعفات الدماغية، وبالتالي تحسين النتائج السريرية، مطلوب معرفة أكثر تفصيلا من العمليات الفسيولوجية المرضية في الأنسجة perfused لرفرف خطيرة. تطوير النماذج الحيوانية الجديدة التي تحاكي نقص التروية الحاد المستمر هي بالتالي إلزامية. وفقا لذلك، تمكنا من تطوير نموذج استنساخه بسهولة وموثوق بها والسماح لتكرار الصرفي، ودينامية وظيفية تقييم في الوقت الحقيقي من المعلمات مختلفة من العضلات والأوعية الدموية في الجلد التي يمكن أن تكون مرتبطة مع التحليل المناعى والجزيئي للعينات الأنسجة رفرف.

    لا يتطلب أي إجراء العمليات الجراحية مهارات جراحية محددة، على الرغم من بعض الممارسات والبراعة اليدوية ضرورية. منحنى التعلم لحوالي 25-30 الحيوانات تعمل ضروري عادة لإتقان تركيب الغرفة الظهرية ثنية الجلد وإعداد رفرف صحيح. في أيدي ذوي الخبرة، والوقت المتوسط ​​لجراحة 35 دقيقة. حاسموتشمل خطوات إعداد رفرف على موضع الصحيح والخطوط العريضة للرفرف في وسط نافذة الغرفة مع تحديد المواقع بدقة من السفن الرئيسية التي يتعين مقطوع (باستخدام العابرة للإضاءة) وإزالة الدقيق للطبقة تشبه الجيلاتين فوق عضلية السبلة باستخدام صورة التكبير لتحسين جودة الصورة.

    منذ يتم إعطاء أبعاد رفرف في ملليمتر، ونحن نوصي باستخدام الفرجار انزلاق لرفرف الصحيح وسم. إذا كان هناك أي صعوبات أثناء تحديد المواقع الأوعية المهيمنة مرتبة أفقيا داخل نافذة الغرفة، واحدة ينبغي بالأحرى اختيار أكثر القاصي من الداني موقف أكثر من السفن. في الموضع الصحيح من هذه السفن التي عرضية نافذة الغرفة، ويضمن transection هذه في حين رفع رفرف من القاصي إلى الداني والنتائج في رفرف perfused لعشوائيا. وبعبارة أخرى، فإن عدم القطع فإن هذه السفن الكبرى يؤدي إلى نضح المحورينمط دون تنخر الأنسجة تحت النافذة. الخطوة الحاسمة النهائية خلال إعداد الجراحي تتعلق بإزالة طبقة الأنسجة الهالي تشبه الجيلاتين. وقد أظهرت التجربة أن إزالة الأضرار المفرطة في السبلة العضلية تحتاني وهكذا حساسة ترتيب أفقيا الشعيرات الدموية في العضلات. بالعكس، النتائج إزالة المحافظة في ذمة، وتشكيل الرؤية محدودة في نهاية المطاف من المناطق ذات الأهمية خلال المجهر. إذا أتقن كل هذه الخطوات مع الرعاية، ورفرف يتطور باستمرار جدا ما يقرب من 50٪ نخر 10 يوما بعد رفرف الارتفاع. وهذا يسمح بدراسة استراتيجيات العلاجية المختلفة التي قد تحسن أو تدهور بقاء الأنسجة رفرف. أخيرا، طريقة حيوي داخلي المجهري مضان هو إجراء راسخة لتقييم نضح الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة، ويمكن تعلمها بسرعة كبيرة.

    العيب الرئيسي لهذا النموذج هو الوقت الملاحظة محدود من الأنسجة داخل غرفة217؛ ق نافذة من حوالي 10 إلى 14 يوما بعد إعداد رفرف. ويرجع ذلك إلى تخفيف التدريجي من الأقرب إلى الجلد الظهرية ثنية الجلد الدائرة أن يؤدي في نهاية المطاف في إمالة جانبية من الغرفة هذا. نادرا ما، ومثل شطيرة، والجلد ثابتة تسحب خارج الإطار الغرفة ويجعل من المستحيل المجهري. منذ نخر غالبا ما يتم ترسيمها بشكل كامل بين يوم 5 و 7 بعد الجراحة، وهذا لا يضر حقا الحصول على البيانات قبل إمالة من الغرفة أو الانسحاب من الجلد داخل الغرفة.

    وتشمل مزايا هذا النموذج من السهل استنساخ والاستخدام المحتمل للحيوانات معدلة وراثيا. حجم صغير نسبيا من النافذة التي يمكن تقييمها إلا قد تضر أهمية في ترجمة النتائج في الأوضاع الإنسانية. بالإضافة إلى ذلك، هناك اختلافات تشريحية بين الحيوانات والبشر البشرة فضفاضة. بينما الحيوانات والأدوات الجراحية لها الفعالية من حيث التكلفة المعقولة، وهارد- والبرمجيات اللازمة لأداء المجهر (الميكروسكوب برنامج التحصين الموسع-الإضاءة، وكاميرا ذات دقة عالية، والأصباغ الفلورية وبرنامج خاص لتحليل البيانات خارج الخط) يمثل استثمارا أكبر.

    استنتاج:

    نقدم الوقت ونموذج حيواني فعالة من حيث التكلفة في الفئران التي تتيح تصور وتقدير من المعلمات الأوعية الدقيقة بدقة عالية. هذا النهج يمثل الأسلوب الأمثل لتحليل نقدي perfused لالعضلي الأنسجة رفرف والآليات الخلوية الأساسية. التغيرات المورفولوجية للمناطق ذات الاهتمام يمكن التحقيق مرارا وترتبط مع التغيرات الوظيفية على الاوعية الدموية الدقيقة، والمستوى الخلوي. بعد حيوي داخلي المجهري مضان برنامج التحصين الموسع، والأنسجة يمكن معالجتها باستخدام مزيد النسيجية والنهج الجزيئية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    نشكر كاتارينا Haberland لتحرير الصور. التمويل: تلقى الكاتب كبار KKF على منحة من جامعة ميونخ التقنية لانشاء مختبر أبحاث جديد.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g Charles River
    Depilation cream Balea Any depilation cream
    Titanium chamber Irola 160001 Halteblech M
    Custom-made Plexiglass mounting frame Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration.
    Slotted cheese head screw Screws and More 842210 DIN84 M2x10
    Hexagon full nut Screws and More 93422 DIN934 M2
    Snap ring Schaefer-Peters 472212 DIN472 J12x1,0
    Cover glass Volab Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter.
    Fixing foam tesamoll 05559-100 tesamoll Standard I-Profile
    Ketamine hydrochloride Parke Davis Ketavet®
    Dihydroxylidinothiazine hydrochloride Bayer Rompun®
    Buprenorphin Essex Pharma Temgesic®
    Saline 0.9%
    Desinfection alcohol
    Vicryl 5-0 Ethicon V 490 H
    Ethilon 5-0 Ethicon EH 7823 H
    1 ml syringes
    Surgical skin marker with flexible ruler Purple surgical PS3151 Any surgical skin marker and flexible ruler
    Pointed scissors
    Micro-Scissors
    Normal scissors
    2 clamps
    Fine anatomic forceps
    Micro-forceps
    Hex nuter driver wiha 1018
    Screwdriver wiha 685
    Snap ring plier Knipex 4411J1 12-25 mm
    Wire cutter Knipex 70 02 160 Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm
    Trans-illumination light IKEA 501.632.02 LED light Jansjö; any light 
    Magnification glasses
    Intravital microscope Zeiss 490035-0001-000 Scope.A1.Axiotech
    LED system Zeiss 423052-9501-000 Colibri.2
    LED module 365nm Zeiss 423052-9011-000
    LED module 470nm Zeiss 423052-9052-000
    LED module 540-580nm Zeiss 423052-9121-000
    Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed Zeiss 489062-9901-000 Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite.
    Filter set 20 Rhodamine Zeiss 485020-0000-000 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm
    2.5X objective NA=0.06 Zeiss 421020-9900-000 A-Plan 2.5X/0.06
    5X objective NA=0.16 Zeiss 420330-9901-000 EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
    10X objetive NA=0.30 Zeiss 420340-9901-000 EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
    20X objective NA=0.50 Zeiss 420350-9900-000 EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
    50X objective NA=0.55 Zeiss 422472-9960-000 LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
    ZEN imaging software Zeiss ZenPro 2012
    CapImage Dr. Zeintl
    Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 45946
    bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation.
    Rhodamine 6G chloride Invitrogen R634 Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child.
    Pentobarbital Merial Narcoren®

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
    2. Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
    3. Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
    4. Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
    5. Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
    6. Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
    7. Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
    8. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
    9. Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
    10. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
    11. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
    12. Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
    13. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
    14. Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
    15. Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
    16. Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
    17. Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
    18. Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
    19. Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
    20. Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
    21. Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
    22. Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
    23. Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
    24. Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. (2013).
    25. Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
    26. Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
    27. Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
    28. Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
    29. Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
    30. Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
    31. Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263, (6 part 2), 1901-1906 (1992).
    إصابة الأنسجة الدماغية في دائرة ثنية الجلد الظهري للماوس: A الجلد رفرف نموذج المعنية بالتحقيق في نقص التروية الحاد الثابتة
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).More

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter