Summary
Primære cellekultur ved hjelp av intakte vev organoids gir et modellsystem som etterligner multi-mobilnettet in vivo mikromiljøet. Vi utviklet et serum-free primære brystepitel vevskultur modell som foreviger blandede cellekultur linjene og utstillinger differensierte morfologi, uten enzymatisk vev avbrudd. Bryst organoids være levedyktig i> 6 måneder.
Abstract
Bryst duktalt carcinoma in situ (DCIS), per definisjon, er spredning av neoplastiske epitelceller innenfor rammen av bryst duct, uten å bryte collagenous basalmembran. Mens DCIS er en non-obligat forløper til invasiv brystkreft, er de molekylære mekanismer og cellepopulasjoner som tillater progresjon til invasiv kreft ikke fullt ut kjent. For å bestemme om progenitor-celler i stand til invasjons eksisterte i DCIS cellepopulasjon, har vi utviklet en metode for innsamling og dyrking sterilt humant brystvev ved tidspunktet for kirurgi, enzymatisk uten avbrudd av vev.
Sterile brystvev som inneholder duktale segmenter er høstet fra kirurgisk excised brystvev følgende rutine patologisk undersøkelse. Vev som inneholder DCIS er plassert i næringsrikt, antibiotika-inneholdende, serumfritt medium, og transportert til laboratoriet vevskultur. Brystvevet er videre dissekertd for å isolere de forkalkede områder. Multiple brystvev stykker (organoids) er plassert i et minimalt volum av serumfritt medium i en kolbe med et avtagbart lokk, og dyrket i en fuktet CO2-inkubator. Epiteliale og fibroblast cellepopulasjoner dukke opp fra organoid etter 10 - 14 dager. Mammospheres spontant danne på og rundt epitelcelle monolayer. Spesifikke cellepopulasjoner kan høstes direkte fra flasken uten å forstyrre nabocellene. Våre ikke-enzymatisk vev kultur system avslører pålitelig cytogenetisk unormale, invasive stamceller fra friske menneskelige DCIS lesjoner.
Introduction
Spredning av epitelceller innenfor rammen av bryst kanaler og alveolene (ductal carcinoma in situ) er anerkjent som en obligat forløper til invasiv ductal og lobular brystkreft. Ikke desto mindre er de molekylære mekanismer og dynamikk cellepopulasjon som tillater progresjon til invasiv kreft dårlig forstått. Belyse overlevelsesmekanismer som brukes av pre-invasive brystkreft celler, eller en hvilken som helst pre-invasive svulster, kan avsløre terapeutiske strategier for å drepe, eller hindre, pre-invasive svulster 1. Imidlertid har enkle lavkost metoder for funksjonelt studerer menneskelige pre-invasive lesjoner vært mangelfull. Selv om in vitro-monolag-kultur av transformerte cellelinjer er en etablert fremgangsmåte laboratorie, genotype og fenotype av disse udødeliggjorte cellelinjer unnlater å rekapitulere molekyl status av primære humane tumorceller 2. Videre, til og med den ikke-tumorigen MCF-10A-cellelinjen, som Recapitulates 3-D melkekjertlene arkitektur, unnlater å representere funksjonell fenotype og molekylære egenskapene til den enkelte pasients pre-invasiv bryst lesjon 3,4 tilstrekkelig.
For å bestemme om stammeliknende neoplastiske celler i stand til invasjons eksistert innen duktalt karsinom in situ (DCIS) cellepopulasjon, har vi utviklet en metode for innsamling og dyrking sterilt humant brystvev ved tidspunktet for kirurgi (figur 1) 5. Vår ex vivo bryst organoid kultursystemet ikke er avhengig av enzymatisk vev avbrudd, basalmembranekstrakt matrise eller fibroblast uttømming, for å isolere og som forplanter seg mammosphere-dannende celler fra friske humane bryst duktalt karsinom vev 6-8. Vår nye systemet er basert på prinsippet om celle streaming / migrasjon 5. De bare bryst kanaler, og omkringliggende stroma blir neddykket i et minimalt volum av serumfritt næringsmedium (e barenough å dekke kanal fragmenter) for å maksimere gassutveksling, med snittflaten av kanalen eksponert til kulturmediet, men på ingen bestemt retning i kolben (figur 1E-F). Denne kulturen systemet tillater celler til å migrere ut av kanalen og inn / ut mot autologe stroma og kulturflaske. Den næringsmedium, supplert bare med epidermal vekstfaktor (EGF), insulin, og antibiotika, støtter veksten av blandede cellepopulasjoner som kommer fra organoid. Den vevskulturkolbe har et avtagbart, lukkbar lokk som gjør det mulig for organoids og / eller celler som skal høstes uten å forstyrre hele kolbe eller nabo organoids, og samtidig opprettholde et sterilt miljø fuktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelig brystvev ble samlet inn fra pasienter som deltok i en forskningsstudie, med skriftlig informert samtykke, etter Department of Defense, George Mason University, og Inova Health System Institutional Review Board godkjente protokoller.
1. Forbered Nutrient Rich Medium med vekstfaktorer og antibiotika
- Forbered stamløsninger av insulin, epidermal vekstfaktor (EGF), streptomycin og gentamicin sulfat sulfat.
- Rekonstituer insulin i sterilt filtrert vann til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml. Sug 10 ml Type 1 reagenskvalitet vann i en steril 10 ml engangssprøyte. Fest en 0,22 mikrometer polyetersulfon filter til sprøyten. Tilsett sterilt filtrert vann inn i et sterilt 15 ml konisk rør.
- Tilsett 10 ml sterilt filtrert vann til en ampulle med 100 mg insulin. Bland innholdet kort på en vortex mixer. Hold insulin hetteglasset på is. Tilsett 450 ul av insulin lager Løsnsjon i merket, sterile mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C. Insulin lager løsningen er stabil frem til utløpsdatoen på flaske.
- Forbered stamløsning av epidermal vekstfaktor (EGF): Legg 500 ul sterilt vann til 500 pg EGF (stock 1 ug / ul). Bland innholdet kort på en vortex mixer. Hold EGF hetteglasset på is.
- Tilbered en arbeidsstamløsning av EGF: Tilsett 100 pl av lagerløsning EGF til 900 ul næringsmedium (arbeids lager vil være 0,1 ug / ul). Bland innholdet kort på en vortex mixer. Tilsett 50 mL av EGF arbeidsstamløsning i merket, sterile mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C.
MERK: EGF stamløsning (1 mikrogram / mikroliter) er stabil i 1 år ved -80 ° C; arbeidsstamløsning (0,1 ug / ul) er stabil i 2 måneder ved -80 ° C.
- Tilbered en arbeidsstamløsning av EGF: Tilsett 100 pl av lagerløsning EGF til 900 ul næringsmedium (arbeids lager vil være 0,1 ug / ul). Bland innholdet kort på en vortex mixer. Tilsett 50 mL av EGF arbeidsstamløsning i merket, sterile mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C.
- Vei opp 40 mg streptomycinsulfat på en analytisk vekt. Plasser streptomycinsulfat intoa sterile 15 ml konisk tube. Tilsett 4 ml næringsmedium. Bland innholdet kort på en vortex mixer. Oppløsningen skal være litt rosa. Oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys. Streptomycinsulfat løsningen er stabil i 7 dager.
- Vei opp 20 mg gentamicin sulfat på en analytisk vekt. Plasser gentamicinsulfat inn i et sterilt 15 ml konisk rør. Tilsett 2 ml næringsmedium. Bland innholdet kort på en vortex mixer. Oppløsningen skal være gul. Oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys. Gentamicinsulfat løsningen er stabil i 7 dager.
- Forbered to 200 ml porsjoner av næringsmedium supplert med human rekombinant EGF (10 ng / ml endelig kons.), Insulin (10 ug / ml endelig kons.), Streptomycin-sulfat (100 ug / ml endelig kons.) Og gentamicin-sulfat (20 ug / ml endelig kons.).
- Tilsett 200 ml næringsmedium til et vakuumfilter flaske utstyrt med et 0,2 um filter polyetersulfon kolbe og en 250 ml flaske mottar. Legg 20 &# 181; l arbeider lager EGF, 200 ul stam insulin, 2 ml stam streptomycin sulfat, og 400 ul stam gentamicin sulfat til 200 ml næringsmedium. Feste filteret til en vakuumkolbe. Filtrere mediet. Kast filteret og merke kolben som "næringsrikt medium". Oppbevar ved 4 ° C i opp til 14 dager.
2. Tissue Erverv og innbringende
- I operasjonssalen, vedlikeholde steril teknikk etter anskaffe brystvevet. Plasser brystvevet i et sterilt brett og dekker skuffen med steril plastfolie.
- Transporter vev i dekket skuffen til Radiology / patologi som kreves av din institusjon. Ikke åpne skuffen. Transporttiden varierer innenfor institusjonene. Vev kan være levedyktig i dette dekket skuffen ved RT i opptil 45 minutter etter excision. Men rask behandling av vevet inn næringsrikt medium gir optimale forhold for påfølgende organoid kultur.
- Brutto vev disseksjon å identifisere områder av DCIS i brystvev: Bruk sterile hansker, kniver, skalpeller, vev merking fargestoffer, og eddik under vev disseksjon for å opprettholde vev sterilitet.
- Rengjør arbeidsområde med 70% etanol eller 1% blekemiddel. Åpne sterile hansker og legg hansken wrapper på arbeidsflaten. Plasser sterilt interiør av hansken wrapper forsiden opp. Ta på sterile hansker.
- Rengjøre overflaten av prøven beholder med 70% etanol. Fjern plastinnpakning fra vevet prøvebeholderen og plasser prøven på hansken wrapper.
- Dypp to bomulls tippet spinner inn i vevet merking fargestoff. Anvende fargestoff til overflaten av vevet ved å rulle vattpinner tvers vevsoverflaten.
MERK: Hver patologi avdelingen har en standardisert fargestoff farge / vev orientering protokollen. Tissue er merket med fargestoff for å orientere vevet i forhold til sin posisjon i pasienten. Fargestoffet er utslettet ellermalt på vevet. Ikke hell fargestoffet over vev. Helle fargestoffet kan føre til at fargestoff til å kjøre / drypp i vev sprekker dermed forvirrende orientering kirurgiske marginer. Tissue orientering gir kirurg og patolog med anatomiske landemerker til a) beskrive vevsprøve, og b) bestemme plasseringen av de kirurgiske marginer i forhold til svulsten. - Hell destillert hvit eddik (5% eddiksyre) på steril gas puter. Klatt farget vev med eddik gjennomvåt gasbind. Kast gasbind. Eddik brukes til å fikse vevet merking fargestoffer.
- Skjær brystvevet i vertikale skiver ca 5 mm tykke. Ikke kutt hele veien gjennom vevet (Figur 2). Observer / palpere vevet i områder av forkalkninger. Identifiser DCIS lesjoner ved deres karakteristiske firmaet, blek utseende omgitt av rødlig, gummi grenser som føler modig (på grunn av kalsium spicules).
MERK: I enkelte tilfeller kan comedo (kvise-lignende) områder væresett på som hvite prikker, som representerer nekrotisk materiale fra stor diameter DCIS lesjoner. - Klipp ut deler av DCIS / forkalket brystvev, inkludert en liten mengde av omkringliggende brystvev. Plasser brystvevet i en steril 50 ml tube inneholder 20-30 ml av næringsrikt medium fremstilt i trinn 1.
- Bland vev og mediet ved forsiktig røret ble snudd flere ganger. Kast medium og tilsett friskt medium. Plasser røret som inneholder vev og mediet inn i en isolert beholder og transportere vevet til vevskultur lab.
- Rengjør arbeidsområde med 70% etanol eller 1% blekemiddel. Åpne sterile hansker og legg hansken wrapper på arbeidsflaten. Plasser sterilt interiør av hansken wrapper forsiden opp. Ta på sterile hansker.
3. Tissue Culture
- Arbeider i en biologisk sikkerhetskabinett, hell vev og en liten mengde av næringsmediet i en steril petriskål. Ved hjelp av en steril skalpell kuttet bort og kast bindevev. Skjær brystvevet i biter (organoids) ca 3 mm 2 (figur 1C-D). Prøv å kutte vev slik at hvert organoid inneholder minst en merkbar kanalsegment med omkringliggende stroma.
- Åpne lokket av vevskulturkolbe. Ved hjelp av sterile pinsett eller tang, plasserer organoids inn i kolben. Lukk lokket. Kast petriskål.
- Legg 11 ml serumfritt næringsrikt medium (fremstilt i trinn 1) til vevskulturkolbe. Lukk kolben og virvle kolben så organoids og medium er jevnt fordelt over kolben overflate (figur 1E-F).
- Inkuber i kolben ved 37 ° C i en fuktet 5,0% CO2 atmosfære i 2 dager. Ikke flytt flasken i løpet av denne tiden.
- På dag 2 post inkubasjon, fjern kolben fra inkubator for å se etter potensielle bakterie / soppsporer. Unngå plutselige, skarpe bevegelser, eller virvlende av kolben. Plassere kolben på et invertert mikroskop trinn.
- Observer medium for bakterier, gjær, og / eller sopp. Hvis ingen forurensning er kjent, returnere flasken til inkubatoren for et tilleggitional dag. Hvis forurensing er kjent, kast flasken og innholdet i en egnet beholder.
- På dag 3 innlegg inkubasjon erstatte kondisjonert medium med frisk medium.
- Plasser 11 ml medium i et sterilt rør ved 37 ° C i 20-30 min. Fjern vevskulturkolbe fra inkubatoren. Uten å forstyrre organoids, fjern og kast mediet i kolben ved hjelp av en steril serologisk pipette.
- Ved hjelp av en ny steril serologisk pipette, tilsett 11 ml av forvarmet frisk medium. Meget forsiktig rotere kolben for å fordele mediet over kolben overflate.
- Inkuber i kolben ved 37 ° C i en fuktet 5,0% CO2 atmosfære.
4. Vedlikehold av Etablert Organoid / epitelcelle Colonies
- Forbered fersk medium hver 2. uke og erstatte mediene i vevskulturkolbe 3 ganger per uke.
- Plassere 11 ml av mediet i en steril beholder ved 37° C i 20-30 min. Fjern flasken fra inkubatoren. Ved hjelp av en steril serologisk pipette, fjern og kast kondisjonert medium fra kolben, være forsiktig for ikke å forstyrre organoids.
- Ved hjelp av en ny steril serologisk pipette, tilsett 11 ml av forvarmet frisk medium. Meget forsiktig rotere kolben for å fordele mediet over kolben overflate. Inkuber i kolben ved 37 ° C i en fuktet 5,0% CO2 atmosfære.
- Etter 10 - 14 dager i kultur, fjern eventuelle biter av vev i kulturflaske som ikke er tilhenger.
- Med jevne mellomrom høste celler og / eller organoids fra kolben for forplantning inn i nye dyrkningsflasker, for xenograft transplantasjon, eller for fenotypisk og / eller molekylær analyse.
- Fjern vevskulturkolbe fra inkubatoren. Spray kolben med 70% etanol. Tørk av overflødig etanol på kolbe med et rent papirhåndkle som er fuktet med 70% etanol.
- Organoid forplantning: <ol>
- Åpne lokket av flasken og legg lokket med forsiden opp i den biologiske sikkerhetskabinett. Under mikroskopisk visualisering, finn organoid (e) som skal høstes. Bruk sterile pinsett eller tang for å plukke opp en organoid.
- Å forplante organoid i en ny kultur kolbe, plasserer organoid i den nye kolben. Legg 11 ml frisk, varm medium. Inkuber ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2 atmosfære som beskrevet i trinn 3,3 - 3.6.3. Sett på cellekulturmediet i vevskulturkolbe tre ganger per uke.
- Høsting celler:
- Under direkte mikroskopisk vixualization, forsiktig skrape og aspirer celler og mammospheres bruker en 1000 mL pipette med sterile engangs pipetter. Aspirer cellene og omkringliggende medium. Tilsett celler / medium i en steril mikrosentrifugerør.
- Spin cellene kort i en mini-sentrifuger ved 12 100 xg i 5 sek. Fjern og kast medium. <ol>
- For DNA-analyse, umiddelbart fryse cellepelleten på tørris i et lite volum av medium (10 pl), med langtidslagring ved -80 ° C.
- For proteomikk analyse, lysere cellene i 10 mL av 8 M urea for massespektrometri eller 2x SDS tris-glycinbuffer for vestlige blotting / reversfaseemulsjoner protein mikromatriser. Alternativt kan spinne celler i en cytosentrifuge å foreta celleutstryk for immunhistokjemisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyt for å fremskaffe og dyrking steril bryst duktalt carcinoma in situ vev
Brystvev sterilitet opprettholdes fra operasjonsstuen til cellekultur lab via mindre endringer i typiske sykehus patologi arbeidsflyt (figur 1). Vev blir transportert i en steril beholder med en plastfilm deksel som gjør det mulig radiologisk vurdering og samtidig opprettholde sterilitet vev. Gross vev behandling av et bryst lumpectomy eller mastektomi prøven er utført med sterile hansker, blader, og merking av vev fargestoffer. Brutto morfologisk utseende av brystkreft duktalt carcinoma in situ ligner bleke, litt hevet områder med en hardbarket / fast tekstur, omgitt av rødlig / gul gummiaktig vev. Områder i duktale hyperplasi og DCIS kan føle "modig" og fast på grunn av forkalkninger. Disse områdene av brystvev ofte vises tan eller en litt annen farge enn den omkringliggende brystvevet. Men ADH cen bare skilles etter vev innsamling og patologisk gjennomgang av de fargede vevssnitt. Brystvev forblir levedyktig vev ved å dyppe og / eller ductal organoids i serumfritt næringsmedium supplert med human rekombinant EGF (10 ng / ml), insulin (10 ug / ml), streptomycin-sulfat (100 ug / ml) og gentamicin sulfat (20 pg / ml) 5. Cellekulturflasker med avtagbare / lukkbar lokk tillate periodisk høsting av celler / organoids (figur 1E-F). Denne modellen med hell formeres humane bryst pre-invasive lesjoner fra mer enn 20 pasienter diagnostisert med atypisk duktal hyperplasi (n = 2) og duktalt karsinom in situ (n = 18).
Spontan mammosphere dannelse in vitro og in vivo
Mammospheres og 3-D strukturer oppsto spontant fra flere, uavhengige menneskerettighets DCIS kanal vevfragmenter fra ulike pasienter med diagnosen atypisk ductal hyperplasia eller duktalt carcinoma in situ (figur 3 og 4) 5,9. Enzymatisk forstyrrelse av brystvev ble ikke utført før vevskultur, noe som resulterte i en blandet celletype-kultur. Hverken serum, basalmembranekstrakt, og heller ikke gel-matriser som var nødvendig for spontan mammosphere dannelse (figur 4). De mammospheres generert bryst xenografttumorer i en NOD / SCID mus modell med samme vekstmønster som for invasiv kreft (figur 5) 5. Disse resultatene viser at stamceller med invasiv potensial pre-eksisterer i menneskets bryst DCIS duct men er tydeligvis holdt i sjakk av ductal nisje og kan bli lokket til å dukke opp i organoid kultur. Disse cellene utgjør en ny kategori av bryst stilk-lignende celler som eksisterer forut for utilslørt manifestasjon av invasiv fenotype 5,9,10.
Bekreftelse av epitel avledet mammospheres og xenografts
De mammospheres og xenotransplantater avledet fra mammospheres ble bekreftet ved immunfluorescens som å ha epitel-opprinnelse. Epithelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) er en membran glykoprotein uttrykt på epitelceller 11. Immunfluorescens med et muse-monoklonalt antistoff som er reaktivt med humant EpCAM (grønn) og en nukleær flekk (DAPI, blå) viste EpCAM-positive celler i mammospheres i kultur (figur 6A) og sentrum av en NOD / SCID xenograft (figur 6B).
Verifikasjon av intakt kjelleren membran grenser
Den mammosphere forming, neoplastiske epitelceller i denne kulturen systemet ble hentet fra pre-invasive brystlesjonene som var blottet for frank invasjon eller microinvasion, som bekreftet av uavhengige patologisk analyse i henhold standard of care histopathologic diagnose. Flere organoid strukturer fra samme pasient generert mammosphere forming kolonier som viste seg å være tumorigent. I tillegg histopatologisk undersøkelse av vev som brukes for organoid konfluente kulturen viste intraductal lesjoner med intakt basalmembran grenser (figur 7B) 5. Det kan således konkluderes med at den spontane mammospheres dannet i dette kultursystem er utledet bare fra pre-neoplastiske invasive områder og er ikke et produkt av sjeldne områder av microinvasion 5.
Figur 1. Arbeidsflyt for å opprettholde vev sterilitet under radiologisk avbildning og brutto vev disseksjon. (A) I operasjonssalen, er brystvevet (lumpectomy prøven vist) plassert i et sterilt brett og dekkes med sterile plastfolie. Vevet kan avbildes direkte i plast skuffen. (B) Tissue innbringende å identifisere områder av DCIS. Engangsbruk vev orienteringsfargestoffer er malt på vevet overflaten ved hjelp av steril bomull tippet vattpinner. Husholdningen destillert hvit eddik helles direkte på vevet og blottet med sterilt bomullsgas. (C & D) Brystvev transporteres til vevskultur lab i næringsrikt medium supplert med antibiotika. Tissue disseksjon, å isolere de områdene av DCIS, er utført ved hjelp av sterile hansker og blader / skalp / saks. Den DCIS vevet er kuttet i flere organoids for kultur. (E & F) In vitro kultur av bryst organoids. Humant vev DCIS er plassert direkte i vevsdyrkingskolber med avtagbare lokk, uten forutgående enzymatisk fordøyelse av vevet. En minimal mengde av serumfritt kulturmedium supplert med epidermal vekstfaktor og insulin støtter cellevekst og samtidig opprettholde en luft-væske-grenseflate rundt organoid.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Illustrasjon av brutto vev behandling for brystkreft DCIS vevet. Den lumpectomy eller mastektomi vev er skåret i tynne seksjoner ved å skjære vevet vertikalt uten å kutte helt gjennom prøven. Denne disseksjonen metoden er ofte referert til som "brød brød teknikken", siden kuttet vev ligner et brød. Området (e) mistenkt for å inneholde DCIS er skåret ut og kuttet i 2-3 mm skiver for diagnostisk patologi og organoid kultur.
Figur 3. En blandet celletype kulturopprettholder representative in vivo cellepopulasjoner. (A) Fase kontrastrikt bilde av blandet cellekultur som genereres fra bryst DCIS lesjoner over 11 uker (4X forstørrelse). (B og C) In vitro organoid dyrking hell forplantet DCIS avledet epitelceller med forankringsuavhengig vekst, definert som oppover vokser og vokser mammospheres og Lobulær, duct-lignende 3D-formasjonene, i serumfritt medium supplert med EGF, insulin, streptomycin og gentamicin (10X forstørrelse). (D) Eksempel mammosphere dannet etter 11 uker i kultur (40X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Spontandannelse av mammospheres i serumfritt organoid kultur. Et eksempel mammosphere dannelse etter 33 dager med kultur (10X forstørrelse, 20X innfelt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. NOD / SCID mus xenograft modell. Xenografter ble generert ved å injisere epitelceller avledet fra en pasient diagnostisert med DCIS (mus akkurat melkefettpute) eller fra en pasient diagnostisert med invasiv DCIS (musen til venstre bryst fett pad). Xenografter avledet fra både ren DCIS og invasiv DCIS avslørte en lignende vekstmønster og hastighet. Klikk her for å se en større versjon av thans figur.
Figur 6. Mammospheres er bekreftet å være av epitelial opprinnelse. Immunofluorescens med anti-EpCAM konjugert til FITC ble benyttet for å bekrefte epitelisk opprinnelse mammospheres og muse xenotransplantater generert fra bryst kanaler som inneholder DCIS. (A) EpCAM-FITC-positive celler (pseudo- farget grønn, 488 nm) ble bare sett i mammospheres av de blandede cellekulturer som kommer fra bryst organoids (DAPI (pseudo-farget blå, 408 nm) atom flekken). (B) I formalinfiksert parafin innebygd mus xenograft vevssnitt, EpCAM positive Cellene ble bare detektert i midten av tumor xenograft delen. (20X forstørrelse) Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
Figur 7. Kollagen IV immunhistokjemi avslører intakte basalmembranene rundt kanaler. Normale bryst kanaler (A) er omgitt av intakte basalmembranene beriket i kollagen IV (diaminobenzidin = brune flekker). Etter organoid kultur, inneholder brystvev også intakte basalmembranene bekrefter at mammospheres er hentet fra områder av DCIS og ikke fra invasiv kreft (kollagen IV immunhistokjemi, panel A 4X forstørrelse, panel B 10X). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen systemet beskrevet her utgjør en ny modell for å generere levende pre-invasive neoplastiske bryst celler for grunnleggende og translasjonsforskning studier. I det siste har pre-ondartet brystkreft progresjon vanligvis blitt studert ved hjelp av tre forskjellige metoder. Den første metoden er histopatologisk og genetisk analyse av frosne microdissected eller faste humane prøvene 12-14. Den andre metoden benytter musemodeller som inneholder hyperplastiske alveolære knuter (HAN lesjoner) som er tenkt å være lik menneske pre-invasive brystlesjonene 15. Den tredje modellen benytter etablert brystkreft cellelinjer som MCF7 underlinjer (MCF10A) som har en svært differensierte DCIS som morfologi 3,4. Selv om disse tre modellene har gitt molekylledetråder til brystkreft progresjon, er ingen av disse fremgangsmåter er i stand til å vurdere maligne potensial eller den molekylære fenotype i en individuell pasients lesjon (er). Histopathologic analyse gir ikke informasjon om funksjonell fenotype av cellene i de pre-invasive lesjoner. Musemodell av brystkreft progresjon kan ikke nøyaktig gjenspeile histomorphology og mangfoldet av menneskelig atypisk duktal hyperplasi, lobular carcinoma in situ, og duktalt carcinoma in situ 16-18. Videre er det stromale mikromiljøet, og avsetning av ekstracellulær matriks som omgir mus forløper-lesjoner er markert forskjellig fra den humane motstykke 16. Spontane murine precursor lesjoner kan fremvise et svært lavt nivå av progresjon til invasjon og metastasering. Den tredje metoden, dyrkede cellelinjer, kan gi funksjonelle fenotypiske informasjon bare hvis transplantert inn immun undertrykte verter 3,4. I tillegg de genetiske abnormiteter i en lang passaged cellelinje kan ikke representere spontane brystkreft progresjon hos mennesker 2. Til slutt er det vel etablert at hver pasients neoplasmehar en unik kombinasjon av genetiske og epigenetiske forandringer som driver veksten, differensiert tilstand, og progresjon til invasjon og metastase 13,14,17. Menneske pre-invasive lesjoner er multifokal og heterogen i celle sammensetning og histomorphology. Videre er den biologiske ondartet ukjent potensiale for en individuell pasient pre-invasiv lesjon.
Vårt primære vev kultur metoden overvinner de mangler av tidligere modeller av menneskelig pre-invasiv brystkreft og gir følgende fordeler: 1) organoid kultur systemet støtter veksten av neoplastiske cellepopulasjoner innenfor de innfødte vevet mikromiljøet som spontant vokse og generere mammospheres som vil produsere invasive svulster i mus xenograft modeller. Cellene representerer genotype og fenotype av den enkelte pasient, og dermed gi informasjon for personlig terapi, eller individuell prognose. 2) Den organoid kultur system maintains de native cellulære underpopulasjoner og tilveiebringer et middel for å dyrke ikke-maligne epitelceller, stromale celler og immunceller som opprinnelig er tilstede i den primære brystvevet, og føres inn i kulturen i organoid. Den lave volum av mediet i kultursystemet støtter oksygen utveksling oppmuntrende mammosphere spontan dannelse og differensiert kanalen og alveoli lignende strukturer uten behov for en kunstig tredimensjonal stillas. 3) Den primære cellekultur er fri for modifikasjoner og valg generert av enzymatisk dissosiasjon eller eksogene genmodifisering. Videre er næringsmediet lave kostnader og enkel å fremstille. 4) molekylær og genetisk analyse kan gjennomføres på bestemte cellepopulasjoner og / eller organoids fra kultur på ulike tidspunkter uten å forstyrre hele kulturen. 5) Den organoid kultur-systemet gir vekst, differensiert morfologi og celle-celle interaksjoner av de innfødte cellepopulasjoner som kanbli studert før og etter innføring av terapeutiske midler i kulturmediet.
Selv om det primære vevskultur har visse fordeler, er det ikke uten begrensninger. Den organoid kultur støtter veksten av blandede cellekulturer, uten å overvekst av en hvilken som helst celletype. Imidlertid kan forholdet av den spesifikke celletyper ikke kan kontrolleres, og dermed kan ikke rekapitulere de nøyaktige celleforhold som finnes in vivo. Vellykket organoid dyrking krever sterilt vev innsamling og prosessering, som begge er ikke rutinemessige prosedyrer i mange samfunn sykehus patologi laboratorier. God kommunikasjon mellom de kliniske forskere, kirurgisk personale og patologi ansatte er avgjørende for å opprettholde sample sterilitet innen kontinuum av pasientbehandlingen.
En ytterligere begrensning av organoid kultur er effekten av grunnen fasthet på cellulær fenotype og genekspresjon 16,19. Differensiering av stamceller i kulturkan induseres ved tilsetning av serum-inneholdende medium, eller kan være på grunn av forlenget tid i kultur. En stamme-lignende fenotype ble opprettholdt etter flere måneder i denne ikke-enzymatisk, serum-free organoid kultur system 5. Men på et tidspunkt, kan cellene skille som kan sees morfologisk - cellene blir mindre og tettere, og ikke klarer å danne mammospheres. For å unngå potensielle problemer med endringer i cellefenotype over tid, molekylær eksperimenter, som for eksempel transfections eller slå ned analyser, bør utføres med små kulturer heller enn med gamle kulturer (mer enn 6 måneder).
Nøklene til suksess organoid kultur bruker en passende volum av medium i kulturflaske, og la organoids tid til å følge den vevskulturkolbe. Overskudd av medium i kolben grenser oksygendiffusjon, inhibering mammosphere dannelse. De første 3-7 dagene av vev kultur er avgjørende for organoids å feste til tissaksøke kultur kolbe. Generelt, hvis en ikke har organoid festet ved dag 14, det sannsynlig ikke inneholder noen levedyktige DCIS ductal segmenter, og vil ikke bli vedheftende. Organoids som ikke er vedheftende ved dag 14 bør fjernes fra kulturen. Mangelen på levedyktig bryst DCIS kanaler kan verifiseres etter kultur ved å feste organoid i 10% formalin og behandling vevet inn i parafinblokker for vev farging og mikroskopisk vurdering.
Våre ikke-enzymatisk, serum-frie kulturen system funnene støtter hypotesen om at genetisk unormale neoplastiske forløperceller med invasiv potensial eksisterer innenfor pre-invasive menneskelig brystlesjonene 5,9,20. Dette funnet er i tråd med tidligere arbeid av Sgroi et al., Som har utført genetisk analyse av menneskelige brystkreft pre-invasive lesjoner og Damonte et al. Som studerte bryst intraepitelial neoplasi utvekst (MINO) murine modell av brystkreft progresjon 12,14 , 21. Tatt together med konklusjonene fra andre, støtter vår kultur modell av enkelte pasients pre-invasive lesjoner konseptet at den aggressive fenotype av en pasients invasiv brystkreft kan være i stor grad forhåndsbestemt på pre-invasive scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av (1) Department of Defense Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) award # W81XVVH-10-1-0781 til LAL og VE, og (2) Susan G. Komen Foundation stipend IR122224446 i Lal og VE. Patologi støtte og vev innbringende ble vennlig levert av Inova Fairfax Pathology avdeling, Dr. Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, og Dr. Charles Bechert. Pasientsamtykke og prøve anskaffelser ble fagmessig guidet av Inova Fairfax Hospital klinisk forskningskoordinatorer Holly Gallimore, Heather Huryk, og Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
