Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Mouse Dorsal Skinfold Odası'nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma

doi: 10.3791/51900 Published: November 17, 2014

Summary

Sunulan murin dorsal Deri kıvrım odasının penceresi kas deri flebi akut kalıcı iskemi bir bölge görüntüler. Mikrovasküler ve hemodinaminin miktarının doğrudan ve tekrarlayan değerlendirmesi için Intravital epi-floresan mikroskopi izin verir. Morfolojik ve hemodinamik sonuçlar daha histolojik ve moleküler analizler ile ilişkili olabilir.

Abstract

Derin uzmanlık ve ileri cerrahi tekniklere rağmen, geniş doku nekrozuna yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala özellikle rekonstrüktif flep cerrahisi, yaşanıyor. Çoklu deneysel flep modelleri altında yatan nedenleri ve mekanizmalarını analiz etmek ve iskemik komplikasyonları önlemek için tedavi stratejileri araştırmak için geliştirilmiştir. En modelleri sınırlayıcı faktör, doğrudan ve tekrar tekrar mikrovasküler mimarisi ve hemodinamikleri görselleştirmek için eksik olasılığıdır. Protokolün amacı bu daha önce belirtilen eksik unsurları affiliating köklü bir fare modeli sunmaktır. Harder ve ark. Tedavi edilmeyen muhafaza edilmesi durumunda 10 gün sonra% 50 nekroz ~ akut kalıcı iskemi ve sonuçları uğrar rastgele bir perfüzyon desenli bir kas deri flebi modeli geliştirmiştir. Intravital epi-floresan mikroskop yardımı ile, bu odacık model tekrarlayan görselleştirme sağlarmorfolojisi ve zamanla farklı ilgi bölgelerinde hemodinamik. Böyle apoptoz, inflamasyon, mikrovasküler sızıntı ve anjiyogenez gibi ilişkili süreçler incelenmiş ve immünhistokimyasal ve moleküler protein deneyleri korele edilebilir. Bugüne kadar, model, kansızlığın meydan doku pre, peri etkisi ve postconditioning araştıran yayımlanmış birkaç deneysel çalışmalarda yapılabilirliğini ve tekrarlanabilirlik kanıtlamıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rekonstrüktif cerrahi maruz tendon kemik implant materyalin kapsamı kanatların kullanımına dayanır. Bir flep arteriyel giriş ve venöz çıkışı garanti kendi vasküler pedikül üzerinde aktarılan doku bloktur. Geniş uzmanlık ve transfer edilecek kapakların çeşitli varlığına rağmen, toplam doku kaybı yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala rastlanmaktadır. Sekonder konservatif tedavi ve iyileşme minör doku nekrozu sonrasında beklenen Oysa, önemli flep nekroz genellikle cerrahi, yara klima ve ikincil yeniden yapılanma dahil cerrahi revizyon gerektirir. Bu, morbidite artar hastanede kalış süresini uzatır ve dolayısıyla artan sağlık maliyetleri yol açar.

Arteriyel girişi gelen en uzak distal bölgesinde bir damar tanımlanmamış desen veya rastgele perfüze alanları ile Flaps iskemik hasara yatkındır. Acco rdingly, çok sayıda deneysel ve klinik çalışmalar hem de nekroz gelişimini değerlendiren, eksenel model flepler (tanımlanmış kanlanma) ve rasgele model flepler (tanımlanmamış kan temini) 1-3. Ana bulgular yaygın nekrotik alanın büyüklüğü makroskopik değerlendirilmesi dayanmaktadır. Nedenleri ve doku nekrozu mekanizmalarını değerlendirmek üzere daha ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar mikrodolaşımında analizi üzerinde duruldu. Farklı teknikler polarografik elektrotlar 4-5 ile doku oksijen geriliminin analizi, hem de lazer Doppler flowmetri 6-7, boya difüzyonu 8 ve mikrosferler 10/9 kullanarak kan akışının ölçümü de dahil olmak üzere, doku perfüzyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Bu teknikler, ancak, sadece doku perfüzyonunun dolaylı parametreleri ölçmek için izin ve bir flep ilgi bireysel alanda microhemodynamic işlemlerin herhangi bir morfolojik analizine imkan yok.

t "> Sandison diye tavşanlarda 11 gerçekleştirilen in vivo çalışmalarda, uzun süreli için şeffaf bir odasını kullandı kim birinci olmak bilinen 1943 yılında -. ​​Yaklaşık 20 yıl sonra - Algire uygulanabilir olması için böyle bir şeffaf odasına adapte ilk Tümör hücrelerinin 12 mikro-implantların davranışlarını incelemek amacıyla farelerde. Nedeniyle fareler gevşek cilt hayvanları sözde ve sonraki yıllarda üzerinde bazı teknik iyileştirmelerden sonra, Lehr ve co-işçi gibi adapte başardık aslında Daha küçük ve hafif bir titanyum bölmeyi üreten bir sırt deri altı bölme. Bu bölme, intravital floresan mikroskobu, morfolojik ve mikro-özelliklerden sayısı ve farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında zaman içinde değişikliklerin doğrudan ve tekrarlayan görüntülenmesi için bir teknik, bu tür kullanılarak değerlendirilmesini mümkün kılmıştır iskemi-reperfüzyon hasarı 13 olarak.

Pe soruşturmanormal ve patolojik şartlar altında cilt, kas ve kemik flep rfusion iki eğilim oluştu: Birincisi, böyle bir fare 14 pediküllü kulak kepçesi gibi dorsal Deri kıvrım odasını kullanmayın "akut" flep modelleri, yanal merkezli ada flep hamster 15 ve sıçanlarda 16 pedikül bileşik flep. İkinci olarak, dorsal deri kıvrım odası izinleri tekrarlayan mikrosirkülatuar ile bir flep kombinasyonu intravital floresan mikroskobu ile birkaç gün boyunca analiz "kronik" flap modeli. Bu fare 17'nin deri altı bölmesi içinde entegre edilmiş bir rasgele perfüze muskülokutan kanat oluşur. Genişliği-uzunluk oranı, akut kalıcı iskemi durum sürekli olarak 10-14 gün kanat yüksekliği sonra,% 50 kanat doku nekrozu ~ sonuçlanan şekilde seçilmiştir. Doku nekrozu Bu tekrarlanabilir ölçüde, koruyucu (yani gelişimi les hem daha değerlendirilmesine olanaks nekrozu) ve zararlı etmenler (yani, kapak patofizyolojisi daha nekroz gelişimi). Son yıllarda, farklı peri öncesi ve doku koruyucu maddelerin 18-24 idaresi ve ısı 25 ve shockwaves 26 gibi fizyolojik stres yerel uygulama da dahil olmak üzere son şartlandırma prosedürleri, etkisini gösteren çok sayıda deneysel yayınlar, ortaya çıkmıştır.

Nekroz, mikrovasküler morfolojisi ve mikrosirkülatuar parametrelerin kantitatif analizleri, immünohistokimyasal analizler ve protein deneyleri korele edilebilir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), nitrik oksit sentaz (NOS) Nükleer Faktör kappa B (NF-KB) ve ısı şoku proteinlerinin (HSP-32 de dahil olmak üzere farklı proteinler ve molekül: heme oksijenaz 1 (HO-1) ve HSP- 70) doku korumada bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu bölme flep modeline dayanarak, iki modifikasyonlar accueillante geliştirilmiştirr eksenel desen perfüzyon ile 28 pediküllü flep deri grefti iyileşmesi 27 ve Anjiyojenik gelişmeler sırasında neovaskülarizasyonunu mikrodolaşımın analiz etmek. Biz fare Deri kıvrım odasında bir kansızlığın meydan muskülokutan kanadı içeren bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir model sunuyoruz. Bu model Intravital epi-floresan mikroskop ile mikrodolaşımında ve hemodinami görselleştirme ve kantifizasyonunu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Ön sunulan modelin uygulanması, ilgili hayvan koruma yasaları danışılması gerekir ve izin yerel yönetimler alınmalıdır. Bu çalışmada, tüm deneyler araştırma içeren hayvanlar için yol gösterici ilkeler ve hayvanların korunması konusunda Alman mevzuatına uygun olarak yapılmıştır. Deneyler yerel hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı.

1. Hayvan Hazırlama ve Kanatçığının Cerrahi Yükseklik

  1. 22-24 ° C, oda sıcaklığında ve 12 saat gündüz-ve gece çevrimi ile% 60-65 bir görece nemde bir kafes hayvanları tutun. Içme suyu ve standart laboratuar yiyeceği fareler ücretsiz erişime izin ver. Her zaman hayatta kalma ameliyat sırasında steril koşulların muhafaza.
  2. 90 mg / kg vücut ağırlığı kadar ketamin hidroklorid ve 25 mg / ihtiva eden, 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mi tuzlu su çözeltisinin intraperitonal ile fare anestezisi (ip) enjeksiyonukg vücut ağırlığı dihydroxylidinothiazine hidroklorür. Anestezi hayvan hazırlanması, cerrahi ve daha sonra mikroskopi için gereklidir. Bir ağrılı uyaranlara yanıt kontrol edilerek uygun Anesthetization onaylayın. Anestezi süresi boyunca, kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem uygulayın.
  3. Yeterli anestezi indüksiyonu sonrası, bir elektrikli tıraş makinesi ile arka tüylerini. Bundan sonra, kalan saç kaldırmak için traş bölgeye epilasyon krem ​​uygulayın.
  4. 7-10 dk'lık Depilasyon kremi kalış süresi sırasında, cilt forseps ve mikro forseps, makas ve mikro makas, dikiş materyali ve bir işaretleyici kalem gibi araçları hazırlamak. Dezenfekte ve bölmenin üssünde somun ile iki vidayı uygulayarak ve kamara sisteminin sıkılığını garanti sanığa muadili penceresinin etrafında kendinden yapışkanlı köpük (Res. 1 AC) sabitleyerek titanyum odası hazırlamak.
  5. Yıkanarak arkasındaki tüm epilasyon kremi kaldırılık su ile kapalı. Daha sonra, kuru ve bir alkol ihtiva eden bir çözelti ile cilt dezenfekte.
  6. Yüzükoyun fare ve arka orta hat tanımlar. Merkezi cilt kavramak ve bir kat (Şekil. 2A) oluşturmak için yukarı doğru kaldırın. Işık kaynağı her türlü kullanarak trans-aydınlatma ile, provisorily titanyum çerçeve (Şekil. 2B) yerleştirmek için nereye karar. Emin olun kraniyale yanal torasik arter (LTA) ve sanığa penceresinin merkezi aracılığıyla kaudale ders derin sirkumfleks iliak arter (DCIA) uzak dalları (Şekil. 2B-D). Odasının konumlandırılması yapıldıktan sonra, titanyum çerçeve, daha sonra tespit için kıvrımın en altındaki cildin her iki katmanın delikli. Şimdi, titanyum çerçevesini kaldırma yüzükoyun fare ve gerektiğinde arka orta hat yeniden tanımlar.
  7. Omurga 15 x 1 bir genişlik-boy oranı ile orta hatta başlangıç ​​dik kanadı Planı1 mm'lik bir yanal göre ve rastgele perfüze kanadın sonuçlanır. Daha sonra, karşı tarafa uzanan 2 mm'lik bir ek deri alan belirtin (Şek. 2C, d). Bu alan, forseps ile toplandı ve daha sonra görünür kanat alanı ile müdahale etmeden titanyum çerçeveye dikilir.
  8. Işaretleme son ardından, flep kesilirken. Bunu yaparken, LTA'ya ve DCIA hem transect ve kapağını (Şekil. 2E) yükseltmek. Nakledilmiş damarların pıhtılaşması ya da bağlanması için herhangi bir gerek yoktur.
  9. Önceden yapılmış deri deliklerinin (Res. 2F) üzerinden bölmenin vidayı yerleştirin ve sanığa çerçevesinin delik ve bir 5-0 kullanarak çerçevenin arka kısmına yükseltilmiş flep bölmenin çerçevesi içinde hem anterior ve posteriorda skinfold sabitleşmek kesintiye dikişler (Res. 2G).
  10. (5-0 sütür ile deriye geri kanadın dikey bacaklarda sütüre
  11. Kapağın damar sistemini gözlemlemek için kapağın diğer tarafında, yani 2 mm'lik küçük bir deri şerit deri yanal bir yarı-dairesel bir alanı eksize edin. Bu 90 mm ​​2 arasında bir yüzeye sahiptir, bölmenin gözlem penceresi üzerinden doğrudan olarak bakma olanağı tanır.
  12. Mikroskopi sırasında görüntü kalitesini iyileştirmek amacıyla mikrocerrahi aletleri ve optik büyütücü lens veya mikroskop kullanılarak çizgili kas jelatin benzeri gevşek areolar doku çıkarın. Kas doku katmanları içinde damarlarının zarar değil deneyin.
  13. Son olarak, topikal bisbenzimid ve tuzlu su (Şek. 2J) ile kanat çiy taneleriyle ıslatmak, kraniyal ve arkaya doğru, önceden öne köpük kendinden yapışkan şeritleriyle endued edilmiş çerçevenin karşıt montaj odacığı mühür. Bundan sonra, bir çırpıda halkayı kullanarak cam kapak ile gözlem penceresi uygulayın. Cam altında herhangi bir hava kabarcıklarına tuzağa çalışın (Res. 2K L). Cilt yapışma güçleri tarafından cam kapak uyacaktır.

2. Intravital Epifloresans Mikroskopi

  1. İdeal optik kalite için ilk mikroskopik analiz için cerrahi hazırlık 24 saat sonra bekleyin. Bu analiz, mikroskopi taban çizgisini temsil eder ve ameliyat sonrasında günde 3, 5, 7 ve 10 tekrar edilir. Adım 1.2 açıklandığı gibi her zaman, fare uyutmak. Ismarlama bir pleksiglas bir taşıyıcı üzerinde bir yanal dekübital pozisyonda hayvan yerleştirin. Bu şekilde, cam kapak yapışan flep kas doku tabakaları yukarı-koğuşta karşı karşıya.
  2. Bir kuyruk damarından ya da retrobulbar venöz pleksus içinde% 5 yeşil floresan dekstran (molekül ağırlığı 150,000) ve 0.05 ml% 1 yüksek seviyede florasan Rodamin ailesi boya 0.05 ml enjekte edilir. Yeşil fluoresan dekstran intravenöz uygulanması halinde, kanın hücresel olmayan bileşenler leke (IV). Dist olabilir floresan Rodamin lekeleri lökosit ve trombositdiğer hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri inguished. Son olarak, yoğunlaşma durumuna göre daha az ya da flüoresan yayan çekirdek bileşenlerinin bisbenzimid boyar.
  3. Daha sonra, mikroskop altında fare yerleştirin. Mikroskop bir LED sistemi içerir olun - 470 ve 425 nm, 365 ve 490 nm ve 540 ve 580 nm LED ışın kombinasyonları gibi gelen filtre setleri (62 HE BPP / GFP / HcRed, aralık 1: 350-390 nm , 460-488 nm 495 nm / 500-557 nm bölünmüş; aralığı 3: aralık 2; uyarma dalga boyu, 395 nm / 402-448 nm bölünmüş 567-602 nm, sonsuz için 610 nm / 615 nm bölmek 20 Rodamin, aralık. : 540-552 nm) emisyon 575-640 nm, 560 nm bölünmüş.
  4. Fotoğraf ve şarj çiftli cihaz video kamera kullanarak hareket görüntü kaydedebilir ve daha fazla off-line analiz için bir bilgisayar sabit diske kaydedebilirsiniz.
  5. Farklı hedefleri (2.5X, NA (sayısal açıklık) = odasının panorama görünümleri için 0,06 kullanın, 5X,NA = 0.16; 10X, NA 0.32 =; 20X, NA 0.50 =; Ilgi bölgelerin kayıtları için 50X, NA = 0.55).
  6. Hemen hemen eşit yükseklikte, yani bir proksimal, merkezi ve en uzak damar girişi (Res. 3F) bir distal alanın üç bölüme bölmenin penceresinden görünür kanat yüzeyini bölün. Görüntü elde etmek için, her bir gözlem zaman noktasında şu şekilde devam edin:
    1. 5X objektif kullanarak uzağa yakınsaldan bölmenin penceresi içinde görüntü ile doku görüntüyü tarayın.
    2. Flep her alanda kolayca tanımlanabilen dallanma desenleri ile ikinci veya üçüncü dereceden arteriyolleri ve beraberindeki venüllerinde seçin. 5X, 10X ya da 20X objektif kullanarak, kolayca bütün gözlem süresi boyunca paketlerini yeniden lokalize etmek için arteriolovenular demetlerinin çıktı olun.
    3. 20X objektif ve 50X objektif, daha fazla kayıt 5-6 kılcal alanları ve "apoptotik ileSırasıyla flep alanı başına "alanlar. 10X ve 20X hedefleri ile kaydedilen tüm görüntüler yeşil ışık (Rodamin) filtresi, oysa, 5X ve 50X objektif kullanımı mavi ışık (floresan dekstran) ve beyaz ışık (bisbenzimid) filtresi ile kaydedilen görüntüler sırasıyla mavi ışık (floresan dekstran) ve kullanımı .

Kaydedilen Verilerin 3. Analiz

Not: 29, aşağıdaki gibi, bir bilgisayar destekli görüntü analiz sisteminin kullanımı off-line Tüm kaydedilen parametrelerin ölçülmesi ile.

  1. Alanının ölçülmesi perfüze olmayan sırasıyla nekrotik doku (mm2).
    1. (2.6.1 itibaren) 5X amacı ile kaydedilen tam taranan odası penceresi görüntü ve non-perfüze sırasıyla nekrotik doku ölçmek için floresan dekstran kullanın. Perfüze olmayan alan Border ve m alan hesaplamak: perfüze olmayan karanlık alanı ölçmek için "AreaBo" işlevini kullanınYazılımın Alan ölçümü algoritmalar kullanarak m 2.
  2. Arterioller, kılcal damarların ve venüllerden (mikron) mikrovasküler çapı ölçümü.
    1. Kaydedilen AV-demetleri veya yazılım içine kılcal alanlardan yük video ve resimler. En iyi sonuçlar, en yüksek büyütme ile fotoğraf veya videoları kullanmak için geminin kesin sınırları açıkça görünür olduğu yere.
    2. Ölçümler geminin duvarına dik gerçekleştirildiğinden emin olmak için yazılımın "DiamPe" işlevini kullanın. Bunu yapmak için geminin dik çapı geminin duvar ve üçüncü tıklama işareti ile iki noktalarını işaretleyin. Yazılım um ölçümü yapacak.
    3. Aynı yerde tüm kayıtları için aynı damarlar üzerindeki ölçümleri tekrarlayın. Ortalama çapa birikmesine çok kılcal ölçün.
  3. Arteriyollerde kırmızı kan hücresi (RBC) hızının analizi, kılcalnd venülleri (mm / sn).
    1. Arteriolar kırmızı kan hücresi (RBC) hız için (mm / s) ölçümleri yazılımın "VeloLSD" fonksiyonunu kullanmak ve çapları ölçülmüş olan floresan dekstran penceresinde aynı damarları seçin.
    2. Süresi (san) içinde tek bir damar içi gri seviye Desenin kayması (mm) ölçümü temelinde olduğu satır kaydırma yöntemi kullanılarak bilgisayar destekli görüntü analiz sistemi ile analiz edin.
  4. Damarlarda hacim kan akışı (ul / sn) ölçümü.
    1. RBC hız ve damar kesit alanından arteriyoller, venüller ve kılcal hacim kan akımı (ul / sn) hesaplayın (π * r2) Gross ve Aroesty, yani S = V * π * r, 2 aşağıdaki denkleme göre , silindirik bir kap şekil 30 varsayılmıştır.
  5. RBC perfüze kılcal fonksiyonel kılcal yoğunluk ölçümü (besleyici perfüzyon: cm / cm
  6. Yazılımın içine 20X objektif büyütme ile kaydedilmiş floresan kılcal alanını yükleyin. RBC-perfüze mikrodamarlar fonksiyonel kılcal yoğunluğunu ölçmek için "DensLA" işlevini kullanın.
  7. Imleç ile perfüze kılcal damarları Trace ve perfüze damarları işaretleyin. Işaretlemek yok kılcal damarlar, arteriyolleri veya venüllerinde perfüze olmayan. Yazılım cm / cm 2 perfüze kılcal damarların fonksiyonel kılcal yoğunluğunu ölçmek olacaktır. Diğer kaydedilen kılcal alanlar için adımları tekrarlayın.
  • Mikrodamarlar (mikrovasküler remodeling) gibi tomurcuk ve filiz-oluşumu ve yeni oluşan mikrodamarlar olarak anjiyojenisinin erken belirtileri kıvrımlarında ölçümü.
    1. Yük yazılımı içine videoları veya floresan kılcal alanların kareleri kaydedildi. Gyrose damarlarını tanımlamak ve yazılımın "TorqIx" işlevini kullanın. Ders ile kesin damar akışını izlemek ve bir sağ tıklama ile biter. Yazılım olacakdoğrudan yol düz bir çizgi çizin ve takip yolu ile ilgili olarak ayarlamak.
      NOT: Genellikle önceden varolan kılcal dik olarak yayılan bu tür tomurcukları, filizleri ve yeni oluşan kılcal olarak anjiyogenez belirtileri, dikkat edin. Aşama 3.5 de tarif edildiği gibi bu, yeni oluşan damarların yoğunluğu ölçülür.
  • Nükleer yoğunlaşma, parçalanma ve / veya marjinalleşmesi (hücre / mm 2) olarak apoptotik hücre ölümü için özellikleri, belirlenmesi.
    1. Yazılımın içine bisbenzimid-kaydedilmiş videoları (50X objektif) yükleyin. "DenseNA" işlevini kullanın. Böyle bir sol tıklama ile nükleer yoğunlaşması, parçalanma ve marjinalleşmesi olarak belirtilen özelliklerine göre apoptotik hücreleri işaretlemek.
    2. Video boyunca tüm karakteristik hücreleri işaretleme sonra, otomatik olarak tüm işaretli hücrelerin sayısı ve alanı boyunca onu böler, hangi yazılım "N / A" seçeneğini tıklatın. Sonuç apoptotik olacakhücre / mm2.
  • Inflamasyon temsil vasküler endotelyuma lökosit yapışması analizi. Lökositlerin Aralıklı bağlılık (lökositler haddeleme; bağlılık <30 sn: silindirlerin sayısı / mm 2 endotelyal yüzey) ve lökositlerin firma bağlılık (lökositler yapışmasını; bağlılık> 30 sn: çıkartmalar / mm 2 endotel yüzey sayısı).
    1. Rodamin sayısını sayarak enflamatuvar yanıtı analiz eder (<30 saniye "silindirler") ≥30 saniye arasındaki bir zaman periyodu ("etiketleri"), post-kılcal venüllerin endotelinde yapıştırılmış lökositler ve aralıklı olarak yapışan lökositlerin etiketli . Venüler lökosit yapışmasını mm2 endotel yüzeyi başına hücre olarak ifade edilir.
  • Mikrovasküler sızıntısı (makro-moleküler fışkırma e = E1 / E2) için bir parametre olarak damar içi ve interstisyel gri seviyelerinin ölçülmesi.
    1. Makromoleküler l değerlendirinbir fluoresan dekstran iv enjeksiyonundan sonra, mikrovasküler geçirgenliğin bir parametre olarak eakage. Densitometrik olarak doğrudan bir kapiller damar duvarı (E1) bitişik, hem de kabın (E2) marjinal hücresiz plazma dokuda çoklu gri seviyesini belirlemektedir. Daha sonra E1 / E2 31 oranı olarak damardan makromoleküler fışkırmaya (E) hesaplar.
  • 4. Ameliyat Sonrası Bakım

    1. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirket önlemek için ayrı bir kafes içinde hayvan dönün. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar sahipsiz bir hayvan bırakmayın. Kanama, lokal ve sistemik enfeksiyon işaretleri ve bölmenin konumu için günlük olarak hayvanlar izleyin.
    2. Pansuman ve otomatik kurcalanmaları motor aktivite, vücut ağırlığı, ağrı belirtileri, tolerans gözlemleyerek hayvanın genel durumunu değerlendirin.
    3. Mutu önlemek için bir kafes için fareler bir tutunodasının al manipülasyon. Ağrının herhangi bir işareti de, 8 saat aralıklarla deri altından, 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda buprenorfin geçerlidir.

    5. Ötanazi ve Skinfold Odası Eksplantasyonu

    1. 10. günde, bir anestetik ilaç (150mg / kg kadar pentobarbital) bir doz aşımı ile hayvanlar kurban.
    2. Odasını kaldırmak ve immünohistokimyasal ve moleküler protein deneyleri için flep doku örnek. Geleneksel histoloji (formalin) ve ölçülebilir protein tayini (sıvı azot veya kuru buz) için örnek dokular.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Nekroz

    Bu model, temel nokta - doku nekrozu, aşağıdaki kanat yüksekliği (örneğin akut iskemi, kalıcı indüksiyonu) - tekrar tekrar ölçülür ve 10 günlük bir süre boyunca, Şekil 3 'de gösterildiği gibi makroskopik olarak gösterilen. Flep nekroz nihai sınır çizimi genellikle ameliyattan 5 gün sonra ve 7 arasında meydana ve Şek. 3D-F (proksimal hayati ve flep distal nekrotik bölge arasında gelişen vazodilatasyon ve mikrovasküler biçimlenme kırmızı saçak, yani, bölge ile karakterizedir ). Iyi perfüze proksimal, interkalasyonlu ve eleştirel perfüze merkez alan ve nekrotik uzak alan (Şekil 3F.): Tedavi edilmemiş kontrol fareleri genellikle üç ayrı bölüme ayrılabilir 10 gün sonra yaklaşık% 50 bir nekrotik alanı geliştirmek. Giriş kısmında belirtildiği gibi, bizim grubun Daha önceki çalışmalar, koruyucu e göstermiştirkanadının uzak bölgesine doğru merkezi bölgesinden kritik perfüze alanının bir değişiklik ile, özelliği farklı ön şartlama prosedürlerden sonra, fektleri.

    Gemi parametreleri

    Mikrovasküler çapları ve arteriyollerin kırmızı kan hücresi (RBC) -velocity ve çeşitli çaplarda yanı sıra komşu kılcalların venüller ölçülür ve elde edilen hacim kan akışı hat-dışı hesaplanır. Bu durum, günde 10 (Şek. 4A-B) 1 gün ayrı mikrokapların morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler ilişkilendirerek sağlar. Buna ek olarak, RBC perfüze kılcal fonksiyonel yoğunluğu, dokunun besleyici perfüzyon için parametre analiz edilmiştir. Kılcal damarlar genellikle paralel ve fizyolojik koşullar (Res. 4C) altında 3-5 mm arasında çaplarda mevcut odaklı. Kan akımı, Tiss nihayetinde fonksiyonel kılcal yoğunluğu ve oksijen gerilimiyavaş yavaş "canlılığı" bir eşik ulaşmak için uzağa yakınsaldan azaltmak UE (Res. 4C-E) kılcal damarlar artık (Şekil. 4E) perfüze değildir.

    Mikrovasküler remodeling ve anjiyogenez

    Dilatasyon ile Tadilat ve mikrodamarlar artan eğrilik flep hazırlanması geçiren tüm deney gruplarında görülebilir (yani, akut kalıcı iskemi indüksiyon:. Şekil 4F). Bununla birlikte, bu modelde tek başına iskemik uyaran eritropoietin hormonu (Şek. 4G-H) ile ön-kıvamlandırma deneyler çeşitli görülen örnek olarak anjiyojenezi teşvik etmek için yeterli değildir. Çoğunlukla dik çıkan mikrovasküler tomurcukları ve filizleri gelişir yeni fonksiyonel mikrovasküler ağları önceden varolan düzenlenmiş kılcal damarlar gün 3 ile 5 arasında görünür ilk sırada paralel-.

    Inflamatuar yanıt (lökosit-endotel etkileşimi ve apoptoz)

    Akut Kalıcı iskemisi, mikrovasküler endotel lökositlerin yapışması ile temsil edilir muamele edilmemiş hayvanlarda önemli bir enflamatuvar yanıtı indükler. Bu enflamatuvar yanıt (yani, aralıklı, vasküler endotelyuma lökosit yapışması) ve yapıştırıcı (örneğin, vasküler endotelyuma lökositlerin yapışması) lökositlerin (Şek. 5A-B) haddeleme ile karakterize edilir. Buna ek olarak, apoptotik hücrelerin bir iskeminin neden olduğu artış, nükleer yoğuşma, parçalanma ve marjinalleşmesi (Şek. 5C-D) karakteristik işaretler Tüm kontrol hayvanlarında görülebilir. Her ikisi de, lökosit-endotel etkileşimi ve apoptoz iskemi kaynaklı inflamatuvar yanıt için ibretler vardır ve yavaş yavaş ilerleyici mikrovasküler disfonksiyon artırmak ve doku oksijen tansiyonu azalma (yani (Şekil. 5A-D)).

    Şekil 1,
    Şekil 1. titanyum odası çerçevenin İllüstrasyon ve iş parçalarının hepsi. (A) iki kare parça, Üç vida, beş fındık, bir köpük parçası, bir kapak cam ve bir çırpıda halka oluşan Demonte çerçeve. (B) altıgen somun sürücü, bir çırpıda halka Pense ve bir tel kesici dahil çerçeveyi monte araçları gereklidir. Odaları birkaç kez kullanılabilir eğer bir tornavida gerekmez ama tavsiye edilmez. (C) tek odacıklı parçalar montajlı. Iki vida ile çerçevenin Arka tarafı ve alt iki deliklere fındık ekli: Sol. Arka tarafı cilde çerçeveyi dikmek için kullanılan ve kapağını taşımaktadır. Sağ: ön tarafında Montajlıekli köpük ile çerçeve sızdırmazlığı garanti. Her üç vida delikleri köpük uzak tutulur unutmayın. Köpük hiçbiri cam kapak taşıyan gözlem penceresi, içine preslenmiş olacaktır emin olun. (D) şematik dorsal deri kıvrımı olmadan oda çerçeveyi toplandı.

    Şekil 2,
    Operatif flep prosedürü ve fare titanyum dorsal Deri kıvrım odasında onun uygulanması Şekil 2. İllüstrasyon. (A) Yükseltilmiş trans-ışıklı dorsal Deri kıvrım odasının konumunu özetleyen için damar mimarisi görselleştirmek için fare dorsal skinfold ikiye katladı. (B) sanığa titanyum çerçevesinin arka konumlandırılmış ve damarları ile uyumlu hale getirilmiştir. Vidalar için iki delik insizyon çerçeve ha ön tarafını bağlamak içins yapılmıştır. Genişlik-uzunluk oranı, 11 mm, 15 mm, iki dikey olarak ortaya çıkan gemi merkezleme haldeyken: yanal sırt derisi üzerinde kanadın çizilerek (C ve D). Karşı taraf (ince flep anahat ve kalın sınırı arasında işaretsiz alan) 2 mm mesafe kapağını yükseltmek için forseps ile cilt kavramak için kullanılacaktır. Odası pencereden arka cilt gözlem için, ek doku (taralı bölge) kaldırılmalıdır. (E) Yükseltilmiş yanal kanat tabanına gelen rasgele düzenlenmiş damar yapılarının gösteren, flep göre. İşaretlenmiş alan, kesilmiş olan, ama yine de kapağa bağlı olduğu ve (forseps altında deri asılı) bir sonraki aşamada uzaklaştırılır. Odası çerçevenin arka tarafını Montaj (F). Kanadının deri yüzeyinin arka ve cam cam tarafının altına "ham" üzerinde yer alır. Chamber`s vidalar thr sıkışmışough dorsal deri kıvrım her iki tarafında delik kazıma. Kanatçığın anterior ve posterior (G) ', etrafı saran deri, üst bölme kenarının delik sabitlenmiştir. (H), flep uzatılmış ve aynı zamanda çerçevenin arka tarafına dikilir. Kanatçığın dehidratasyon önlemek için,% 0,9 sodyum klorid çözeltisi, art arda kapakçığa damlatılmaktadır. (I) 'e kapağı ve çevreleyen deri tamamen üst bölme kenarının delik sabitlenmiştir. Flep odasının sıkılığını garanti komşu dorsal deri içine yanal geri dikilir. (J) gözetleme penceresi çevreleyen çerçevenin köpük taşıyan muadili montajı. (K) Tamamen odasına monte: Bir kapak cam gözlem pencereleri takılı ve bir çırpıda halka ile kapatılmıştır. Bir üçüncü vida ek sıkılık açısından çerçevenin üst kısmına bağlanmıştır. Odasındaki pencere microvasculatur tekrarlanan analizler sağlarintravital mikroskobiyle kanadın örn. Mikroskopi sırasında kolay erişim için üç vida kısalır. (L) monte dorsal deri kıvrımı odası ile Uyanık ve hareketli fare.

    Şekil 3,
    Günde kanat nekroz morfolojik geliştirilmesi ve sınır Şekil 3. Sunum, 0, 1 (B), 3 (c), 5 (d), 7 (E), 10 (hemen kanat hazırlanması, sonra) (F) . Final nekrotik sınır günlerde 5 ve 7 (D ve E) arasında yer alır. Kontroller hiperemik tepki ve mikrovasküler biçimlenme hem de perfüze olmayan ama potansiyel olarak uygun bir alan ortaya koymaya dokuyu yansıtan kırmızı saçak ve (E çift ok ucu ve yıldız işareti), beyaz bir falx dahil olmak üzere merkezi kanat alanı içinde sınır farklı bir bölgesini göstermektedir nekroz distalde (E) geliştirilmesi. Panelinde F, flapDoku 2 yatay çizgiler ile üç farklı alanlarda ayrılmıştır: (resmin dibinde) iyi perfüze proksimal bölge, kırmızı saçak iskemik beyin penumbranın karşılık gelen "lunatica falks" Bir beyaz dahil eleştirel perfüze merkezi bölge ( inme yaralanma) ve çevresel Kırmızı sınır işaretlenmiş nekrotik distal bölge () sonra doku. Büyütme 16X.

    Şekil 4,
    Arteriovenular görüntülerini gösteren Şekil 4. intravital ep floresan mikroskobu (AV) paketler (A, B), kılcal alanlar (C, D, E) ve tekrar oluşturulmasında (F) ve anjiyojenez (G, H) gibi morfolojik değişiklikler. Bir kontrol hayvanına da (A, B) Gün 1 (A) ve 10 (B) 'de, aynı AV kümesini gösteren İntra vital mikroskopik. Her iki arterioler olarak tüm gözlem süresi boyunca kontrol bekletici yanıtının yokluğu notAr (a) ve venüler (h) çap. Fotoğraflar C, D ve E paralel de perfüze yakın bölge (Cı), kritik perfüze merkezi bir geçiş bölgesini (D) sahiptir ve iskemik kanat olmayan doku perfüze nekrotik uzak bölge (E) kılcal düzenlenmiş oldukları bilinir. Yalnızca vasküler yeniden göstermektedir kritik perfüze merkezi bölge kontrol farelerinde (F) 'de, genleşme ve artan kıvrımlarında paralel yerleştirilmiş kılcal damarlar ile karakterize edilir. Bunun aksine, fareler ön şartlandırma rejimi yeni oluşmuş gösterdiği gibi, kanat yüksekliği önce eritropoietinin alınması ve dikey olarak, normal, önceden mevcut kılcallardan (G, H) açıkça ayırdedilebilmektedir kılcal ortaya çıkabilecek. Bu Anjiyojenik tepki kontrollerde gözlenmemiştir. Floresan dekstran 150.000 kontrast geliştirme. Büyütme 80X.

    Şekil 5,
    Şekil 5. </ Strong> Intravital epi-floresan mikroskop iyi perfüze proksimal flep bölgesi (A) ve doku (B) eleştirel perfüze iskemik merkez geçiş bölgesinde AV-demetleri görüntüleniyor. Postkapiller venlerde lökositler (oklar) kalarak artan varlığını unutmayın (h) ve sağlıklı bir yakın bölge (A) göre iskemili kanat bölgesi (B) içinde arteriyoller (a) dır. Rodamin ile kontrast geliştirme. Büyütme 80X. Kontrollerin proksimal (C) içinde apoptotik hücre ölümünü ve eleştirel perfüze merkezi flep alanı (D) gösteren nükleer yoğunlaşmayı görüntülendiği Intravital epi-floresan mikroskop. Yakın bölge (C) 'ye göre apoptotik hücrelerin (beyaz oklar) sayısında artış daha fazla iskemik merkezi geçiş bölgesinde (D) içinde görülmektedir. Bisbenzimid ile kontrast geliştirme. Büyütme 250X.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Klinik sonucu iskemik komplikasyonları azaltmak ve böylece iyileştirmek için, eleştirel perfüze flep dokusunda patofizyolojik süreçlerin daha detaylı bilgisi gereklidir. Akut kalıcı iskemi taklit yeni hayvan modellerinin geliştirilmesi, bu nedenle zorunludur. Buna göre, örneklenmiş kanat dokusunun immünohistokimyasal ve moleküler analiz ile ilişkili olabilir kas ve deri damarsal çeşitli parametrelerin tekrarlayan, morfolojik, dinamik ve fonksiyonel gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlayan bir kolay, güvenilir ve tekrarlanabilir bir model geliştirmeyi başardık.

    Uygulama ve bazı el becerisi gerekli olmasına rağmen cerrahi prosedür, herhangi bir özel cerrahi beceri gerektirmez. Yaklaşık 25-30 çalışan hayvanlar bir öğrenme eğrisi düzgün dorsal deri kıvrım odası ve flep hazırlama montaj ustası genellikle gereklidir. Deneyimli ellerde, cerrahi ortalamaları 35 dakika için zaman. Çok önemliflep hazırlama aşamaları doğru yerleşim ve anahat ana damarlarının doğru konumlandırma ile sanığa penceresinin merkezinde flep (trans-aydınlatma kullanarak) nakledilmiş olması ve panniculus carnosus yukarıda jelatin benzeri tabakanın titiz kaldırılmasını içerir görüntü büyütme kullanarak görüntü kalitesini artırmak için.

    Flep boyutlar milimetre olarak verilmiştir yana, doğru flep işaretlemek için bir sürgülü kumpasla öneririz. Bölmenin penceresinde yatay düzenlenmiş baskın damarlarını konumlandırırken herhangi bir zorluk varsa, bir yerine bir damar daha yakın bir konumda daha uzak seçmelisiniz. Distalinden flep kaldırma proksimale ve rastgele perfüze flep sonuçlar için ise sanığa en penceresini enine bu gemilerin doğru konumlandırma, bu transekte garanti eder. Diğer bir deyişle, başarısızlığı bu büyük damar eksenel perfüzyon neden olur transeksiyonu içinPencerenin altında doku nekrozu olmadan desen. Cerrahi hazırlığı sırasında son önemli bir adım jelatin benzeri areolar doku tabakasının kaldırılması ile ilgilidir. Deneyim, aşırı çıkarma zarar bitişiktir istemsiz carnosus ve böylece hassas yatay kas kılcal yerleştirilmiş olduğunu göstermiştir. Tam tersine, ödem formasyonu konservatif çıkarma sonuçları ve mikroskopi sırasında, ilgi konusu bölgelerin sonunda sınırlı görüş. Tüm bu adımlar dikkatle hakim ise, flep çok sürekli flep elevasyonu sonra% 50 nekroz 10 gün yaklaşık geliştirir. Bu geliştirmek veya flep doku hayatta kötüleştirebilir çeşitli tedavi stratejileri eğitim verir. Son olarak, intravital floresan mikroskopi yöntemi mikrovasküler doku perfüzyonunu değerlendirmek için köklü bir işlemdir ve çok hızlı bir şekilde öğrenilebilir.

    Bu modelin en büyük dezavantajı, oda içindeki doku sayıda gözlem zamanı217; flep hazırlanması takiben yaklaşık olarak 10 ila 14 gün s penceresi. Bu, son bölmenin yan yana yatırılması ile sonuçlanan dorsal deri altı bölmeye cilt proksimal progresif gevşeme kaynaklanmaktadır. Nadiren, sandviç gibi, sabit cilt bölmenin çerçevenin dışına çeker ve mikroskopi imkansız kılmaktadır. Nekrozu genellikle tam olarak ameliyat sonrası gün 5 ve 7 arasındaki sınırları çizilmiş olup, bu gerçekten bölmenin, eğme veya odası içinde deri çekmeden önce veri toplama ödün vermez.

    Modelin avantajları kolayca tekrarlanabilirlik ve genetik olarak tadil edilmiş hayvanların potansiyel kullanımı bulunmaktadır. Ancak insan koşullarına sonuçları çevirisinde önem tehlikeye atabilir değerlendirilebilir pencerenin nispeten küçük boyutu. Buna ek olarak, gevşek derili hayvanlar ve insanlar arasında anatomik farklılıklar vardır. Hayvanlar ve cerrahi aletler makul bir maliyet-etkililik varken, hard- ve gerekli yazılım (off-line veri analizi için epi-aydınlatma mikroskobu, yüksek çözünürlüklü kamera, floresan boyalar ve özel yazılım) mikroskopi büyük bir yatırımı temsil gerçekleştirmek için.

    Sonuç:

    Yüksek rezolüsyonlu görselleştirme ve mikro-parametrelerin ölçümü sağlayan bir zaman ve farelerde düşük maliyetli bir hayvan modeli sunarlar. Bu yaklaşım eleştirel perfüze muskülokutan flep dokusu ve altta yatan hücresel mekanizmaları analiz etmek için ideal bir yöntem temsil eder. Ilgi bölgelerin morfolojik değişimler defalarca incelenmiş ve mikrovasküler ve hücresel düzeyde fonksiyonel değişiklikler ile ilişkili olabilir. İntra vital epi-floresan mikroskobu sonra, yumuşak kağıt olup, histolojik ve moleküler yaklaşımlar kullanılarak işlenebilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Biz görüntü düzenleme Katharina HABERLAND teşekkür ederiz. Finansman: kıdemli yazar, yeni bir araştırma laboratuvarı kurmak için Technische Universität München bir KKF Grant aldı.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g Charles River
    Depilation cream Balea Any depilation cream
    Titanium chamber Irola 160001 Halteblech M
    Custom-made Plexiglass mounting frame Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration.
    Slotted cheese head screw Screws and More 842210 DIN84 M2x10
    Hexagon full nut Screws and More 93422 DIN934 M2
    Snap ring Schaefer-Peters 472212 DIN472 J12x1,0
    Cover glass Volab Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter.
    Fixing foam tesamoll 05559-100 tesamoll Standard I-Profile
    Ketamine hydrochloride Parke Davis Ketavet®
    Dihydroxylidinothiazine hydrochloride Bayer Rompun®
    Buprenorphin Essex Pharma Temgesic®
    Saline 0.9%
    Desinfection alcohol
    Vicryl 5-0 Ethicon V 490 H
    Ethilon 5-0 Ethicon EH 7823 H
    1 ml syringes
    Surgical skin marker with flexible ruler Purple surgical PS3151 Any surgical skin marker and flexible ruler
    Pointed scissors
    Micro-Scissors
    Normal scissors
    2 clamps
    Fine anatomic forceps
    Micro-forceps
    Hex nuter driver wiha 1018
    Screwdriver wiha 685
    Snap ring plier Knipex 4411J1 12-25 mm
    Wire cutter Knipex 70 02 160 Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm
    Trans-illumination light IKEA 501.632.02 LED light Jansjö; any light 
    Magnification glasses
    Intravital microscope Zeiss 490035-0001-000 Scope.A1.Axiotech
    LED system Zeiss 423052-9501-000 Colibri.2
    LED module 365nm Zeiss 423052-9011-000
    LED module 470nm Zeiss 423052-9052-000
    LED module 540-580nm Zeiss 423052-9121-000
    Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed Zeiss 489062-9901-000 Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite.
    Filter set 20 Rhodamine Zeiss 485020-0000-000 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm
    2.5X objective NA=0.06 Zeiss 421020-9900-000 A-Plan 2.5X/0.06
    5X objective NA=0.16 Zeiss 420330-9901-000 EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
    10X objetive NA=0.30 Zeiss 420340-9901-000 EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
    20X objective NA=0.50 Zeiss 420350-9900-000 EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
    50X objective NA=0.55 Zeiss 422472-9960-000 LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
    ZEN imaging software Zeiss ZenPro 2012
    CapImage Dr. Zeintl
    Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 45946
    bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation.
    Rhodamine 6G chloride Invitrogen R634 Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child.
    Pentobarbital Merial Narcoren®

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
    2. Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
    3. Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
    4. Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
    5. Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
    6. Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
    7. Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
    8. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
    9. Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
    10. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
    11. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
    12. Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
    13. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
    14. Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
    15. Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
    16. Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
    17. Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
    18. Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
    19. Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
    20. Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
    21. Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
    22. Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
    23. Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
    24. Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. (2013).
    25. Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
    26. Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
    27. Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
    28. Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
    29. Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
    30. Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
    31. Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263, (6 part 2), 1901-1906 (1992).
    Mouse Dorsal Skinfold Odası&#39;nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).More

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter