Summary
Primær cellekultur anvendelse af intakte væv organoids tilvejebringer en model, der efterligner den flercellede in vivo mikromiljø. Vi udviklede en serum-frit primær brystepitel vævskultur model, der foreviger blandede cellekultur slægter og udstillinger differentierede morfologi, uden enzymatisk vævssprængning. Breast organoids forbliver levedygtige i> 6 måneder.
Abstract
Breast duktalt carcinoma in situ (DCIS), per definition, er proliferation af neoplastiske epitelceller inden for rammerne af brystet kanalen, uden at bryde kollagenøse basalmembran. Mens DCIS er en ikke-obligat forløber for invasiv brystcancer, er de molekylære mekanismer og cellepopulationer, der tillader progression til invasiv cancer ikke helt kendt. At afgøre, om progenitorceller i stand til invasion eksisterede inden for DCIS cellepopulation, har vi udviklet en metode til indsamling og dyrkning sterilt humant brystvæv på tidspunktet for kirurgi, uden enzymatisk afbrydelse af væv.
Steril brystvæv indeholdende duktale segmenter høstes fra kirurgisk udskåret brystvæv efter rutinemæssig patologisk undersøgelse. Væv indeholdende DCIS er placeret i næringsrige, antibiotika-holdige, serumfrit medium, og transporteres til vævskulturlaboratorium. Brystvævet er yderligere dissected at isolere de forkalkede områder. Flere brystvæv stykker (organoids) er anbragt i et minimalt volumen af serumfrit medium i en kolbe med et aftageligt låg og dyrket i en befugtet CO2-inkubator. Epiteliale og fibroblast cellepopulationer dukke op fra organoide efter 10-14 dage. Mammospheres danner spontant på og omkring epitelcelle monolag. Specifikke cellepopulationer kan høstes direkte fra kolben uden at forstyrre naboceller. Vores ikke-enzymatisk vævskultursystem pålideligt afslører cytogenetisk unormale, invasive progenitorceller fra friske humane DCIS læsioner.
Introduction
Proliferation af epitelceller inden for rammerne af bryst kanaler og alveoler (duktalt carcinoma in situ) er anerkendt som en obligat forløber for invasiv duktalt og luftrør bryst carcinom. Ikke desto mindre er de molekylære mekanismer og cellepopulation dynamik, der tillader progression til invasiv cancer dårligt forstået. Belyse overlevelse mekanismer, der anvendes ved præ-invasive brystcarcinomaceller eller enhver pre-invasiv tumor, kan afsløre terapeutiske strategier til at dræbe, eller endog forhindre, præ-invasive neoplasmer 1. Imidlertid har enkle og billige metoder til funktionelt studerer humane præ-invasive læsioner har manglet. Selv om in vitro monolagskultur af transformerede cellelinier er en etableret laboratoriemetode, fænotype og genotype af disse immortaliserede cellelinjer ikke rekapitulere den molekylære status af primære humane tumorceller 2. Selv ikke-tumorigene MCF-10A-cellelinie, som recapitulates 3-D brystkirtel arkitektur, ikke i tilstrækkelig grad repræsenterer den funktionelle fænotype og molekylære karakteristika af en enkelte patients præ-invasive brystlæsion 3,4.
At afgøre, om stamceller-lignende neoplastiske celler i stand til invasion eksisterede inden duktalt carcinom in situ (DCIS) cellepopulation, har vi udviklet en metode til indsamling og dyrkning sterilt humant brystvæv på tidspunktet for kirurgi (figur 1) 5. Vores ex vivo bryst organoide dyrkningssystem ikke stole på enzymatisk vævssprængning, basalmembran ekstrakt matrix eller fibroblast ozonlaget, til isolering og plantemateriale mammosphere-dannende celler fra frisk bryst duktalt human carcinom væv 6-8. Vores nye system er baseret på princippet om celle streaming / migration 5. De mærkbare bryst kanaler, og de omkringliggende stroma er nedsænket i et minimalt volumen af serum-frit næringsstof medium (bare enough at dække kanal- fragmenter) for at maksimere gasudveksling med snitfladen af kanalen udsættes til dyrkningsmediet, men ingen specifik orientering i kolben (figur 1E-F). Dette dyrkningssystem tillader celler at migrere ud af kanalen og ind i / på autologe stroma og dyrkningskolbe. Næringsmediet, kun suppleres med epidermal vækstfaktor (EGF), insulin og antibiotika, understøtter vækst af blandede cellepopulationer hidrørende fra organoide. Vævsdyrkningskolben har en aftagelig, genlukkelig låg, der gør det muligt for organoids og / eller celler, der skal høstes uden at forstyrre hele kolbe eller nærliggende organoids, og samtidig opretholde et sterilt fugtigt miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brystvæv Humant blev indsamlet fra patienterne i en undersøgelse, med skriftligt informeret samtykke, efter Department of Defense, George Mason University, og Inova Health System Institutional Review Board godkendte protokoller.
1. Forbered næringsrige Medium med vækstfaktorer og Antibiotika
- Forbered stamopløsninger af insulin, epidermal vækstfaktor (EGF), streptomycinsulfat og gentamicin sulfat.
- Rekonstituere insulin i sterilfiltreret vand til en slutkoncentration på 10 mg / ml. Aspirer 10 ml Type 1 reagenskvalitet vand i en steril 10 ml engangssprøjte. Vedhæft et 0,22 um polyethersulfon filter til sprøjten. Dispensere sterilfiltreret vand i en steril 15 ml konisk rør.
- Der tilsættes 10 ml sterilt filtreret vand til en 100 mg hætteglas med insulin. Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Hold insulinhætteglasset på is. Dispensér 450 pi af insulin lager Solution i mærkede, sterile mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C. Insulin stamopløsning er stabil indtil udløbsdatoen på hætteglasset.
- Forberede stamopløsning af epidermal vækstfaktor (EGF): Tilsæt 500 pi sterilt vand til 500 ug EGF (lager 1 pg / pl). Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Opbevar hætteglasset EGF på is.
- Forbered en arbejdsgruppe stamopløsning af EGF: Tilsæt 100 pi af bestanden EGF løsning til 900 pi næringsstof medium (arbejder bestand vil være 0,1 ug / ul). Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Dispensér 50 pi af EGF arbejder stamopløsning i mærkede, sterile mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
BEMÆRK: EGF-stamopløsning (1 ug / ul) er stabil i 1 år ved -80 ° C; arbejder stamopløsning (0,1 pg / pl) er stabil i 2 måneder ved -80 ° C.
- Forbered en arbejdsgruppe stamopløsning af EGF: Tilsæt 100 pi af bestanden EGF løsning til 900 pi næringsstof medium (arbejder bestand vil være 0,1 ug / ul). Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Dispensér 50 pi af EGF arbejder stamopløsning i mærkede, sterile mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
- 40 mg streptomycinsulfat afvejes på en analytisk balance. Placer streptomycinsulfat intoa sterile 15 ml koniske rør. Tilsæt 4 ml næringssubstrat. Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Opløsningen skal være en anelse lyserød. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys. Streptomycinsulfat opløsning er stabil i 7 dage.
- 20 mg gentamicin sulfat afvejes på en analytisk balance. Placer gentamicin sulfat i en steril 15 ml konisk rør. Tilsæt 2 ml næringssubstrat. Blande indholdet kortvarigt på en vortex-blander. Opløsningen skal være gul. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys. Gentamicin sulfat opløsning er stabil i 7 dage.
- Forberede to 200 ml portioner af næringsmedium suppleret med humant rekombinant EGF (10 ng / ml slutkoncentration.), Insulin (10 ug / ml slutkoncentration.), Streptomycin-sulfat (100 ug / ml slutkoncentration.) Og gentamicin sulfat (20 ug / ml slutkoncentration.).
- Tilsæt 200 ml næringsmedium til et vakuumfilter kolbe udstyret med en 0,2 um polyethersulfon filter kolbe, og en 250 ml modtagende flaske. Tilsæt 20 &# 181; l arbejdslager EGF, 200 pi stock insulin, 2 ml stock streptomycinsulfat og 400 pi stock gentamicinsulfat til 200 ml næringsmedium. Filteret kolben Vedhæft til et vakuum. Filtrere mediet. Kassér filter og mærke kolben som "næringsrige medium". Opbevar ved 4 ° C i op til 14 dage.
