Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

פגיעה ברקמות איסכמי בהגבו skinfold לשכת העכבר: דגם דש עור לחקור איסכמיה מתמיד חריפה

doi: 10.3791/51900 Published: November 17, 2014

Summary

החלון של חדר skinfold הגב העכברי הציג מדמיין אזור של איסכמיה המתמשכת האקוטית של כנף musculocutaneous. היתרי Intravital עלית מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה ישירה וחוזרת ונשנית של נימי הדם והכימות של פרמטרים המודינמיים. נוסף יכולים להיות מתואמות מורפולוגיים ותוצאות המודינמית עם ניתוחים היסטולוגית ומולקולריים.

Abstract

למרות מומחיות עמוקה וטכניקות ניתוחיות מתקדמות, סיבוכים הנגרם איסכמיה הנעים בין התמוטטות פצע נמק רקמות נרחבת עדיין מתרחשים, במיוחד בניתוחי דש שחזור. מודלים דש ניסיוניים מרובים פותחו כדי לנתח את סיבות ומנגנונים העומדים בבסיס ולחקור אסטרטגיות טיפול למניעת סיבוכי איסכמי. הגורם המגביל של רוב הדגמים הוא האפשרות חסרת ישירות ושוב ושוב לדמיין ארכיטקטורת כלי דם ופרמטרים המודינמיים. המטרה של הפרוטוקול הייתה להציג מודל עכבר מבוסס היטב השתייכות לפני שהוזכרו אלמנטים אלה לוקים בחסרים. קשה יותר et al. פיתח מודל של כנף musculocutaneous עם דפוס זלוף אקראי שעובר איסכמיה החריפה מתמשכת ותוצאות ב~ נמק 50% לאחר 10 ימים אם המשיך שלא טופל. בעזרת מיקרוסקופיה עלית הקרינה intravital, מודל תא זה מאפשר הדמיה חוזרת ונשנית שלמורפולוגיה פרמטרים המודינמיים באזורים שונים של ריבית על פני זמן. ניתן לחקור תהליכים נלווים כגון אפופטוזיס, דלקת, דליפת כלי דם ואנגיוגנזה ומתואמים מבחני חלבון immunohistochemical והמולקולריים. עד כה, המודל הוכיח היתכנות ושחזור במספר מחקרים ניסיוניים פרסמו חוקרים את ההשפעה של טרום, peri- וpostconditioning של רקמת תיגר ischemically.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כיסוי של חומר גיד, עצם ושתל נחשף בניתוח השחזור מסתמך על השימוש בדשים. דש הוא גוש של רקמה המועברת על הגבעול של כלי הדם שלו, המבטיח זרימה בעורקים וורידי יצוא. למרות מומחיות רחבה והזמינות של מגוון רחב של דשים שיועברו, סיבוכים הנגרם איסכמיה הנעים בין התמוטטות פצע לסך אובדן רקמה עדיין נתקלו. בעוד ניתן לצפות טיפול שמרני וריפוי על ידי כוונה משנית לאחר נמק רקמת קטין, נמק דש משמעותי בדרך כלל דורש תיקון ניתוחי, כולל הטרייה, אוויר פצע ושחזור המשני. זה מגביר תחלואה, מאריך את השהות בבית חולים וכתוצאה מכך מביא לעלויות טיפול רפואי מוגברות.

דשים עם דפוס מוגדר של כלי דם או באזורי perfused באופן אקראי באזור דיסטלי המרוחק ביותר מזרם העורקים הם רגישים במיוחד לניזק איסכמי. עכו rdingly, מחקרים ניסיוניים וקליניים רבים העריכו את ההתפתחות של נמק בשני, דשי דפוס צירי (אספקת דם מוגדרת) ודשי תבנית אקראית (אספקת דם לא מוגדרת) 1-3. הממצאים העיקריים מבוססים בדרך כלל על הערכה מקרוסקופית של גודל שטח נימקי. על מנת להעריך את הסיבות ומנגנונים של נמק רקמה יותר בפירוט, מספר מחקרים התמקדו בניתוח של זרימת דם. טכניקות שונות שימשו למדידת זלוף רקמות, כוללים הניתוח של מתח חמצן ברקמה באמצעות אלקטרודות polarographic 4-5, כמו גם המדידה של זרימת דם באמצעות Flowmetry דופלר לייזר 6-7, דיפוזיה צבע 8, וmicrospheres 9-10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מאפשרות אך ורק למדידת פרמטרים עקיפים של זלוף רקמה ואינה מאפשרות ניתוח מורפולוגי של תהליכי microhemodynamic בתוך אזור בודד של עניין של כנף.

t "> סנדיסון ידוע להיות הראשון שהשתמש בתא שקוף לממושכות במחקרי vivo, שבם ביצעו בארנבות 11 בשינה 1943 -. כ -20 שנים מאוחר יותר - Algire היה הראשון להסתגל תא כזה שקוף להיות ישים בעכברים כדי ללמוד את ההתנהגות של מיקרו-שתלים של תאים סרטניים 12. בשל העובדה שעכברים הם מה שנקרא בעלי החיים עור רפויים ואחרי כמה חידודים טכניים לאורך השנים הבאות, להר ועמיתים לעבודה היו מסוגל להסתגל כזה תא skinfold גב פיתוח קאמרי טיטניום קטן וקלה. תא זה אפשר הערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital, טכניקה המאפשרת הדמיה ישירה וחוזרת ונשנית של מספר המאפיינים המורפולוגיים וmicrocirculatory והשינויים שלהם לאורך זמן בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological שונים, כגון כפגיעת איסכמיה reperfusion 13.

בחקירת PErfusion של דשי עור, שרירים ועצמות בתנאים רגילים ופתולוגיים שתי מגמות התרחשו: ראשית, דגמי "חריפים" הדש שאינו משתמשים בתא skinfold הגב כגון תנוך אוזן pedicled בעכבר 14, דש עור האי מבוסס הרוחבית באוגר 15 והדש המורכב pedicled בחולדה 16. שנית, המודל "הכרוני" הדש שבו השילוב של כנף עם microcirculatory חוזר על עצמו היתרים קאמריים skinfold גב מנתח על פני כמה ימים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital. הוא מורכב מדש musculocutaneous perfused באופן אקראי המשתלב בתא skinfold של העכבר 17. יחס רוחב-אורכה נבחר שמצב של איסכמיה המתמשכת החריפה תוצאות באופן עקבי ב~ 50% נמק רקמת דש 10-14 ימים לאחר העלאת דש. במידה לשחזור זה של נמק רקמות מאפשרת הערכה נוספת של שניהם, מגן (כלומר, פיתוח של lesשל נמק) וגורמים מזיקים (כלומר, התפתחות של נמק יותר) על הפתופיזיולוגיה דש. בשנים האחרונות, מספר פרסומים ניסיוניים הממחישים את ההשפעה של טרום שונים, peri- ונהלי פוסט-אוויר, כוללים מתן חומרי רקמת מגן 18-24 והיישום המקומי של גורמי לחץ פיסיולוגיים כגון חום 25 וזעזועים 26, צמחו.

הניתוחים כמותיים של נמק, מורפולוגיה כלי דם ופרמטרי microcirculatory יכולים להמשיך להיות מתואמים לניתוחי immunohistochemical ומבחני חלבון. חלבונים שונים ומולקולות כולל פקטור הגדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), synthases תחמוצת חנקן (NOS), kappa B גורם גרעיני (NF-κB) וחלבוני הלם חום (HSP-32: heme-oxygenase 1 (HO-1) וHSP- 70) הוכח לשחק תפקיד בהגנת רקמות. בהתבסס על מודל קאמרי דש זה, שני שינויים פותחו ביורדוr כדי לנתח ניאו-וסקולריזציה וזרימת דם בריפוי עור שתל 27 והתפתחויות angiogenic בדש pedicled עם זלוף הדפוס צירי 28. אנו מציגים מודל לשחזור ואמין הכולל דש musculocutaneous תיגר ischemically בתא skinfold העכבר. מודל זה מאפשר הדמיה וכימות של זרימת הדם ופרמטרים המודינמיים על ידי מיקרוסקופ עלית הקרינה intravital.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: לפני היישום של המודל שהוצג, חוקי הגנה על בעלי חיים המקביל יש להתייעץ ויש לקבל אישור מהרשויות המקומיות. בעבודה זו, כל הניסויים בוצעו בהתאם לעקרונות המנחים לבעלי חיים מחקר מעורב והחקיקה הגרמנית להגנה על בעלי החיים. הניסויים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית.

1. הכנת בעלי חיים והעלאת כירורגי של הדש

  1. לשמור על חיות בכלובים בודדים בטמפרטורת חדר של 22-24 מעלות צלזיוס ובלחות יחסי של 60-65% עם מחזור היום והלילה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית עכברים למי שתייה ואוכל מעבדה סטנדרטית. תמיד לשמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות.
  2. הזרקה להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal (IP) של 0.1 מיליליטר תמיסת מלח לBW 10 גרמו מכיל 90 מ"ג / קילוגרם BW קטמין הידרוכלוריד ו -25 מ"ג /hydrochloride dihydroxylidinothiazine BW קילוגרם. ההרדמה היא הכרחית להכנת בעלי חיים, ניתוחים ומיקרוסקופיה שלאחר מכן. לאשר הרדמה נכונה על ידי בדיקת התגובה לגירוי כואב. בזמן ההרדמה, להחיל משחה וטרינר על עיניים למניעת יובש.
  3. לאחר האינדוקציה של הרדמה מספיק, לְהַשִׁיר שֵׂעַר חזרה עם מכונת גילוח חשמלי. מכאן והלאה, חל הסרת שיער קרם לאזור המגולח כדי להסיר את השיער שנשאר.
  4. במהלך זמן מגורים של קרם הסרת השיער של ~ 7-10 דקות, להכין כלים, כולל מלקחיים עור ומלקחי מיקרו, מספריים ומספריים מיקרו, חומרים לתפירה ועט סימון. לחטא ולהכין את חדר טיטניום על ידי יישום שני הברגים עם האגוזים בבסיס של התא ועל ידי תיקון קצף מודבק עצמם (איור. 1 AC) סביב החלון של העמית של התא כדי להבטיח אטימות של המערכת הקאמרית.
  5. הסר את כל מסי שעוות הקרם מאחור על ידי שטיפהאותו עם מים פושרים. ואז יבשים ולחטא את העור עם פתרון המכיל אלכוהול.
  6. מניחים את העכבר במצב שכיבה ומגדיר את קו האמצע של הגב. לתפוס את העור באופן מרכזי ולהרים אותו כדי ליצור קפל (איור. 2 א). על ידי טרנס-תאורה תוך שימוש בכל סוג של מקור אור, להחליט היכן למקם את מסגרת טיטניום (איור. 2 ב) provisorily. ודא שהסניפים המרוחקים של העורק לרוחב בית החזה (LTA) cranially והעורק העמוק גֵרֵשׁ הכסל (DCIA) caudally כמובן דרך מרכז החלון של החדר (איור. 2 ב-ד). ברגע שהמיקום של החדר נעשה, לנקב שני השכבות של העור בחלק התחתון מאוד של הקפל לקיבעון מאוחר יותר של מסגרת טיטניום. עכשיו להסיר את מסגרת טיטניום, מניח את העכבר במצב שכיבה ולהגדיר מחדש את קו האמצע של הגב במידת צורך.
  7. מתאר את הדש בניצב לשדרה מתחילה על קו האמצע עם יחס רוחב-אורך של 15 x 11 מ"מ לגרום לדש רוחבי מבוסס וperfused באופן אקראי. ואז מתאר אזור עור נוסף של 2 מ"מ המשתרע על הצד בצד הנגדי (איור. 2C, ד). אזור זה הוא הרים עם המלקחיים ולאחר מכן נתפר למסגרת טיטניום מבלי להפריע לאזור הדש הגלוי.
  8. בעקבות סופי לציון, לחתוך את הדש. בכך, ויחצה שני LTA וDCIA ולרומם את הדש (איור. 2E). אין צורך בקרישה או קשירה של כלי transected.
  9. הנח הבורג של תא הבידוד דרך הנקבים בעור שנעשו בעבר (איור. 2F) ולקבע את skinfold שני anteriorly ובדיעבד בתוך המסגרת של התא של הדש הגבוה לחלק האחורי של המסגרת באמצעות החורים של המסגרת של התא ו5-0 תפרים שהופסקו (איור. 2G).
  10. לתפור את הגפיים האנכיים של הדש חזרה לעור שמסביב באמצעות 5-0 תפרים הופסקו (
  11. בלו אזור חמי עגולה של לרוחב עור לרצועת העור הקטן של 2 מ"מ, כלומר, בצד של הדש מצד להתבונן בכלי הדם של הדש. זה מאפשר צפייה ישירה דרך חלון התצפית של החדר שיש לו שטח של 90 מ"מ 2.
  12. להסיר את הרקמה כמו ג'לטין-הרופפת areolar מהשריר המשורטט תוך שימוש במכשירי מייקר ועדשת מגדלת אופטית או מיקרוסקופ על מנת לשפר את איכות התמונה במיקרוסקופ. נסה לא לפגוע בכלים בתוך שכבות רקמת שריר.
  13. לבסוף, לאטום את החדר על ידי ההרכבה העמית של המסגרת שכבר בעבר endued עם רצועות דבקות עצמית של קצף anteriorly, cranially ובדיעבד, bedew הדש עם bisbenzimide האקטואלי ומלוח (איור. י 2). לאחר מכן, להחיל את חלון התצפית עם מכסה זכוכית באמצעות טבעת הצמד. נסה לא ללכוד את כל שלפוחיות אוויר מתחת לזכוכית (איור. 2K, L,). העור יהיה לדבוק בכיסוי זכוכית על ידי כוחות הידבקות.

2. Intravital epifluorescence מיקרוסקופית

  1. חכה 24 שעות לאחר הכנה כירורגית לניתוח המיקרוסקופי הראשון לאיכות אופטית אידיאלית. ניתוח זה מייצג את נקודת ההתחלה של מיקרוסקופיה וחוזר על עצמו ביום 3, 5, 7 ו -10 לאחר ניתוח. בכל פעם, להרדים את העכבר כמתואר בשלב 1.2. מניחים את החיה בעמדת decubital רוחב על מנשא פרספקס בהזמנה אישית. בדרך זו, שכבות רקמת השריר של דש שמירה על מכסה הזכוכית הם פונים כלפי מעלה-מחלקות.
  2. הזרק 0.05 מיליליטר של 5% dextran הירוק פלואורסצנטי (משקל מולקולרי 150,000) ו 0.05 מיליליטר 1% צבע משפחת Rhodamine ניאון מאוד בוריד זנב או צומת ורידי רטרו-מחלה. Dextran הניאון הירוק מכתים את הרכיבים בלתי תאיים של הדם, אם מיושם דרך הווריד (iv). ניאון Rhodamine לויקוציטים כתמים וטסיות דם שיכול להיות distinguished ממרכיבים תאיים ובלתי תאיים אחרים. לבסוף, bisbenzimide כתמי רכיבים גרעיניים שפולטים פחות או יותר הקרינה בהתאם למצב של עיבוי.
  3. כתוצאה מכך, במקום את העכבר מתחת למיקרוסקופ. ודא מיקרוסקופ כולל מערכת LED - שילובי LED אלומת 470 & 425 ננומטר, 365 & 490 ננומטר, ו540 & 580 ננומטר, כמו גם מערכות סינון המקבילה (62 HE BFP / GFP / HcRed, מגוון 1: ננומטר 350-390 גל עירור, לפצל 395 ננומטר / 402-448 ננומטר, טווח 2: 460-488 ננומטר, לפצל 495 ננומטר / 500-557 ננומטר, טווח 3: 567-602 ננומטר, לפצל 610 ננומטר ננומטר / 615 לאינסוף 20 Rhodamine, מגוון. : 540-552 nm, לפצל 560 ננומטר, פליטה 575-640 nm).
  4. רשום את סטילס ותנועה-תמונות באמצעות מצלמת וידאו מכשיר תשלום מצמיד ולשמור אותן במחשב בדיסק קשיח לניתוח נוסף off-line.
  5. השתמש ביעדים שונים (2.5x, NA (צמצם מספרי,) = 0.06 לתצוגות פנורמה של החדר, 5X,NA = -0.16, 10X, NA = 0.32; 20X, NA = 0.50; 50X, NA = 0.55) להקלטות של האזורים של עניין.
  6. כמעט, לחלק את שטח הדש, כי הוא גלוי דרך החלון של החדר לשלושה אזורים בגובה שווה, כלומר, הפרוקסימלי, מרכזי, ואזור דיסטלי המרוחק ביותר מהיבוא של כלי הדם (איור. 3F). לרכישת תמונה, להמשיך את הדרך בכל נקודת זמן התצפית הבאה:
    1. סרוק את תמונת הרקמה על ידי תמונה בתוך החלון של החדר מהפרוקסימלי לדיסטלי באמצעות מטרת 5X.
    2. בכל אזור של הדש, בחר arterioles שנייה או מסדר השלישי וvenules נלווה אליהם עם דפוסי הסתעפות לזיהוי בקלות. באמצעות מטרת 5X, 10X, או 20X, להפוך את התדפיסים של חבילות arteriolovenular כדי קלות מחדש למקם את החבילות לאורך כל תקופת התצפית.
    3. במטרה 20X והאובייקטיבי 50X, שדות נימים נוספים שיא 5-6 ו" אפופטוטיים"שדות לכל אזור של דש בהתאמה. כל התמונות שתועדו עם 10X ו20X מטרות להשתמש באור הכחול (dextran ניאון) ואור ירוק (Rhodamine) מסנן, בעוד שתמונות שתועדו עם 5X ו50X אור הכחול שימוש אובייקטיבי (dextran ניאון) ואור לבן מסנן (Bisbenzimide), בהתאמה .

3. ניתוח של נתונים שנרשמו

הערה: עם השימוש במערכת ניתוח תמונה בעזרת מחשב לכמת את כל פרמטרים נרשמו off-line כדלקמן 29.

  1. מדידה של האזור של אי-perfused, רקמת בהתאמה נימקי (2 מ"מ).
    1. השתמש בתמונה המלאה הקאמרית סרוק החלון נרשמה במטרה 5X (מ2.6.1) וdextran הניאון למדידת רקמות בהתאמה נימקי-perfused שאינם. השתמש בפונקציה "AreaBo" כדי למדוד את השטח הכהה perfused עישון: גבול האזור-perfused שאינה ולחשב השטח במטרמ '2 על ידי שימוש באלגוריתמי מדידת התוכנה של חטיבה.
  2. מדידת קוטר כלי דם בarterioles, נימים וvenules (מיקרומטר).
    1. וידאו עומס או תמונות מAV-החבילות המוקלטות או שדות הנימים לתוך התוכנה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש בתמונות סטילס או קטעי וידאו עם הגדלה הגבוהה ביותר שבו גבולות ברורים של כלי השיט גלויים לעין.
    2. השתמש בפונקציה "DiamPe" של התוכנה כדי לוודא המדידות מתבצעות ניצב לקיר של כלי השייט. כדי לעשות זאת לסמן שתי נקודות על החומה של הכלי ועם הסימן לחץ שליש מהקוטר האנכי של כלי השיט. התוכנה תבצע את המדידה במיקרומטר.
    3. חזור על המדידות באותו כלי עבור כל ההקלטות באותו המקום. למדוד נימים מרובות כדי לצבור קוטר ממוצע.
  3. ניתוח של מהירות תאי דם אדומה (RBC) בarterioles, נימיםnd venules (מ"מ / שנייה).
    1. למהירות arteriolar תאי דם אדומה (RBC) מדידות (מ"מ / s) להשתמש בפונקצית "VeloLSD" של התוכנה ולבחור את אותו כלי בחלון dextran ניאון שהקטרים ​​נמדדו.
    2. לנתח אותו עם מערכת ניתוח תמונה בעזרת מחשב תוך שימוש בשיטת שינוי הקו, שהוא על בסיס המדידה של המשמרת (מ"מ) של דפוס רמת פרט תוך-אפור לאורך זמן (שניות).
  4. מדידה של זרימת נפח דם בכלי (PL / sec).
    1. חישוב זרימת נפח דם (PL / sec) בarterioles, venules ונימים משטח חתך מהירות וכלי RBC (π * r 2) על פי המשוואה של גרוס וAroesty, כלומר, Q = V * π * r 2 , בהנחת שצורת כלי גלילית 30.
  5. מדידת צפיפות נימים פונקציונלית של נימים-perfused RBC (זלוף התזונתי: סנטימטר / סנטימטר
  6. לטעון שדה נימי ניאון נרשם עם הגדלה 20X אובייקטיבית לתוך התוכנה. השתמש בפונקציה "DensLA" למדידת צפיפות נימים פונקציונלית של microvessels-perfused RBC.
  7. עקוב אחר נימי perfused עם הסמן ולסמן את כלי perfused. אל תסמן שאינו perfused נימים, arterioles או venules. התוכנה תהיה למדוד צפיפות נימים פונקציונלית של נימי perfused בס"מ / 2 סנטימטר. חזור על השלבים לשדות נימים נרשמו אחרים.
  • מדידה של tortuosity של microvessels (שיפוץ כלי דם), סימנים מוקדמים של אנגיוגנזה כגון ניצן וניבט היווצרות וmicrovessels שהוקמה זה עתה.
    1. עומס נרשם בסרטי וידאו או מסגרות של שדות נימי ניאון לתוך התוכנה. לזהות כלי gyrose ולהשתמש בפונקציית "TorqIx" של התוכנה. עקוב אחר זרימת הכלי מובהקת מהקורס ומסתיים בקליק ימני. התוכנהלצייר קו ישר לאופן ישיר ויגדיר אותו ביחס לנתיב לייחס.
      הערה: תיזהר סימנים של אנגיוגנזה כגון ניצנים, נבטים ונימים שהוקמו זה עתה, אשר בדרך כלל נובעים בניצב לנימים קיימות מראש. מדוד את הצפיפות של כלי הוקמו זה עתה אלה כמתואר בשלב 3.5.
  • זיהוי של מאפיינים למוות של תאים אפופטוטיים, כגון עיבוי גרעיני, פיצול ו / או margination (תאים / מ"מ 2).
    1. לטעון קטעי וידאו מוקלטים Bisbenzimide (אובייקטיבי 50X) לתוך התוכנה. השתמש בפונקציה "DenseNA". לסמן תאים אפופטוטיים פי המאפיינים שהוזכרו כגון עיבוי גרעיני, פיצול וmargination בלחיצה שמאלי.
    2. לאחר סימון כל התאים האופייניים בכל הווידאו, לחץ על "N / A" בתוכנה, אשר באופן אוטומטי לספור את כל תאים המסומנים ולחלק אותו בכל האזור. התוצאה תהיה אפופטוטייםתאים / מ"מ 2.
  • ניתוח של דבקות ויקוציטים לאנדותל כלי הדם מייצג דלקת. דבקות לסירוגין של לויקוציטים (כדוריות דם לבנות מתגלגל; דבקות <30 שניות: מספר הגלילים / 2 מ"מ משטח אנדותל) וקשר חזק של לויקוציטים (דבק לויקוציטים; דבקות> 30 שניות: מספר המדבקות / 2 מ"מ משטח אנדותל).
    1. לנתח את התגובה הדלקתית על ידי ספירת מספר Rhodamine שכותרתו כדוריות דם לבנות שדבקו באנדותל רירית venules פוסט-נימים עבור תקופת זמן של ≥30 שניות ("מדבקות") וכדוריות הדם לבנות לסירוגין דבקות (<30 שניות, "רולים") . דבקות ויקוציטים Venular באה לידי ביטוי כתאים לכל מ"מ 2 משטח אנדותל.
  • מדידה של רמות אפורות תוך-וביניים כפרמטר לדליפת כלי דם (E extravasation macromolecular = E1 / E2).
    1. להעריך l macromoleculareakage כפרמטר של חדירות כלי דם לאחר הזרקת IV של dextran ניאון. Densitometrically לקבוע רמות אפורות מרובות ברקמה סמוכה ישירות לדופן כלי דם נימים (E1), כמו גם בפלסמת התא ללא השולית של כלי השיט (E2). ואז לחשב extravasation macromolecular (E) כיחס E1 / 31 E2.
  • 4. לאחר ניתוח טיפול