2. Tissue Erhvervelse og opregning
- I operativsystemet suite opretholde steril teknik efter fremskaffelse brystvæv. Placer brystvæv i en steril bakke og dække bakken med sterile plastic wrap.
- Transporter væv i overdækket bakke til Radiologi / Patologi som krævet af din institution. Du må ikke åbne skuffen. Transporttider variere inden institutionerne. Væv kan forblive levedygtig i denne overdækket bakke ved stuetemperatur i op til 45 minutter efter excision. Men hurtig behandling af vævet i næringsrige medium giver optimale betingelser for efterfølgende organoide kultur.
- Gross væv dissektion at identificere områder af DCIS i brystvævet: Brug sterile handsker, knive, skalpeller, væv mærkning farvestoffer og eddike i løbet af væv dissektion at bevare væv sterilitet.
- Rengør arbejdsområdet med 70% ethanol eller 1% blegemiddel. Åbn sterile handsker og placere handsken wrapper på arbejde overflade. Placer den sterile indre af handsken wrapper opad. Sætte på sterile handsker.
- Rengør overfladen af prøven beholder med 70% ethanol. Fjern plastikfolie fra vævsprøven container og placere prøven på handsken indpakning.
- Dyp to bomuld tippes svaberprøver ind i vævet mærkning farvestof. Anvende farvestoffet på overfladen af vævet ved rullende svaberprøver tværs af vævsoverfladen.
Bemærk: Hver patologi afdeling har et standardiseret farvestof farve / væv orientering protokollen. Væv er mærket med farvestof til at orientere det væv i forhold til dens position i patienten. Farvestoffet blottes ellermalet på vævet. Hæld ikke farvestoffet over vævet. Hælde farvestoffet kan forårsage farvestoffet køre / drop i væv sprækker således forvirrende orienteringen af kirurgiske margener. Tissue orientering giver kirurgen og patolog med anatomiske kendetegn til a) beskrive vævsprøve, og b) at bestemme placeringen af de kirurgiske margener i forhold til tumoren. - Hæld destilleret hvid eddike (5% eddikesyre) på sterile gazetamponer. Dup farvet væv med eddike gennemblødt gaze. Kassér gaze. Eddike anvendes til at fiksere væv mærkning farvestoffer.
- Skær brystvæv i lodrette skiver ca. 5 mm tyk. Ikke skære hele vejen gennem væv (figur 2). Observere / palpere væv for områder af forkalkning. Identificer DCIS læsioner ved deres karakteristiske fast, bleg udseende omgivet af rødlig, gummiagtige grænser, der føler grynet (grundet calcium spikler).
BEMÆRK: I nogle tilfælde kan comedo (bums-lignende) områderses som hvide prikker, der repræsenterer nekrotisk materiale fra store diameter DCIS læsioner. - Skåret ud områder af DCIS / forkalkede brystvæv, herunder en lille mængde af omgivende brystvæv. Placer brystvæv i et sterilt 50 ml rør indeholdende 20-30 ml næringsrige medium fremstillet i trin 1.
- Bland væv og medium ved forsigtigt at vende røret flere gange. Kassér medium og tilsæt frisk medium. Placer røret indeholdende væv og medium i en isoleret beholder og transportere vævet til vævskultur lab.
- Rengør arbejdsområdet med 70% ethanol eller 1% blegemiddel. Åbn sterile handsker og placere handsken wrapper på arbejde overflade. Placer den sterile indre af handsken wrapper opad. Sætte på sterile handsker.
3. Tissue Culture
- Arbejde i et biologisk sikkerhedsskab, hæld vævet og en lille mængde af næringsmediet i en steril petriskål. Med en steril skalpel skæres væk og kassér fibrøst væv. Skær brystvæv i stykker (organoids) ca. 3 mm 2 (figur 1C-D). Forsøge at skære vævet, således at hvert organOID indeholder mindst ét mærkbar kanalsegmentet med omgivende stroma.
- Åbne låget vævsdyrkningskolben. Anvendelse af sterile pincetter eller tænger placere organoids ind i kolben. Luk låget. Kassér petriskål.
- Tilføje 11 ml serumfrit næringsrige medium (fremstillet i trin 1) til vævskulturkolbe. Luk og kolben hvirvle så organoids og medium er jævnt fordelt over kolben overflade (Figur 1E-F).
- Inkubér kolbe ved 37 ° C i en befugtet 5,0% CO2-atmosfære i 2 dage. Kolben Flyt ikke i løbet af denne tid.
- På dag 2 efter inkubation fjernes kolben fra inkubatoren for at kontrollere for potentielle bakteriel / svampekontaminering. Undgå pludselige, skarpe bevægelser, eller hvirvlende af kolben. Anbring kolben på et omvendt mikroskop fase.
- Observere medium for bakterier, gær og / eller svamp. Hvis ingen forurening bemærkes kolben tilbage til inkubatoren i en addligere dag. Hvis forurening konstateres, kolben og indholdet i en passende beholder kasseres.
- På dag 3 efter inkubation erstatte det konditionerede medium med frisk medium.
- Placer 11 ml medium i et sterilt rør ved 37 ° C i 20-30 min. Fjern vævsdyrkningskolben fra inkubatoren. Uden at forstyrre organoids, fjern og kassér medium i kolben ved hjælp af en steril serologisk pipette.
- Ved anvendelse af en ny steril serologisk pipette tilsættes 11 ml af det foropvarmede frisk medium. Meget forsigtigt rotere kolben til at distribuere mediet tværs kolben overflade.
- Inkubér kolbe ved 37 ° C i en befugtet 5,0% CO2-atmosfære.
4. Vedligeholdelse af Etablerede organoide / epitelcelletyper Kolonier
- Forbered frisk medium hver 2 uger og erstatte mediet i vævskulturkolbe 3 gange om ugen.
- Placer 11 ml medium i en steril beholder ved 37° C i 20-30 min. Kolben fjernes fra inkubatoren. Ved hjælp af en steril serologisk pipette til at fjerne og kassere det konditionerede medium fra kolben, og pas på ikke at forstyrre organoids.
- Ved anvendelse af en ny steril serologisk pipette tilsættes 11 ml af det foropvarmede frisk medium. Meget forsigtigt rotere kolben til at distribuere mediet tværs kolben overflade. Inkubér kolbe ved 37 ° C i en befugtet 5,0% CO2-atmosfære.
- Efter 10-14 dage i kultur, fjerne nogen stykker af væv i dyrkningskolben, der ikke er tilhænger.
- Periodisk høst celler og / eller organoids fra kolben til formering i nye dyrkningskolber, for xenograft transplantation, eller for fænotypisk og / eller molekylær analyse.
- Fjern vævsdyrkningskolben fra inkubatoren. Spray kolben med 70% ethanol. Tør overskydende ethanol på kolben med en ren papirserviet, der er blevet sprøjtet med 70% ethanol.
- Organoide formering: <ol>
- Åbn låget af kolben og læg låget forsiden op i den biologiske sikkerhed kabinet. Under mikroskopisk visualisering, find organoide (r), der skal høstes. Brug sterile pincet eller tang til afhentning en organoide.
- At udbrede organoide i en ny kultur, anbringes det organoide i den nye kolbe. Tilføje 11 ml frisk, varmt medium. Der inkuberes ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-atmosfære som beskrevet i trin 3.3 - 3.6.3. Erstatte cellekulturmediet i vævskulturkolben tre gange om ugen.
- Høst celler:
- Under direkte mikroskopisk vixualization forsigtigt skrabe og aspiratprøver celler og mammospheres hjælp af en 1.000 pi pipette med sterile engangssprøjter pipettespidser. Aspirere cellerne og omgivende medium. Doser celler / medium i en steril mikrocentrifugerør.
- Spin cellerne kortvarigt i en mini-centrifuge ved 12.100 xg i 5 sek. Fjern og kassér medium. <ol>
- Til DNA-analyse, straks fryse cellepelleten på tøris i et lille volumen af medium (10 pi) med lang tids opbevaring ved -80 ° C.
- Til proteomanalyse, lysere cellerne i 10 pi 8 M urinstof til massespektrometri eller 2x SDS tris-glycin-puffer for western blotting / omvendt fase-protein microarrays. Alternativt spinde celler i en cytocentrifuge at celleudstrygningspræparater til immunhistokemisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow for indkøb og dyrkning steril bryst duktalt carcinoma in situ væv
Brystvæv sterilitet opretholdes fra operationsstuen til cellekultur laboratorium via mindre ændringer i typisk hospital patologi workflow (Figur 1). Væv transporteres i en steril beholder med en plastfilm dæksel, der tillader radiologisk vurdering samtidig bevare væv sterilitet. Gross vævsbehandling af et bryst lumpektomi eller mastektomi prøve udføres med sterile handsker, vinger og væv mærkning farvestoffer. Gross morfologisk udseende bryst duktalt carcinoma in situ ligner blege, let hævede områder med et grynet / fast konsistens, omgivet af rødlig / gul gummiagtig væv. Områder i duktal hyperplasi og DCIS kan føle "grynet" og fast grund forkalkninger. Disse områder af brystvæv ofte forekommer tan eller en lidt anderledes farve end den omgivende brystvæv. Men ADH cen kun skelnes efter væv indsamling og patologisk gennemgang af de farvede vævssnit. Brystvæv forbliver levedygtig ved at nedsænke væv og / eller duktale organoids i serumfrit næringsmedium suppleret med humant rekombinant EGF (10 ng / ml), insulin (10 ug / ml), streptomycinsulfat (100 ug / ml) og gentamicin sulfat (20 ug / ml) 5. Celledyrkningskolber med aftagelige / genlukkelig låg tillader periodisk høst af celler / organoids (Figur 1E-F). Denne model held opformeret humane bryst pre-invasive læsioner fra mere end 20 patienter diagnosticeret med atypisk duktal hyperplasi (n = 2) og duktalt carcinom in situ (n = 18).
Spontan mammosphere dannelse in vitro og in vivo
Mammospheres og 3-D strukturer opstod spontant fra flere uafhængige humane DCIS ventilationskanal vævsfragmenter fra forskellige patienter diagnosticeret med atypisk ductal hyperplasia eller duktalt carcinoma in situ (figur 3 & 4) 5,9. Enzymatisk afbrydelse af brystvæv blev ikke udført forud for vævskultur, hvilket resulterede i et blandet celletype kultur. Hverken serum, basalmembran ekstrakt eller gel-lignende matricer var nødvendige for spontan mammosphere dannelse (figur 4). De mammospheres genereret mamma xenotransplantattumorer i NOD / SCID musemodel med samme vækstmønster som af invasiv cancer (figur 5) 5. Disse resultater viser, at progenitorceller med invasiv potentiale forud findes inden for humane bryst- DCIS kanal, men tilsyneladende holdes i skak af duktalt niche og kan lokkes at dukke op i organoide kultur. Disse celler udgør en ny kategori af brystkræft stamceller-lignende celler, der eksisterer forud for den åbenlyse manifestation af den invasive fænotype 5,9,10.
Bekræftelse af epitelial afledte mammospheres og xenografts
De mammospheres og xenotransplantater afledt af mammospheres blev bekræftet ved immunofluorescens som havende epitelial oprindelse. Epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er en membran glycoprotein udtrykt på epitelceller 11. Immunofluorescens med et monoklonalt muse-antistof, der reagerer med human EpCAM (grøn) og en nuklear farvning (DAPI, blue) viste EpCAM-positive celler i mammospheres i kultur (figur 6A) og centrum af NOD / SCID xenograft (figur 6B).
Verifikation af intakt basalmembran grænser
Den mammosphere formgivning, neoplastiske epitelceller i denne kultur-systemet blev afledt fra præ-invasive bryst læsioner, der var blottet for frank invasion eller microinvasion, som verificeret af uafhængige patologisk analyse under standard for pleje histopatologisk diagnose. Flere organoide strukturer fra den samme patient genererede mammosphere forMing kolonier, der viste sig at være tumorigen. Desuden histopatologisk undersøgelse af væv, der anvendes til organoide kultur afslørede sammenflydende intraduktal læsioner med intakt basalmembran grænser (figur 7B) 5. Således kan det konkluderes, at de spontane mammospheres dannet i denne kultur-systemet kun er afledt fra præ-invasive neoplastiske områder og er ikke et produkt af sjældne områder microinvasion 5.
Figur 1. Workflow for at opretholde væv sterilitet under radiologisk billeddannelse og grov væv dissektion. (A) På operationsstuen suite, er brystvæv (lumpektomi prøve vist) anbringes i en steril bakke og dækket med sterile plastic wrap. Vævet kan afbildes direkte i plastbakke. (B) Tissue ekstrapolation at identificere områder af DCIS. Engangsbrug væv orientering farvestoffer er malet på vævet overflade ved hjælp af sterile bomuld tippes svaberprøver. Husstand destilleret hvid eddike hældes direkte på væv og blottet med steril bomuldsgaze. (C & D) Brystvæv transporteres til vævskultur lab i næringsrigt medium suppleret med antibiotika. Væv dissektion for at isolere de områder af DCIS, udføres under anvendelse af sterile handsker og klinger / skalpeller / saks. DCIS væv skæres i flere organoids for kulturen. (E & F) In vitro kultur af bryst organoids. Human DCIS væv er placeret direkte i vævskulturkolber med aftageligt låg, uden forudgående enzymatisk fordøjelse af væv. En minimal mængde af serumfrit dyrkningsmedium suppleret med epidermal vækstfaktor og insulin understøtter cellevækst samtidig opretholde en luft-væske-grænseflade omkring organoide.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Illustration af grov vævsbehandling for brystkræft DCIS væv. Den lumpektomi eller mastektomi væv skæres i tynde sektioner ved skæring af væv lodret uden at skære hele vejen igennem prøven. Denne dissektionsmetoden omtales ofte som "brød brødet teknik", da det afskårne væv ligner et brød. Område (r) mistænkes for at indeholde DCIS skæres ud og skåret i 2 - 3 mm skiver til diagnostisk patologi og organoide kultur.
Figur 3. En blandet celletype kulturfastholder repræsentant in vivo cellepopulationer. (A) Fase kontrast billede af blandet cellekultur genereret fra bryst DCIS læsioner over 11 uger (4X forstørrelse). (B & C) in vitro organoide dyrkning held opformeret DCIS afledte epitelceller med forankringsuafhængig vækst, defineret som opadgående voksende og ekspanderende mammospheres og splittet, kanal--lignende 3-D formationer i serumfrit medium suppleret med EGF, insulin, streptomycin og gentamicin (10X forstørrelse). (D) Eksempel mammosphere dannet efter 11 uger i kultur (40X forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Spontandannelse af mammospheres i serum fri organoide kultur. Et eksempel mammosphere formation efter 33 dages kultur (10x forstørrelse, 20X indsat). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. NOD / SCID mus xenograft model. Xenotransplantater blev genereret ved injektion af epitelceller afledt fra en patient diagnosticeret med DCIS (musen til højre brystfedtpude) eller fra en patient diagnosticeret med invasiv DCIS (mus venstre brystfedtpude). Xenotransplantater afledt fra både ren DCIS og invasive DCIS afslørede en lignende vækst mønster og hastighed. Klik her for at se en større udgave af thans figur.
Figur 6. Mammospheres er bekræftet at være af epitelial oprindelse. Immunofluorescens med anti-EpCAM konjugeret til FITC blev anvendt til at bekræfte epitel oprindelse mammospheres og mus xenotransplantater genereret fra bryst kanaler indeholdende DCIS. (A) EpCAM-FITC positive celler (pseudo- farvet grøn, 488 nm) blev kun set i mammospheres af de blandede cellekulturer stammer fra bryst organoids (DAPI (pseudo-farvet blå, 408 nm) nuklear plet). (B) I formalinfikserede paraffinindlejrede mus xenograft vævssnit EpCAM positive celler blev kun fundet i midten af xenograft tumor sektion. (20X forstørrelse) Klik her for at se en større version af denne figure.
Figur 7. Collagen IV immunhistokemi viser intakte basalmembraner omgivende kanaler. Normale bryst kanaler (A) er omgivet af intakte basalmembraner beriget med collagen IV (diaminobenzidin = brun farvning). Efter organoide kultur, brystvæv indeholder også intakte basalmembraner bekræfter, at mammospheres stammer fra områder i DCIS og ikke fra invasiv cancer (kollagen IV immunhistokemi, panel A 4X forstørrelse, panel B 10X). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen heri beskrevne udgør en ny model til at generere levende præ-invasive neoplastiske brystceller for basale og translationelle forskningsundersøgelser. Tidligere har præmaligne brystkræft progression typisk blevet undersøgt under anvendelse af tre forskellige metoder. Den første metode er det histopatologiske og genetisk analyse af Mikrodissekterede frosne eller fikserede humane prøver 12-14. Den anden metode udnytter musemodeller, der indeholder hyperplastiske alveolære knuder (HAN) læsioner, der menes at være den samme humane præ-invasive brystlæsioner 15. Den tredje model anvendes anerkendt brystcarcinomacellelinier såsom MCF7 underlinjer (MCF10A), der har en stærkt differentieret DCIS som morfologi 3,4. Selv om disse tre modeller har givet molekylære spor til brystkræft progression, ingen af disse metoder er i stand til at vurdere maligne potentiale eller den molekylære fænotype i en enkelte patients læsion (r). Histopathologic analyse ikke give oplysninger om den funktionelle fænotype af cellerne i de præ-invasive læsioner. Den musemodel af brystkræft progression kan ikke præcist afspejler histomorphology og mangfoldigheden af menneskets atypisk ductal hyperplasi, luftrør carcinoma in situ, og duktalt carcinoma in situ 16-18. Desuden stromal mikromiljø og deposition af ekstracellulære matrix omkringliggende muse forstadielæsioner afviger markant fra det menneskelige modstykke 16. Spontane murine forstadielæsioner kan udvise et meget lavt niveau for progression til invasion og metastase. Den tredje metode, dyrkede cellelinier, kan kun give funktionel fænotypiske oplysninger, hvis transplanteret ind immunsvækkede værter 3,4. Ud over de genetiske abnormiteter i en lang passage cellelinie kan ikke repræsentere spontan brystkræft progression hos mennesker 2. Endelig er det velkendt, at hver patients neoplasmehar en unik kombination af genetiske og epigenetiske abnormiteter, der driver væksten, differentieret tilstand, og progression til invasion og metastase 13,14,17. Humane præ-invasive læsioner er multifokal og heterogene i celle sammensætning og histomorphology. Endvidere biologiske maligne potentiale er ukendt for den enkelte patient præ-invasive læsion.
Vores primære vævskultur metode overvinder manglerne ved tidligere modeller af brystkræft human præ-invasive og giver følgende fordele: 1) Det organoide kultur understøtter vækst af neoplastiske cellepopulationer i native væv mikromiljø, som spontant vokse og skabe mammospheres der vil producere invasive tumorer i mus xenograftmodeller. Cellerne repræsenterer genotype og fænotype af en individuel patient og derved give oplysninger til personlig terapi, eller individuel prognose. 2) organoide dyrkningssystem maintains de native cellulære subpopulationer og tilvejebringer et middel til at dyrke ikke-maligne epitelceller, stromale celler og immunceller oprindeligt er til stede i brystvæv primære og gennemført i kultur i organoide. Den lave volumen af medier i kulturen understøtter iltudvekslingen opmuntrende spontan mammosphere dannelse og differentieret kanal og alveoler lignende strukturer uden behov for en kunstig tredimensionel stilladser. 3) primær cellekultur er fri for ændringer og udvælgelse genereret ved enzymatisk dissociation eller exogene genetiske modifikation. Endvidere næringsmediet er billig og enkel at fremstille. 4) Molekylær og genetisk analyse kan udføres på specifikke cellepopulationer og / eller organoids fra kulturen på forskellige tidspunkter uden at forstyrre hele kulturen. 5) organoide dyrkningssystem tillader vækst, differentieret morfologi og celle-celle-interaktioner af de indfødte cellepopulationer, som kanundersøges før og efter indførelse af terapeutiske midler i dyrkningsmediet.
Selv primær vævskultur har visse fordele, er det ikke uden begrænsninger. Den organoide kultur understøtter vækst af blandede cellekulturer uden overvækst af et hvilket som helst celletype. Imidlertid kan den specifikke forhold af celletyper ikke kontrolleres og kan således ikke rekapitulere den præcise cellulære forhold fundet in vivo. Vellykket organoide dyrkning kræver sterile væv indsamling og behandling, som begge ikke er rutinemæssige procedurer i mange samfund hospital patologilaboratorier. God kommunikation mellem de kliniske forskere, kirurgisk personale, og patologi personale er afgørende for at opretholde prøve sterilitet i kontinuum af patientbehandlingen.
En yderligere begrænsning af organoide kultur er virkningen af undergrunden fasthed på cellulær fænotype og genekspression 16,19. Differentiering af stamceller i kulturkan induceres ved tilsætning af serum-holdigt medium eller kan skyldes længere tid i kultur. En stilk-lignende fænotype blev opretholdt efter flere måneder i denne ikke-enzymatiske, serumfrit organoide dyrkningssystem 5. Men på et tidspunkt, kan cellerne differentiere som kan ses morfologisk - cellerne bliver mindre, tættere, og undlader at danne mammospheres. For at undgå potentielle problemer med ændringer i cellefænotype over tid, molekylære eksperimenter, såsom transfektioner eller vælte assays, bør udføres med unge kulturer snarere end med gamle kulturer (mere end 6 måneder).
Nøglerne til en vellykket organoide kultur bruger en passende mængde medium i kulturen kolben, og lade organoids tid til at klæbe til vævskulturkolbe. Overskydende medium i kolben grænser ilt diffusion, hæmme mammosphere formation. De første 3 - 7 dage i vævskultur er kritiske for organoids at fastgøre til tissue dyrkningskolbe. Generelt, hvis en organoide ikke fastgjort ved dag 14, er det sandsynligvis ikke indeholder levedygtige DCIS duktale segmenter og bliver ikke klæbende. Organoids, der ikke er klæbende på dag 14 bør fjernes fra kulturen. Manglen på levedygtige bryst DCIS kanaler kan verificeres efter kultur ved fastsættelse af organoide i 10% formalin og forarbejdning af vævet ind paraffinblokke for vævsfarvning og mikroskopisk evaluering.
Vores ikke-enzymatisk, serumfrie kultur systemets resultater understøtter den hypotese, at genetisk unormale neoplastiske precursorceller med invasiv potentiale eksistere inden for præ-invasive human brystlæsioner 5,9,20. Dette fund er i overensstemmelse med det tidligere arbejde i Sgroi et al., Som har ledet genetisk analyse af human bryst præ-invasive læsioner og Damonte et al., Der studerede mamma intraepitelialneoplasi udvækst (Mino) musemodel af brystkræft progression 12,14 21. Taget together med konklusionerne fra andre, vores kultur model af enkelte patients præ-invasive læsioner støtter konceptet, at den aggressive fænotype af en patients invasiv brystcancer kan være stort set forudbestemt på forhånd invasive fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af (1) Department of Defense Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) award # W81XVVH-10-1-0781 til LAL og VE, og (2) den Susan G. Komen Foundation tilskud IR122224446 på Lal og VE. Patologi support og væv opregning blev venligst stillet til rådighed af Inova Fairfax Pathology Department, Dr. Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, og Dr. Charles Bechert. Patient samtykke og prøve indkøb sagkyndigt blev styret af Inova Fairfax Hospital klinisk forsknings koordinatorer Holly Gallimore, Heather Huryk, og Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