    1. להחזיר את בעל החיים בכלוב נפרד כדי למנוע את חברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאירו בעלי חיים ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal. צג חיות יומיות לדימום, מקומי וסימנים מערכתיים של זיהום ואת המיקום של החדר.
    2. להעריך את המצב הכללי של בעלי החיים על ידי התבוננות פעילות מוטורית, משקל גוף, סימנים של כאב, סובלנות להלבשה ואוטומטית הטלת המום.
    3. שמור על העכברים אחד בכל כלוב, כדי למנוע מוטוהמניפולציה אל של החדר. בכל סימן של כאב, להחיל עצירות במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם BW, תת עורי ב 8 מרווחי שעה.

    5. המתת חסד וexplantation של לשכת skinfold

    1. ביום 10, להקריב בעלי חיים באמצעות מנת יתר של סמים הרדמה (150 מ"ג / קילוגרם Pentobarbital).
    2. הסר את התא ולדגום רקמות דש למבחני חלבון immunohistochemical ומולקולריים. רקמות לדוגמא עבור היסטולוגיה הקונבנציונלית (פורמלין) ומבחנים לכימות חלבון (חנקן נוזלי או קרח יבש).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    הִתמַקְקוּת

    נקודת הסיום העיקרית של מודל זה - גובה דש נמק רקמות לאחר (כלומר, אינדוקציה של איסכמיה המתמשכת האקוטית) - נמדדה שוב ושוב ומאויר macroscopically כפי שמוצגת באיור 3 על פני תקופה של 10 ימים. סימון סופי של נמק דש מתרחש בדרך כלל בין היום 5 ו -7 לאחר ניתוח ומאופיין בשולי אדום, כלומר, אזור של הרחבת כלי דם ושיפוץ כלי דם, המתפתח בין הפרוקסימלי חיוני ואזור נימקי הדיסטלי של הדש (איור. 3D-F ). עכברים שלא טופלו שליטה בדרך כלל לפתח אזור נימקי של כ -50% לאחר 10 ימים שניתן לחלק לשלושה אזורים שונים: הפרוקסימלי perfused גם, האזור המרכזי intercalated וperfused ביקורתית ואזור דיסטלי נימקי (איור 3F.). מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו, כפי שצוין במבוא, הראו דואר מגןffects לאחר הליכים נפשית מראש שונים, המתאפיינים במעבר של שבאזור המטופל באופן ביקורתי מאזור המרכז לכיוון האזור הדיסטלי של הדש.

    פרמטרים כלי

    קטרי כלי הדם ותאי דם -velocity אדומים (RBC) של arterioles וvenules בקטרים ​​שונים, כמו גם של נימי דם סמוכים נמדדים וזרם דם וכתוצאה מהנפח מחושב off-line. הדבר זה מאפשר קישור בין שינויים הן מורפולוגית ופונקציונליים של microvessels השונה מיום 1 ליום 10 (איור. 4 א-ב). בנוסף, הצפיפות הפונקציונלית של הנימים-perfused RBC, הפרמטר לזלוף התזונתי של הרקמות, הוא ניתח. הנימים בדרך כלל בכיוון במקביל ובהווה בקטרים ​​שבין 3-5 מיקרומטר בתנאים פיסיולוגיים (איור. 4C). זרימת דם, מתח חמצן בצפיפות נימים פונקציונלית וסופו של דבר של TissUE להקטין בהדרגה מהפרוקסימלי לדיסטלי להגיע לסף "של כדאיות" (איור. 4C-E), שבו הנימים לא perfused יותר (4E איור.).

    שיפוץ ואנגיוגנזה כלי הדם

    שיפוץ עם התרחבות וtortuosity המוגבר של microvessels ניתן לצפות בכל קבוצות הניסוי עברו הכנת דש (כלומר, גיוס של איסכמיה החריפה המתמשכת:. איור 4F). עם זאת, במודל זה, גירוי איסכמי לבדו אינו מספיק כדי לגרום לאנגיוגנזה כמו למשל לראות במגוון של ניסויים נפשית מראש עם אריתרופויאטין ההורמון (איור. 4G-H). רשתות כלי הדם תפקודיים החדשות שמתפתחות בדרך כלל מניצני כלי דם וניבטים הנובעים בניצב לקיים מראש במקביל נימים מסודרות הן ראשונה גלויות בין היום 3 ו -5.

    תגובת דלקת (אינטראקציה ויקוציטים-אנדותל ואפופטוזיס)

    איסכמיה מתמשכת אקוטית בדרך כלל גורמת לתגובה דלקתית רבה בבעלי חיים שלא טופלו כי הוא מיוצג על ידי עמידה לויקוציטים לאנדותל כלי הדם. תגובה דלקתית זו מאופיינת על ידי גלגול (כלומר, הדבקה לסירוגין של לויקוציטים לאנדותל כלי הדם) ודבק (כלומר, הידבקות חברה של לויקוציטים לאנדותל כלי הדם) לויקוציטים (איור. 5 א-B). בנוסף, עלייה מושרה איסכמיה של תאים אפופטוטיים שניתן לראות בכל בעלי החיים השליטה עם הסימנים האופייניים לעיבוי גרעיני, פיצול וmargination (איור. 5C-D). שני, האינטראקציה ויקוציטים-אנדותל ואפופטוזיס הם סימנים לתגובה דלקתית הנגרמת איסכמיה ולהגדיל בהדרגה עם תפקוד לקוי של כלי דם מתקדם וירידה במתח חמצן ברקמה (כלומר (איור. 5 א-ד)).

    איור 1
    איור איור 1. מסגרת תא טיטניום וכל חלקי העבודה שלו. (א) מסגרת מפורקת המורכבת משני חלקי מסגרת, שלושה ברגים, חמישה אגוזים, חתיכה אחת של קצף, מכסה זכוכית וטבעת הצמד. (ב) נדרש כלים כדי להרכיב את המסגרת כולל נהג משושה אגוז, plier טבעת הצמד ומספרי תיל. מברג הוא לא חובה אבל מומלץ אם תאים ישמשו מספר פעמים. (ג) מורכב חלקי תא בודדים. משמאל: צד אחורי של המסגרת עם שני ברגים ומצורפים אגוזים על שני חורים התחתונים. הצד האחורי משמש לתפר את המסגרת על גבי העור ונושאת בדש. מימין: מורכב צד קדמי שלהמסגרת עם קצף מצורף כדי להבטיח את האטימות. שים לב שכל השלושה הבורג-החורים נשמרים ללא קצף. ודא שאף אחד מהקצף שיופעל לחץ על חלון התצפית, הנושא את מכסה הזכוכית. (ד) סכמטי התאסף קאמרי מסגרת מבלי skinfold גב.

    איור 2
    איור איור 2. הליך הדש האופרטיבי ויישומה בתא skinfold גב טיטניום של העכבר. () מואר-טרנס מוגבה הוכפל skinfold גב של העכבר לדמיין ארכיטקטורת כלי דם למתאר את עמדתו של תא skinfold הגב. (ב) הישבן של מסגרת טיטניום של הקאמרית כבר ממוקם ומיושר עם כלי. החתך של שני חורים לברגים כדי לצרף את הצד הקדמי של חה המסגרתשל נעשה. (C ו- D) חלוקה לרמות של הדש בעור הגב רוחבי: יחס רוחב-אורך הוא 15 מ"מ עד 11 מ"מ ואילו ריכוז שני כלי אנכיים הנובעים. מרחק 2 מ"מ לצד הנגדי (האזור מסומן בין קווי המתאר דש דקים וגבול עבה) ישמש כדי לתפוס את העור עם מלקחיים כדי לרומם את הדש. להתבוננות בעור הישבן דרך חלון התא, רקמה נוספת שיש להסיר (אזור בקע). (E) מוגבה רוחבי דש עור מבוסס, הממחיש את ארכיטקטורת כלי דם מסודרת באופן אקראי שמקורו בבסיס של הדש. האזור בקע כבר לגזור, אבל הוא עדיין מחובר לדש ומוסר בשלב הבא (תלוי עור מתחת למלקחיים). (F) הרכבה בצד האחורי של מסגרת התא. פני העור של הדש הוא על הישבן ועל פני השטח "גלם" מתחת לחלון זכוכית הצד. ברגי chamber`s תקועים through חרות חורים בשני הצדדים של skinfold הגב. (ז) העור שמסביב, anteriorly ובדיעבד, של הדש הוא קבוע של החורים של חישוק החדר העליון. (H) דש העור נמתח וגם נתפר לצד האחורי של המסגרת. כדי למנוע התייבשות של הדש, 0.9% פתרון נתרן כלורי הוא נטף על הדש שוב ושוב. (אני) הדש ואת העור שמסביב הוא קבוע לחלוטין את החורים של חישוק החדר העליון. הדש הוא נתפר חזרה רוחבי לעור הגב הצמוד להבטחת אטימות של החדר. (J) הרכבה עמית נושאי הקצף של המסגרת, המקיף את חלון התצפית. (K) רכוב לחלוטין קאמרי: מכסה זכוכית מחוברת לחלונות התצפית ונחתמה בטבעת הצמד. בורג שלישי מחובר לחלק העליון של המסגרת לאטימות נוספות. החלון בחדר מאפשר ניתוחים חוזרים ונשנים של microvasculaturדואר של הדש על ידי מיקרוסקופ intravital. לגישה קלה יותר במהלך מיקרוסקופיה השלושה הברגים מתקצרים. עכבר ער ומרגש עם תא skinfold הגב רכוב (L).

    איור 3
    מצגת 3. איור של הפיתוח והתיחום המורפולוגי של נמק הדש בימים 0 (מייד לאחר הכנת דש,), 1, 3 (ג), 5 (ד) (ב), 7 (ה) ו -10 (F) . תיחום נימקי סופי מתרחש בין ימים 5 ו- 7 (D, E). בקרות להראות אזור מובהק של תיחום בתוך שטח הדש המרכזי, כוללים שוליים אדומים וחֶרמֵשׁ לבן (ראש חץ כפול וכוכבית בE), המשקף את תגובת hyperemic ושיפוץ כלי דם, כמו גם רקמת אזור התוויית-perfused שאינו אלא פוטנציאל קיימא נמק מתפתח distally (E). בפנל F, הדשרקמה מחולקת בשלושה תחומים שונים על ידי 2 קווים אופקיים: האזור הפרוקסימלי perfused היטב (בבסיס של התמונה), האזור המרכזי perfused ביקורתי (כולל השוליים האדומים הלבן "חֶרמֵשׁ lunatica" מקביל לצללים במוח איסכמי רקמה לאחר פציעת שבץ) ואזור נימקי דיסטלי (המסומן circumferentially על ידי גבול אדום). ההגדלה 16X.

    איור 4
    צרורות איור 4. מיקרוסקופיה עלית הקרינה Intravital הצגת תמונות של arteriovenular (AV) (A, B), שדות קפילרי (C, D, E) ושינויים מורפולוגיים כגון שיפוץ (F) ובאנגיוגנזה (G, H). מיקרוסקופיה Intravital מראה את אותו AV-צרור בבעלי חי שליטה (A, B) ביום 1 (א) ו- 10 (ב). שים לב להעדר התגובה משתהית בבקרות על כל תקופת התצפית בשני arteriolar (א) ו (v) בקוטר venular. C תמונות, D ו- E מדגים מקביל מסודר נימים באזור perfused גם הפרוקסימלי (C), אזור perfused ביקורתי המרכזי מעבר (D) והאזור-perfused לא נימקי דיסטלי (E) של רקמת דש איסכמי. בעכברי perfused ביקורתי האזור המרכזי השליטה רק להראות שיפוץ כלי דם (F), מאופיין בנימים מקבילות מסודר עם התרחבות וtortuosity המוגבר. בניגוד לכך, עכברים שקבלו אריתרופואטין לפני העלאת דש כמשטר נפשית מראש מראה שהוקם זה עתה וניצב נובעים נימים, שניתן להבחין מנימים קיימים מראש רגילות (G, H) באופן ברור. תגובת angiogenic זה לא נצפתה בבקרה. השוו את השיפור עם dextran ניאון 150,000. ההגדלה 80x.

    איור 5
    איור 5. </ Strong> מיקרוסקופיה עלית הקרינה Intravital בו מוצגות AV-חבילות באזור perfused גם הפרוקסימלי הדש) א (ואזור perfused ביקורתי איסכמי המרכזי המעבר של הרקמה (ב '). שים לב לנוכחות המוגברת של כדוריות דם לבנות דבקים (חיצים) בvenules postcapillary (V) וarterioles (א) בתוך אזור איסכמי הדש ב (,) בהשוואה האזור הבריא הפרוקסימלי (א). השוו את השיפור עם Rhodamine. ההגדלה 80x. מיקרוסקופיה עלית הקרינה Intravital בו מוצגות עיבוי גרעיני המצביע על מוות אפופטוטי של תאים בתוך הפרוקסימלי (C) ואזור דש המרכזי perfused ביקורתי (ד ') בקבוצת ביקורת. מספר גדל של תאים אפופטוטיים (חיצים לבנים) הוא ציין באזור מעבר המרכזי איסכמי יותר (ד ') בהשוואה לאזור הפרוקסימלי (C). השוו את השיפור עם Bisbenzimide. הגדלה 250X.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    על מנת להקטין את סיבוכי איסכמי ובכך לשפר את התוצאה הקלינית, נדרש ידע מפורט יותר של תהליכי pathophysiologic ברקמת דש perfused ביקורתי. פיתוח מודלים של בעלי החיים חדשים המחקים איסכמיה מתמשכת חריפה ולכן חובה. בהתאם לכך, היינו יכול לפתח מודל לשחזור בקלות ואמין המאפשר הערכה בזמן אמת מורפולוגיים, דינמית ופונקציונלית חוזר על עצמו בפרמטרים שונים של שרירים וכלי דם בעור שיכול להיות מתואם עם ניתוח immunohistochemical והמולקולרי של רקמת דש נדגמו.

    ההליך כירורגי אינו דורש כל מיומנויות כירורגיות ספציפיות, אם כי בפועל וחלק המיומנות ידנית היא הכרחיים. עקומת למידה של כ 25-30 בעלי חיים המופעלים בדרך כלל יש צורך להשתלט על ההרכבה של חדר skinfold הגב והכנת דש כראוי. בידיים מנוסים, זמן לממוצעי ניתוח 35 דקות. חיוניצעדים של הכנת דש כוללים מיקום הנכון וקווי מתאר של הדש במרכז החלון של החדר עם מיקום מדויק של כלי העיקריים לtransected (באמצעות טרנס תאורה) והסרת הקפדנית של השכבה כמו ג'לטין מעל carnosus מִרפָּד באמצעות תמונה בהגדלה כדי לשפר את איכות התמונה.

    מאז מקבלים ממדי דש במילימטרים, אנו ממליצים להשתמש בקליפר הזזה לדש נכון לציון. אם יש קשיים תוך מיצוב כלי דומיננטיים מסודרים אופקי בתוך החלון של התא, יש ולא לבחור יותר דיסטלי מעמדה לקרבה גדולה יותר של הכלים. המיקום הנכון של הכלים האלה שרוחביים החלון של התא, מבטיח חיתוך רוחב של אלה בזמן הרמת הדש מדיסטלי הפרוקסימלי ואת התוצאות בדש perfused באופן אקראי. במילים אחרות, כישלון ויחצה את כלי מרכזיים אלו יביאו לטפטוף צירידפוס ללא נמק של הרקמה מתחת לחלון. הצעד המכריע הסופי במהלך הכנה כירורגית נוגע להסרת שכבת רקמת areolar כמו ג'לטין. הניסיון הוכיח כי נזקי ההסרה מוגזמים carnosus מִרפָּד subjacent וכך העדין אופקיים מסודר נימי שרירים. Contrariwise, תוצאות ההסרה שמרניות בבצקת-היווצרות וראות מוגבלת סופו של דבר של האזורים של העניין במיקרוסקופ. אם כל הצעדים הללו הם שולטים בזהירות, הדש מתפתח מאוד כל הזמן כ 50% נמק 10 ימים לאחר העלאת דש. זה מאפשר לימוד אסטרטגיות טיפוליות שונות שעשויים לשפר או להחמיר הישרדות של רקמות הדש. לבסוף, השיטה של ​​מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital היא הליך מבוסס היטב להעריך זלוף רקמת כלי דם וניתן ללמוד מהר מאוד.

    החסרון העיקרי של מודל זה הוא זמן תצפית המוגבל של הרקמה בתוך החדר217; של חלון של כ 10 עד 14 ימים הבאים הכנת דש. זאת בשל ההתרופפות ההדרגתית של הפרוקסימלי העור לתא skinfold הגב שסופו של דבר גורם להטיה לצדדים של החדר. לעיתים נדירות, העור כמו הכריך, קבוע מושך מחוץ למסגרת של התא והופך מיקרוסקופיה בלתי אפשרית. מאז נמק לרוב מסומן באופן מלא בין היום 5 ו -7 לאחר ניתוח, זה לא ממש להתפשר רכישת נתונים לפני הטיית של החדר או תלישה של העור בתוך החדר.

    יתרונותיו של המודל כוללים שחזור קל ושימוש הפוטנציאלי של בעלי חיים מהונדסים גנטי. גודלו הקטן יחסית של החלון שניתן להעריך עשויה עם זאת להתפשר המשמעות בתרגום התוצאות למצבים אנושיים. בנוסף, קיימים הבדלים אנטומיים בין בעלי חיים עור הרופפים ובני אדם. אמנם יש לי בעלי החיים וכלים כירורגיים עלות-תועלת סבירה, הרD- ותוכנה דרושה כדי לבצע מיקרוסקופיה (מיקרוסקופ עלית תאורה, מצלמה ברזולוציה גבוהה, צבעי ניאון ותוכנה מיוחדת לניתוח נתונים off-line) מייצגת השקעה גדולה יותר.

    מסקנה:

    אנו מציגים זמן ומודל של בעלי חיים חסכוניים בעכברים המאפשר הדמיה וכימות של פרמטרים microcirculatory ברזולוציה גבוהה. גישה זו מייצגת שיטה אידיאלית כדי לנתח רקמת perfused ביקורתי musculocutaneous דש והמנגנונים התאיים הבסיסיים. שינויים מורפולוגיים של אזורים של עניין יכולים להיחקר שוב ושוב ומתואמים עם שינויים תפקודיים בכלי דם ורמה תאית. לאחר מיקרוסקופיה עלית הקרינה intravital, הרקמה יכולה להיות מעובד יותר באמצעות היסטולוגית וגישות מולקולריות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    אנו מודים לקתרינה Haberland לעריכת תמונות. מימון: המחבר הבכיר קיבל מענק KKF מהאוניברסיטה הטכנולוגית München להקים מעבדת מחקר חדשה.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g Charles River
    Depilation cream Balea Any depilation cream
    Titanium chamber Irola 160001 Halteblech M
    Custom-made Plexiglass mounting frame Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration.
    Slotted cheese head screw Screws and More 842210 DIN84 M2x10
    Hexagon full nut Screws and More 93422 DIN934 M2
    Snap ring Schaefer-Peters 472212 DIN472 J12x1,0
    Cover glass Volab Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter.
    Fixing foam tesamoll 05559-100 tesamoll Standard I-Profile
    Ketamine hydrochloride Parke Davis Ketavet®
    Dihydroxylidinothiazine hydrochloride Bayer Rompun®
    Buprenorphin Essex Pharma Temgesic®
    Saline 0.9%
    Desinfection alcohol
    Vicryl 5-0 Ethicon V 490 H
    Ethilon 5-0 Ethicon EH 7823 H
    1 ml syringes
    Surgical skin marker with flexible ruler Purple surgical PS3151 Any surgical skin marker and flexible ruler
    Pointed scissors
    Micro-Scissors
    Normal scissors
    2 clamps
    Fine anatomic forceps
    Micro-forceps
    Hex nuter driver wiha 1018
    Screwdriver wiha 685
    Snap ring plier Knipex 4411J1 12-25 mm
    Wire cutter Knipex 70 02 160 Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm
    Trans-illumination light IKEA 501.632.02 LED light Jansjö; any light 
    Magnification glasses
    Intravital microscope Zeiss 490035-0001-000 Scope.A1.Axiotech
    LED system Zeiss 423052-9501-000 Colibri.2
    LED module 365nm Zeiss 423052-9011-000
    LED module 470nm Zeiss 423052-9052-000
    LED module 540-580nm Zeiss 423052-9121-000
    Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed Zeiss 489062-9901-000 Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite.
    Filter set 20 Rhodamine Zeiss 485020-0000-000 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm
    2.5X objective NA=0.06 Zeiss 421020-9900-000 A-Plan 2.5X/0.06
    5X objective NA=0.16 Zeiss 420330-9901-000 EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
    10X objetive NA=0.30 Zeiss 420340-9901-000 EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
    20X objective NA=0.50 Zeiss 420350-9900-000 EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
    50X objective NA=0.55 Zeiss 422472-9960-000 LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
    ZEN imaging software Zeiss ZenPro 2012
    CapImage Dr. Zeintl
    Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 45946
    bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation.
    Rhodamine 6G chloride Invitrogen R634 Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child.
    Pentobarbital Merial Narcoren®

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
    2. Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
    3. Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
    4. Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
    5. Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
    6. Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
    7. Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
    8. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
    9. Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
    10. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
    11. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
    12. Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
    13. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
    14. Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
    15. Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
    16. Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
    17. Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
    18. Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
    19. Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
    20. Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
    21. Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
    22. Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
    23. Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
    24. Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. (2013).
    25. Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
    26. Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
    27. Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
    28. Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
    29. Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
    30. Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
    31. Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263, (6 part 2), 1901-1906 (1992).
    פגיעה ברקמות איסכמי בהגבו skinfold לשכת העכבר: דגם דש עור לחקור איסכמיה מתמיד חריפה
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).More

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter