Summary
यहाँ हम इन विट्रो में Homalodisca vitripennis कोशिकाओं और HoCV -1 का प्रचार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. मध्यम HoCV -1 सकारात्मक संस्कृतियों से हटा दिया गया था और आरएनए 168 घंटे के लिए हर 24 घंटा निकाला. सेल survivability trypan नीले रंग धुंधला द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. पूरे वायरस कणों के बाद संक्रमण निकाले गए थे. निकाले आरएनए QRT पीसीआर द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था.
Abstract
बेजान पंखों वाला निशानची (Homalodisca vitripennis) पश्चिमी संयुक्त राज्य भर पाया एक अत्यधिक vagile और polyphagous कीट है. इन कीड़ों Xylella fastidiosa (एक्स fastidiosa) के प्रमुख वैक्टर, चर्चा का पियर्स रोग (पीडी) के कारण एजेंट है कि एक जाइलम सीमित जीवाणु हैं. पियर्स रोग आर्थिक रूप से हानिकारक है; इस प्रकार, एच vitripennis रोगाणु प्रबंधन रणनीति के लिए एक लक्ष्य बन गया है. Homalodisca coagulata वायरस से 01 (HoCV-01) के रूप में पहचान एक dicistrovirus एच में एक वृद्धि की मृत्यु दर के साथ संबद्ध किया गया है vitripennis आबादी. एक मेजबान सेल HoCV-01 प्रतिकृति के लिए आवश्यक है, क्योंकि सेल संस्कृति logistically और जैव कीटनाशक के उत्पादन के लिए आर्थिक रूप से मूल्यवान है कि लक्षित प्रतिकृति के लिए एक समान वातावरण प्रदान करता है. इस अध्ययन, एच के बड़े पैमाने पर प्रसार के लिए एक प्रणाली में टिशू कल्चर के माध्यम से vitripennis कोशिकाओं विकसित किया गया था, पीएक वायरल प्रतिकृति तंत्र roviding. HoCV-01 पूरे शरीर कीड़ों से निकाला और सुसंस्कृत एच टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अलग स्तरों पर vitripennis कोशिकाओं. संस्कृति के माध्यम 168 घंटा, आरएनए निकाला और QRT- पीसीआर के साथ विश्लेषण के लिए हर 24 घंटे हटा दिया गया था. प्रकोष्ठों trypan नीले रंग के साथ दाग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल survivability यों गिना रहे थे. पूरे वायरस कणों कुल सेल संस्कृति पतन हुआ पहले होना निर्धारित समय बिंदु था, जो संक्रमण के बाद 96 घंटे, अप करने के लिए निकाले गए थे. कोशिकाओं को भी फ्लोरोसेंट धुंधला के अधीन और एफ actin लगाव और नाभिक अखंडता पर वायरल गतिविधि की जांच करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया. इस अध्ययन का निष्कर्ष यह है कि एच vitripennis कोशिकाओं सुसंस्कृत और एक जैव कीटनाशक के उत्पादन की अनुमति के लिए एक उपयुक्त स्तर पर HoCV-01 का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा करने में सक्षम हैं.
Introduction
बेजान पंखों वाला निशानची (Homalodisca vitripennis Germar 1821) उत्तर अमेरिका में 1, Xylella fastidiosa (एक्स fastidiosa) के प्रमुख वेक्टर के रूप में चर्चा (पीडी) की पियर्स रोग के कारण एजेंट की पहचान की गई है. कीट आबादी प्रबंधन जल्दी कैलिफोर्निया में और दक्षिणी संयुक्त राज्य भर में अंगूर की खेती उद्योग के लिए यह विनाशकारी समस्या से निपटने के लिए अनुसंधान का ध्यान केंद्रित हो गया है. परिवार से संबंधित एक सकारात्मक भावना, एकल असहाय आरएनए वायरस Dicistroviridae, Homalodisca coagulata वायरस से 01 (HoCV-01) जंगली एच में पहचान की गई है vitripennis आबादी और कीटनाशकों के लिए कीट प्रतिरोध कम करते हुए, उन आबादी 2-4 में मृत्यु दर को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है.
तरीकों के विकास के लिए प्रभावी ढंग से पीछे एच संक्रमित करने के लिए एक प्रयोगशाला स्थापित करने में वयस्कता के लिए vitripennis क्योंकि मुश्किल हो गया है
निम्नलिखित प्रक्रियाओं के समग्र लक्ष्य के लिए एक जैविक नियंत्रण एजेंट के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त HoCV-01 के एक उच्च एकाग्रता का उत्पादन होता है. वायरल प्रतिकृति क्यों सफलतापूर्वक एच खेती और अनुकूलन है जो एक जीवित कोशिका की आवश्यकता vitripennis संस्कृतियों वायरस के मुनाफे के स्तर के उत्पादन की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है.
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Protocol
1 सेल संस्कृति
नोट: यूएसडीए कृषि अनुसंधान सेवा (. फीट पियर्स, फ्लोरिडा यूएसए) में डॉ वेन हंटर प्रयोगशाला द्वारा स्थापित Homalodisca vitripennis सेल लाइनों प्रारंभिक fibroblasts और monolayers सहित मिश्रित सेल चरणों से बना एक प्रयोगशाला शेयर आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
- 25 सेमी 2 संस्कृति बोतल के साथ 20-24 डिग्री सेल्सियस के तापमान रेंज में बनाए रखा एक बाँझ प्रयोगशाला वातावरण में निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.
- खेती और H2G + Leafhopper मध्यम, एक संशोधित WH2 मधुप मीडिया 10 (1 टेबल) का उपयोग कर 25 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल में संस्कृतियों बनाए रखें.
- 53% आर्द्रता ~ के साथ 24 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बोतल सेते हैं.
- , किसी भी असामान्य सेलुलर विकास के लिए जाँच,, जैसे संस्कृति विकास पर नजर रखने के लिए किसी भी संभावित contaminants के लिए निगरानी, और संस्कृति भर में विकास प्रगति की जाँच करने के लिए एक कुल बढ़ाई 100X की (टीएम) पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोगऊपरी सतह.
- संस्कृति सतह परेशान बिना 10 दिन - हर 7 एक पूरा मध्यम परिवर्तन (~ कुप्पी 4 प्रति मिलीलीटर संस्कृति मध्यम) प्रदर्शन.
- संस्कृति सतह कोशिकाओं को अलग कर देना ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त 0.25% trypsin का उपयोग कोशिकाओं की वृद्धि (मिला हुआ) द्वारा कवर लगभग 80% है जब संस्कृतियों से गुजरती हैं. प्रत्येक संस्कृति कुप्पी trypsin के 3 मिलीग्राम और समय का संक्षिप्त अवधि के लिए एंजाइम को संस्कृति (एस) का पर्दाफाश - ~ 2 जोड़ें - पूरा सेल हदबंदी को प्राप्त करने के लिए (5 से 10 मिनट).
- एंजाइम गतिविधि को रोकने और centrifugation के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब पूरे समाधान के लिए स्थानांतरण करने के लिए - संस्कृति कुप्पी (ओं) (3 मिलीग्राम ~ 2) को ताजा माध्यम के बराबर राशि जोड़ें.
- 350 x जी पर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
- सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब ~ ताजा माध्यम से 8 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे एक विंदुक का उपयोग कोशिकाओं homogenize.
- एक 1 में विभाजित संस्कृति: 2 अनुपात 25 के लिए सेमी 2 बोतल (~ सेल soluti के 4 मिलीलीटरफ्लास्क प्रति पर) और छोड़ हौसले पारित संस्कृतियों निलंबन में कोशिकाओं कुप्पी की सतह पर सुरक्षित रूप से संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 48 घंटे के लिए undisturbed.
नोट: 1 2 सेमी की वृद्धि की सतह के साथ 48 अच्छी तरह से बाँझ टिशू कल्चर प्लेटों में कोशिकाओं की खेती संभव नहीं है और वे ~ 250 μl के लिए मध्यम संस्कृति की मात्रा में कमी के साथ संस्कृति बोतल के रूप में एक ही तरीके से रखा जा सकता है.
2 साबुत वायरस निकालना
- वायरस सकारात्मक एच के पूरे शरीर homogenize ~ 10 सेकंड के अंतराल के लिए vortexing द्वारा 0.02% सोडियम diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA) के साथ फॉस्फेट बफर में vitripennis, पीएच ~ 7.2, कोई मौजूद ऊतकों के अधिक बड़े clumps कर रहे हैं जब तक. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटा या 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 22,000 XG के लिए 124,500 XG पर गति centrifugation के माध्यम से वायरस निकालें. शीर्ष पर एक वेग रूपों हैं, एक बाँझ कपास झाड़ू 11 के साथ इसे हटा दें.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- गोली लीजिए और0.4% ना deoxycholic एसिड और 4% पॉलीथीन ग्लाइकोल hexadecyl आकाश (बृज 52) युक्त, 5 एमएल मिमी 10 की फॉस्फेट बफर (कोई DETCA), पीएच ~ 7.2 के साथ भंग.
- अच्छी तरह से गोली मिश्रण करने के लिए, ट्यूब की ओर से गोली निकालने के लिए और यदि आवश्यक हो तो समाधान में जब तक ऊपर कुचलने.
- गोली अगर जरूरत समाधान में जाने के लिए और 2 ट्यूबों 11 में गठबंधन करने में मदद ~ 5 मिलीलीटर वेतन वृद्धि में अधिक 10 मिमी फॉस्फेट बफर जोड़ें.
- 15 मिनट 11 के लिए 300 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान पारित, और बड़ा संग्रह ट्यूब 11 में छानना इकट्ठा.
- एक आणविक वजन के साथ एक डायलिसिस झिल्ली पर स्थानांतरण छानना 10 मिमी के 11 अगर जरूरत नहीं DETCA युक्त फॉस्फेट बफर (पीएच 7) थोड़ी मात्रा का उपयोग करते हुए, 3.5 केडी की (MWCO) काट दिया.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर DDH 2 ओ से भरा एक बड़े बीकर में डायलिसिस झिल्ली रखें. DDH 2 हे हर घंटे च बदलेंया 5 - 6 घंटा, झिल्ली 11 में एक सफेद वेग रूपों तक.
- झिल्ली के भीतर से शुद्ध वायरस लीजिए और DDH 2 ओ के 90 μl के लिए समाधान के 10 μl जोड़कर एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए 100% वायरस समाधान विषय 100,000: इसके बाद 1 के कमजोर पड़ने तक पहुँचने तक DDH 2 हे की एक और 90 μl को कमजोर पड़ने की 10 μl जोड़ें.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वायरस समाधान.
3 वायरल प्रतिकृति
- सेल के विकास (कोशिकाओं औसत दर से बढ़ रहे हैं तो लगभग 72 घंटे के बाद पास) 80% मिला हुआ है जब तक 48 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में बीज कोशिकाओं और सभी पंक्तियों हो जाना.
- सेल के विकास confluency पहुंचता है एक बार सीरियल पतला वायरस के साथ कोशिकाओं की प्रत्येक पंक्ति टीका लगाना, यानी, एक 1:10 कमजोर पड़ने से एक पंक्ति, एक 1 की एक पंक्ति: शीर्ष पंक्ति के अलावा 100 कमजोर पड़ने, आदि,. एक नियंत्रण के रूप में शीर्ष पंक्ति का उपयोग करें और एक मात्रा पर नियंत्रण के रूप में एक अच्छी तरह से DDH 2 हे के 10 μl जोड़ें.
- पूर्व वायरस के साथ संस्कृतियों में किसी भी कुओं की प्रारंभिक टीका करने के लिए प्रत्येक पंक्ति के पहले अच्छी तरह से, प्रयोगात्मक सेल गिनती के साथ तुलना के लिए एक प्रारंभिक आधारभूत सेल एकाग्रता स्थापित अलग कर देना और गिनती करने के लिए आदेश में.
- संस्कृति प्लेटें एक पीएच परिवर्तन का संकेत माध्यम में किसी भी रंग बदलने के लिए और सेल आकारिकी में किसी भी बदलाव के लिए वायरल टीका के बाद हर 24 घंटे की निगरानी.
- 100X टीएम पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग हर समय बिंदु पर परीक्षण थाली, की छवि एक स्तंभ.
- प्रत्येक 24 घंटा समय बिंदु पर उतारी थी कि स्तंभ से सभी मध्यम निकालें और -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना निष्कर्षण और वायरल मात्रा का ठहराव या लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर यह अल्पकालिक दुकान.
- सेल पेले फिर से निलंबित करने के लिए एंजाइम गतिविधि और ताजा माध्यम से ~ 250 μl रोकने के लिए 0.25% trypsin EDTA और ताजा माध्यम से ही ~ 250 μl का उपयोग 1.9, - पहले कदम 1.6 में वर्णित के रूप में मध्यम हटाने के बाद कुओं से कोशिकाओं को अलग कर देनाटी.
- एक सप्ताह से अधिक प्रत्येक 24 घंटे की अवधि के लिए सेल हदबंदी के बाद कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन करने की कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक ट्यूब 0.4% trypan नीले दाग के 10 μl जोड़ें. दाग कोशिकाओं की गिनती करने से पहले 10 मिनट के लिए बैठने की अनुमति.
- दाग के रूप में अच्छी तरह से अलाभकारी कोशिकाओं तेज करने के लिए शुरू हो जाएगा दाग को जोखिम या व्यवहार्य कोशिकाओं के 1 घंटे के भीतर कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन करना.
- धीरे धीरे एक micropipette का उपयोग एक मानक hemocytometer के प्रत्येक पक्ष को दाग सेल समाधान के 10 μl जोड़ें. अनुमति दें समाधान हवाई बुलबुले से बचने के लिए केशिका क्रिया द्वारा लिया जाना है.
- Hemocytometer के दोनों किनारों पर व्यवहार्य (गैर दाग) कोशिकाओं की संख्या (hemocytometer में 16 चौकों की 4 गिनती के समकक्ष) की गणना. हटा दिया गया था कि स्तंभ के प्रत्येक के लिए अच्छी तरह कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन करना.
- प्रत्येक स्तंभ से कोशिकाओं की गिनती औसत और कुल सेल गिनती संख्या प्राप्त करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: एक्स कमजोर पड़ने कारक (कोशिकाओं / 4 की औसत संख्या) = कोशिकाओं x 10 की संख्या
सेल संस्कृति से 4 वायरस निकालना
- इलाज एच निकालें एंजाइम की गतिविधि को रोकने के लिए 0.25% trypsin EDTA और ताजा माध्यम से ही ~ 250 μl का उपयोग, 1.8 - संस्कृति बोतल से vitripennis कोशिकाओं पहले कदम 1.6 में वर्णित है.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 2.8 - पहले कदम 2.3 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद संस्कृति कोशिकाओं से वायरस निकालें.
5 आरएनए एक्सट्रैक्शन
- निर्माता प्रोटोकॉल प्रति तरल नमूने के लिए बनाया गया एक guanidinium thiocyanate-फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी का उपयोग हर एक सप्ताह के वायरस परीक्षण के दौरान एकत्र मध्यम नमूनों से शाही सेना निकालें.
- स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने निकाले.
6 आरटी पीसीआर
- का उपयोग पारंपरिक पीसीआर चलाकर आरटी पीसीआर के लिए वायरल मानकों की स्थापनाप्राइमर जोड़ी HoCV आरटी पीसीआर प्राइमर 1 (आगे 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT -3 'ACGACGGATCTGCGTGCCAA -3 5', रिवर्स') वायरस के साथ पूरे शरीर एच से अलग vitripennis.
- विषय पीसीआर उत्पाद 0.1% ethidium ब्रोमाइड युक्त एक 2% agarose जेल में 120 वी पर 60 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन जेल.
- जेल से बैंड उत्पाद शुल्क और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल निकालना किट का उपयोग कर शुद्ध.
- पूल सभी excised और जेल शुद्ध उत्पाद और आगे बुनियादी इथेनॉल तेज़ी से शुद्ध. समग्र नमूना एकाग्रता बढ़ाने के लिए Tris EDTA (ते) के लगभग 30 μl में तेज़ी उत्पाद elute.
- न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए 260/230 तरंगदैर्ध्य सेटिंग्स का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से जमा नमूने में सीडीएनए के स्तर यों.
- 57 एनजी से लेकर शुद्ध नमूना की एक दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन / 57 एजी / μl (10 -18) को μl. एक के समान धारावाहिक कमजोर पड़ने मैं वर्णित प्रदर्शन करनाn एकाग्रता आवश्यकताओं में अंतर के लिए किए गए समायोजन के साथ 2.8.
- कम बहुतायत टेप के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव के साथ एक QRT- पीसीआर किट का उपयोग कर QRT- पीसीआर प्रदर्शन से कमजोर पड़ने श्रृंखला की पहचान की सीमा निर्धारित करते हैं.
नोट: 5 एक्स 10 -3 प्रतियों से वायरल सांद्रता कम detectable नहीं कर रहे हैं. - कदम 5.1 में पहले वर्णित के रूप में प्रयोगात्मक नमूनों से शाही सेना निकालें और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग यों.
- Nuclease मुफ्त पानी का उपयोग μl / 5 एनजी करने के लिए सभी निकाले नमूने मानक के अनुसार.
- निम्नानुसार 25 μl प्रतिक्रियाओं कम प्रतिलिपि संख्या को महसूस करने की क्षमता के साथ एक एक कदम QRT- पीसीआर किट का उपयोग कर के रूप में, डुप्लिकेट में, सभी नमूनों पर QRT- पीसीआर प्रदर्शन करना: 50 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए पकड़; 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पकड़; 10 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र; हर कदम पर 5 सेकंड के लिए 99 डिग्री सेल्सियस - 50 से पिघला.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण 1x Maste की 12.5 μl शामिल इतना है कि मास्टर मिश्रण बनाओआर मिश्रण, आगे प्राइमर का 1.0 μl (0.3 माइक्रोन), रिवर्स प्राइमर का 1.0 μl (0.3 माइक्रोन), रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और मानकीकरण मूल्यों पर आधारित टेम्पलेट के चर राशि के 0.25 μl.
- RNase मुक्त पानी के साथ 25 μl के लिए कुल प्रतिक्रिया मात्रा लाओ.
- प्रत्येक पीसीआर में पांच मानक सांद्रता निम्नलिखित प्रतिलिपि संख्या के साथ चलाने में शामिल हैं: एक्स 10 -10 5, 5 एक्स 10 -8, 5 एक्स 5 एक्स 10 -4 -6 10,, और 5 एक्स 10 -2 प्रतियां. प्रत्येक रन की शुरुआत में जल्दी अधिग्रहण के दौरान शोर को कम करने के लिए सिर्फ 10x -2.5 की एक प्रतिदीप्ति नीचे करने के लिए प्रत्येक रन के लिए सीमा निर्धारित करें.
7 Confocal माइक्रोस्कोपी
- अच्छी तरह से प्रत्येक में व्यास में 18 मिमी को मापने एक बारह अच्छी तरह से थाली युक्त कांच coverslips में Homalodisca vitripennis कोशिकाओं को विकसित.
- एक monolayer हासिल की है एक बार, चार दिनों की अवधि के लिए थाली पर हर 24 घंटे एक स्तंभ टीका लगाना. प्रत्येक ग सुनिश्चित करें किolumn अच्छी तरह से एक नियंत्रण में हैं, एक कम वायरल कमजोर पड़ने (1:10) अच्छी तरह से और एक उच्च वायरल कमजोर पड़ने (1: 100,000) अच्छी तरह से. 2.8 कदम से प्राप्त वायरस समाधान का उपयोग करें.
- पांचवें दिन सभी मीडिया निकालें और दो बार 1x पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
- 1x फास्फेट के 500 μl कोशिकाओं को खारा (पीबीएस) buffered जोड़ें और कम गति पर एक घुमाव पर आरटी पर 10 मिनट के लिए उन्हें धोने. कोशिकाओं तीन बार धोएं.
- उन्हें permeabilize कोशिकाओं को 0.1% ट्राइटन X-100 के 500 μl जोड़ें. आरटी पर 10 मिनट के लिए बैठते हैं.
- धो कोशिकाओं को फिर से के रूप में पहले कदम 7.5 में वर्णित है.
- आरटी पर कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए एक 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान के 500 μl जोड़ें. 2 घंटे के लिए बैठते हैं और फिर हटाने करते हैं.
- 1x पीबीएस 5% BSA युक्त में 250 और एफ actin के लिए दाग को अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कमजोर पड़ने के 250 μl जोड़ें: शेयर Rhodamine लाल संयुग्मित phalloidin (RCP) 1 पतला.
- एल्यूमीनियम च में कवर प्लेटतेल विरंजन से डाई को रोकने और 4 डिग्री कंपनी / एन में कोशिकाओं सेते हैं.
- ऊष्मायन के 12 घंटे के बाद RCP निकालें और कोशिकाओं के नाभिक दाग, 5% BSA युक्त 1x पीबीएस में पतला 6 diamidino-2-phenylindole 4 की 250 μl ', (DAPI) (250 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ बदलें .
- 1 घंटे के लिए आरटी पर DAPI युक्त कोशिकाओं को सेते हैं.
- पहले कदम 7.5 में वर्णित के रूप में 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
- धीरे कुओं से coverslips निकालें और एक विरोधी फीका अभिकर्मक के साथ एक बढ़ते मीडिया का उपयोग कर स्लाइड खुर्दबीन के लिए माउंट.
- Confocal खुर्दबीन के नीचे देखा जब तक स्लाइड बक्से lightproof में सूखे की अनुमति दें. रंगों तेजी से फीका कर सकते हैं के रूप में देखें जितनी जल्दी हो सके स्लाइड तैयार.
- एक 63X (तेल) योजना apochromate लेंस युक्त एक माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित एक confocal प्रणाली का उपयोग कर छवि दाग कोशिकाओं.
- 543 ± 10 एनएम उत्तेजना और Rhoadmine लाल conjucated phalloidin के लिए 575 ± 10 एनएम उत्सर्जन करने के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य सेटDAPI के लिए, और 369 ± 10 एनएम उत्तेजना और 450 ± 30 एनएम उत्सर्जन.
- सभी छवियों को प्राप्त करने के लिए डिटेक्टर के लिए समान लाभ और बंद सेट सेटिंग्स का उपयोग करें.
- छवि प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और एक छवि के प्रबंधन सॉफ्टवेयर में छँटाई और आयात वांछित छवियों प्रक्रिया छवियों.
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Representative Results
सेल लगाव और विकास प्राथमिक संस्कृतियों और जारी रखा मार्ग से, दोनों छोटे और बड़े संस्कृति बोतल में पारित होने के 48 घंटे के भीतर देखा गया था. Fibroblast वृद्धि और विकास भी इस समय सीमा के भीतर मनाया गया. नव वरीयता प्राप्त बोतल 48 घंटा पहले परेशान थे, वहां, सेल लगाव में एक दृश्य गिरावट आई थी कभी कभी धीमी बढ़ रही संस्कृतियों और सब पर कोई लगाव या विकास के लिए अग्रणी. प्रकोष्ठों निधन के एक सप्ताह के भीतर लगभग 80% मिला हुआ थे और 10-14 दिनों (चित्रा 1) में एक monolayer का गठन. इस अध्ययन की दीक्षा पर खेती की जाती थी कि प्राथमिक संस्कृतियों, किसी भी रूपात्मक गिरावट या समग्र सेल व्यवहार्यता गिरावट के बिना 30 + सेल मार्ग बच गया है.
सेल लगाव और विकास प्लेटों को बोतल से पारित होने के 48 घंटे के भीतर देखा गया था. यह एक छोटे विकास की सतह के रूप में monolayer गठन, एक कम समय अवधि में लगभग 5-6 दिनों हासिल की थी. संक्रमित संस्कृतियों फोटो खिंचवाने एकटी 100X प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत गिरते सेल आकार अखंडता के लक्षण दिखाई. 48 घंटे के बाद संक्रमण में, बड़े छेद कोशिकाओं की सतह पर मौजूद थे होने के लिए क्या दिखाई देते हैं. लगभग 72-96 घंटा गैर पतला HoCV-01 (चित्रा 2) से संक्रमित होने के बाद संस्कृति बोतल के उस पार, कोशिकाओं सिकुड़ और संस्कृति सतह से अलग.
नियंत्रण के लिए जीवित कोशिकाओं की गिनती मतलब है और प्रयोगात्मक नमूने गणना की और समय के साथ वायरल भार के बीच जीवित कोशिकाओं की बहुतायत में मतभेद (चित्रा 3) को चित्रित करने की साजिश रची गया. नियंत्रण समूह के लिए जीवित कोशिकाओं में लगातार वृद्धि स्वस्थ कोशिकाओं का संकेत है, मौजूद है. तुलनात्मक रूप से, सभी उपचार समूहों समय के साथ मौजूद जीवित कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय गिरावट थी. कम वायरल समूहों धीरे से 144 घंटे के आसपास बंद करो और जब तक गिरावट है, जबकि उच्च वायरल उपचार समूहों, 48-72 घंटा के बीच जीवित कोशिकाओं में एक प्रमुख गिरावट के साथ संस्कृति स्वास्थ्य में एक बहुत अधिक उल्लेखनीय गिरावट से संकेत मिलता है. एक दो तरह एनोवा वाईवें Bonferroni के बाद अस्थायी विश्लेषण हर बार अध्ययन में बिंदु, साथ ही समूहों के बीच की तुलना में प्रत्येक उपचार समूह में रहते कोशिकाओं की गिनती के आधार पर HoCV-01 से सेल संस्कृति मार दरों में अंतर का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. विचरण का दो तरह से विश्लेषण समय संस्कृतियों की लंबाई एक इलाज प्रभावित संस्कृति लंबी उम्र के लिए खुल गए थे, सुझाव है कि समय कारक, एफ (7, 432) = 82.5, पी <0.0001 का एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव था. उपचार की संस्कृतियों प्राप्त प्रकार का प्रभाव एक संस्कृति शुरू में मिलने वाले वायरल लोड की राशि संस्कृति अस्तित्व को प्रभावित करता है, यह दर्शाता है, साथ ही एफ (5, 432) = 170.6, पी <0.0001 महत्वपूर्ण था. समय का पहलू और उपचार कारक के बीच बातचीत में एक महत्वपूर्ण प्रभाव उच्च वायरल लोड संस्कृति फिटनेस को कम करने के लिए आवश्यक समय की छोटी राशि प्राप्त किया और इसके विपरीत कि रेखांकित, यह भी एफ (35, 432) = 17.63, पी <0.0001 मौजूद है कम वायरल लोड,एक ही प्रभाव के लिए आवश्यक समय की लंबी अवधि. Bonferroni के बाद हॉक परीक्षण एक उल्लेखनीय खुराक प्रतिक्रिया का संकेत है, उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को वर्णन.
मतलब लाइव सेल गिनती का विश्लेषण करती से तैयार नतीजे पर correlating, कापलान-Meier घटता (चित्रा 4) द्वारा परीक्षण के रूप में उच्च वायरल उपचार के साथ inoculated कोशिकाओं के अस्तित्व संभावना कम थी. नियंत्रण या गैर संक्रमित कोशिकाओं के लिए एक 100% जीवित रहने की दर थी. कम वायरल उपचार 144 घंटे तक जीवित रहने की एक बड़ी संभावना है, जबकि उच्च वायरल उपचार के संपर्क में कोशिकाओं तो अस्तित्व संभावना में गिरावट मौजूद है, समय के साथ जीवित रहने की संभावना में एक उल्लेखनीय गिरावट थी. कॉक्स आनुपातिक खतरों मॉडल विश्लेषण महत्वपूर्ण नहीं था, उपचार coeff = 0.8812 (95% सीआई [0.76, 1.02]), p> 0.05. महत्वपूर्ण नहीं हैं, डेटा वायरस के संपर्क में कोशिकाओं को समय के साथ कम जीवित रहने की दरों प्रदर्शन करने के लिए 88% अधिक संभावना है कि पता चलता है.
प्रत्येक QRT- पीसीआर रन के लिए, उच्च वायरल मानकों पहले कम वायरल मानकों और प्रयोगात्मक नमूने से ऊपर ramped. प्रत्येक रन से, सीटी मूल्यों प्रयोगात्मक नमूने में HoCV-01 आरएनए वर्तमान की बहुतायत में मतभेद के लिए परीक्षण और कई नियंत्रण मूल्यों के मूल्यों की तुलना करने के लिए एक दो तरह एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया दोहराने. विचरण का दो तरह से विश्लेषण कोई महत्वपूर्ण मुख्य समय कारक का प्रभाव, एफ (7, 289) = 0.38, पी> 0.05, या समय और उपचार समूहों के बीच बातचीत में, एफ (63, 289) = 0.14 दिखाया, पी > 0.05. शुरू में सेल संस्कृति के लिए पेश वायरस की राशि का संकेत उपचार समूहों, एफ (9, 289) = 135.7, पी <0.0001, के बीच एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव मनाया गया पता लगाया वायरल शाही सेना की राशि को प्रभावित करता है. Bonferroni के बाद हॉक परीक्षण चलाने के लिए और उपचार समूहों और नियंत्रण के उपायों, लेकिन उपचार जी के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत के बीच महत्वपूर्ण बातचीत को दिखाने गयाकोई measureable खुराक प्रतिक्रिया का संकेत है, अकेले roups.
स्वस्थ के सेल आकारिकी और HoCV-01 में मतभेद एच संक्रमित 24 और 72 घंटे में vitripennis कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के तहत देखा गया. वर्तमान नाभिक की संख्या की गिरावट के साथ ही नियंत्रण के साथ तुलना के रूप में HoCV-01 के संपर्क में कोशिकाओं में एफ actin के कुरूप उपस्थिति वायरस संस्कृति स्वास्थ्य पर एक बड़ा प्रभाव है कि संकेत मिलता है. उच्च 01:10 वायरल लोड करने के लिए संपर्क में कोशिकाओं कम वायरल उपचार के संपर्क में कोशिकाओं की तुलना में अधिक से अधिक संकट दिखाया. नियंत्रण कोशिकाओं को और अधिक प्रचुर मात्रा में दिखाई देते हैं और दो बार के अंक (चित्रा 5) के बीच सामान्य आकारिकी है.
| अनुग्रह कीट मध्यम (पूरक, 1x) | 210 मिलीलीटर |
| 0.06M एल हिस्टडीन monohydrate समाधान (पीएच = 6.5) | 290 मिलीलीटर |
| मध्यम 199 (10x) | 10 मिलीलीटर |
| मध्यम 1066 (1x) | 17 मिलीलीटर |
| हांक संतुलित साल्ट (1x) | 33 मिलीलीटर |
| एल Glutamine (100x) | 1.5 मिलीलीटर |
| सदस्य, अमीनो एसिड मिश्रण (50x) | 1.5 मिलीलीटर |
| 1 एम MgCl समाधान | 6 मिलीलीटर |
| पेन Strep (Glutamine / डब्ल्यू) | 2.5 मिलीग्राम / 500 मिलीलीटर |
| Nystatin | 1.0 मिलीग्राम / 500 मिलीलीटर |
| Gentamycin | 1.5 मिलीग्राम / 500 मिलीलीटर |
| डेक्सट्रोज | 1.8 जी |
| भ्रूण गोजातीय सीरम | अंतिम मात्रा का 10% |
तालिका 1 H2G + leafhopper मध्यम घटकों.
एच के 1 छवियाँ चित्रा vitripennis CE100X टीएम पर कब्जा कर लिया विट्रो में डालूँगा विकास. (ए) कक्ष में दो दिन (48 घंटे) लगाव और fibroblast विकास प्रदर्शन के बाद पारित होने के. कोशिकाओं चार, छह, आठ और दस दिनों संस्कृति सतह भर में विकसित करने के लिए जारी रखने के बाद पारित होने (इ). (एफ) Monolayer गठन होने वाली ~ 10 14 दिन. स्केल सलाखों:. 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 एच संक्रमित 100X टीएम पर imaged vitripennis कोशिकाओं morphological परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए. पूर्व टीका करने के लिए (ए) fibroblast वृद्धि. (बी) कक्ष 24 घंटे के बाद संक्रमण. (सी) कक्ष 48 घंटे के बाद संक्रमण. (डी) 96 घंटा के बाद संक्रमण कोशिकाओं हैज्यादातर संस्कृति सतह से अलग और मध्यम बादल बन गया है. स्केल सलाखों:. 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
वायरल लोड प्रयोगात्मक अवधि के दौरान प्रत्येक दिन के लिए प्राप्त हुआ है और मानक विचलन सलाखों के साथ यहाँ दिखाए जाते हैं द्वारा प्रयोगात्मक नमूने के लिए मतलब लाइव सेल मायने रखता दिखा चित्रा 3 बार चार्ट. लाइव कोशिकाओं की गिनती मीन प्रयोगात्मक नमूने के लिए गणना की गई. सेल मायने रखता है. कम वायरल भार के साथ ~ 144 घंटे के बाद संक्रमण पर लाइव सेल गिनती में उच्च वायरल भार और महत्वपूर्ण घटने के साथ जीवित कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण कमी ~ 72 घंटे के बाद संक्रमण दिखाने मीन करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
एच में एक गैर संक्रमित नियंत्रण की तुलना में पांच अलग HoCV -01 उपचार के 4 चित्र कापलान-Meier अस्तित्व विश्लेषण vitripennis सेल संस्कृतियों. नियंत्रण संस्कृतियों पांच उपचार समूहों की तुलना में एक 100% जीवित रहने की दर को बनाए रखा. सबसे कम अस्तित्व संभावना उच्च उपचार समूह में देखा गया था और सभी उपचार समूहों 168 घंटा जब N = 10 पर शून्य अस्तित्व संभावना की ओर सिर. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Figu. 24 घंटे के अंतराल पर 100,000 सांद्रता: Homalodisca vitripennis कोशिकाओं धारावाहिक से संक्रमित थे 5 नियंत्रण के confocal छवियों और संक्रमित H.vitripennis कोशिकाओं पुन 01:10 और 1 में HoCV-01 पतला. प्रकोष्ठों संस्कृतियों के भीतर एफ actin और नाभिक कल्पना करने के लिए rhodamine phalloidin और DAPI दाग के साथ इलाज किया गया. Confocal छवियों 63X पर कब्जा कर लिया और निम्न और उच्च वायरल dilutions दोनों पर 72 घंटे में सेल आकारिकी में एक को तोड़ने के नीचे दिखा रहे थे. स्केल सलाखों:. 1 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
आक्रामक कृषि प्रजातियों की आमद के बारे में बढ़ती चिंताओं के उभरते कीट और रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए नए तरीके के लिए एक वृद्धि की मांग करने के लिए नेतृत्व किया है. बीमारी की रोकथाम और प्रबंधन का ध्यान केंद्रित रोगाणु वैक्टर का प्रबंधन शामिल है और इस अध्ययन के प्राथमिक लक्ष्य था. अर्थशास्त्र व्यावहारिक आवेदन बहुत बड़े क्षेत्र में है, लेकिन एक कम लागत के 12 में बड़ी मात्रा में होने की जरूरत है क्योंकि कृषि में रोगाणु वैक्टर का प्रबंधन करने के लिए जैव कीटनाशक के इस प्रकार का निर्माण करने के निर्णय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. अनुसंधान और विकास के लिए सेल संस्कृति का उपयोग करने का अभ्यास तेजी से सामान्य हो गया है और इस तरह के रूप में, इस अध्ययन के प्रभावों महत्वपूर्ण हैं. आर्थिक रूप से व्यवहार्य एकीकृत कीट प्रबंधन (आईपीएम) रणनीतियों की पहचान दुनिया भर में जारी रखा सफल कृषि उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है और इस अध्ययन में निष्कर्ष आईपीएम रणनीतियों में सुधार लाने और चर्चा के पीडी की घटना को कम करने में प्रगति के लिए योगदान करते हैं.
एच vitripennis सेल संस्कृतियों प्रचारित और किसी भी दृश्य रूपात्मक गिरावट के बिना एक साल से अधिक के लिए बनाए रखा गया. बीतने संख्या काफी सेल चयापचय और विकास विशेषताओं 13 बदलकर स्तनधारी कोशिकाओं में इन विट्रो अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. कोशिकाओं vivo में इन विट्रो में दोहराने के रूप में, telomeres सेल प्रतिकृति के प्रत्येक दौर के साथ छोटा और अंततः भी कम हो जाते हैं telomeres जहां एक महत्वपूर्ण सीमा तक पहुँच और सेलुलर वार्धक्य 14 प्रेरित. गंभीर telomere छोटा होता है, आनुवंशिक अस्थिरता और अंत में संकट, या भारी कोशिका मृत्यु 15 होती है. इस घटना की, संस्कृतियों शायद ही कभी 50 subcultivations या एक वर्ष से परे जीवित रहने की वजह से, निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर, हेफिलिक सीमा समझा: सेक्स क्रोमेटिन, histotypical भेदभाव, inadaptability की अवधारण संस्कृति, गैर घातक विवो में विशेषताओं, खेती के परिमित सीमा को निलंबित करने के लिए, प्राथमिक ऊतक के समान सेल आकारिकी, सेल लाइनों, Coxsackie A9 रिसेप्टर पदार्थ की अवधारण और उपभेदों 16 विकसित किया जा सकता है जिस आसानी से की तुलना में एसिड के उत्पादन में वृद्धि हुई है. बीतने संख्या के संभावित जटिलताओं सेल लाइन प्रसार की इस पद्धति समय की विस्तारित अवधि में निरंतर उत्पादन करने में सक्षम है यह दर्शाता है कि इस अध्ययन की अवधि के दौरान नहीं मनाया गया. लाइव कीट पालन या अन्य महंगे और जटिल उत्पादन तरीकों पर सेल संस्कृति का उपयोग तेजी से कई विषयों में आम होता जा रहा है, क्योंकि सेल लाइन के इस प्रकार के दीर्घायु कई व्यावहारिक आवेदन किया है. ठीक से बनाए रखा है, एक भी प्राथमिक कोशिका लाइन वायरस उत्पादन के कई दौर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इन कोशिकाओं के सफल लंबी अवधि के रखरखाव में दो प्रमुख कारकों हौसले वरीयता प्राप्त संस्कृतियों और उचित मध्यम तैयारी के लिए अशांति समय थे. 4 पहले के लिए अछूता रहा है कि संस्कृतिपारित होने के बाद 8 घंटा कि प्रारंभिक खिड़की के भीतर ले जाया गया है कि उन लोगों की तुलना पार कुप्पी विकास में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई. Undisturbed छोड़ दिया, कोशिकाओं का तेजी से प्रतिकृति संस्कृति बोतल में के रूप में छोटे रूप में दस दिन में बाद के पारित होने monolayers हासिल की. मध्यम तैयारी के रूप में अब तक सामान्य संस्कृति स्वास्थ्य का संबंध था अशांति समय के रूप में अध्ययन के दौरान के रूप में महत्वपूर्ण था. यहां तक कि मध्यम में मौजूद एंटीबायोटिक दवाओं के साथ, जीवाणु संक्रमण अभी भी मध्यम तैयारी पर विचार जब एक महत्वपूर्ण कारक था. जीवाणु संक्रमण के एक लगभग न के बराबर कारक के लिए कम हो गया था क्योंकि संस्कृतियों में उपयोग करने से पहले कई दिनों के लिए आरटी पर रहने के लिए मध्यम की aliquots अनुमति देकर, संस्कृति का एक विनाशकारी श्रृंखला की संभावना गिर. ऐसे जेंटामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन रूप में एंटीबायोटिक दवाओं,, सामान्यतः कोशिकाओं और किसी भी बाहर संदूषण के भीतर पाया बैक्टीरिया का मुकाबला करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम में उपयोग किया जाता है. इन एंटीबायोटिक दवाओं के दोनों स्तनधारी संस्कृतियों में सेल के विकास की एक अवसाद से जोड़ा गया है एकबैक्टीरिया 17,18 की एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के विकास की संभावना को बढ़ाने के लिए एक सड़न रोकनेवाला तकनीक के उपयोग में कमी और चिंता करने के लिए डी. एंटीबायोटिक्स जरूरत से ज्यादा इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए; हालांकि, उनके उपयोग सेल संस्कृति संक्रमण के मुद्दों को रोकने के लिए आवश्यक है.
इन कारकों के प्रभाव कोशिकाओं के ऊपर स्केलिंग के उत्पादन सेल संस्कृतियों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए मामूली कदम के साथ जैव कीटनाशक सामग्री की त्वरित बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है कि इस तरह के हैं. बायोरिएक्टर 1950 और 1960 के दशक में उभरा है, और समय 19 के एक असाधारण कम राशि में कोशिकाओं के अरबों के उत्पादन का कारगर साधन प्रदान करने के लिए विकसित के बाद से है. बायोरिएक्टर के कई प्रकार है कि नाटकीय रूप से एच की संख्या को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है मौजूद vitripennis कोशिकाओं एक समय में उत्पादन और उत्पादन प्रणाली की इस प्रकार के विकास की प्रक्रिया fro कर्तन को रोकने के लिए कोशिकाओं का इलाज करने के लिए एक विधि के विकास की आवश्यकता होगीएम वृद्धि बायोरिएक्टर में सतहों.
सेल लाइनों के सफल निरंतर वृद्धि वायरस संस्कृतियों के भीतर रहने की अनुमति दी जानी चाहिए विट्रो प्रतिकृति और कितनी देर में quantifiable के लिए आवश्यक है कितना वायरस के मुद्दे का समाधान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, HoCV-01 प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण है और एक बार हासिल की है. एक स्पष्ट संबंध कोशिकाओं से प्राप्त प्रारंभिक वायरल लोड की मात्रा और समय वायरस कणों की अवधि के बीच पाया गया था कोशिकाओं के भीतर सेते की अनुमति दी गई. तेजी से वायरल प्रतिकृति का संकेत कोशिका मृत्यु के लिए समय की आवश्यकता है, कम, वायरल लोड प्राप्त उच्चतर. हालांकि, सभी उपचार के पार सेल नंबर एक व्यापक सेल संस्कृति जीवित रहने की दहलीज प्रदर्शन में लगभग 25 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल की सीमा मूल्य 144 घंटे के बाद संक्रमण से नीचे करने के लिए मना कर दिया. परिणाम वायरस की बड़ी मात्रा में आरंभिक संक्रमण के लिए आसानी से उपलब्ध हैं अगर वायरस की बड़ी मात्रा में जल्दी से उत्पादन किया जा सकता है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना, या कि increवायरस की ased मात्रा कम प्रारंभिक खुराक के साथ समय की एक लंबी अवधि में उत्पादन किया जा सकता है. एकाग्रता और समय कारकों के बीच संबंधों में परिवर्तनशीलता 72-96 घंटे के बाद संक्रमण की एक इष्टतम वायरल निकासी समय के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए उत्पादन विकल्पों में कुछ लचीलापन देता है.
वायरल अध्ययन के लिए सेल संस्कृतियों का प्रयोग लक्ष्य वायरस का पता लगाने और अध्ययन के परिणामों यों की क्षमता पर निर्भर है. इस के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रयोगात्मक नमूने के भीतर वायरल शाही सेना दृश्यों की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए पीसीआर का उपयोग करने के लिए है. इस अध्ययन में पीसीआर डेटा से सीटी मूल्यों का विश्लेषण वायरस के इष्टतम निकासी समय होगा क्या करने के लिए एक स्पष्ट जवाब नहीं देता है; हालांकि, एक निश्चित निकासी समय की कमी HoCV-01 विट्रो में दोहराने के लिए एक अक्षमता का संकेत नहीं है, लेकिन वायरल पढ़ाई की संवेदनशील प्रकृति की. Trypan नीले रंग का उपयोग कोशिकाओं की गिनती इष्टतम निकासी टाइम्स की एक स्पष्ट विचार करने के लिए उधार दे, लेकिन कोई एक definitiv तरह से कर रहे हैई जवाब. कोशिका मृत्यु डेटा अत्यधिक 72 घंटा के बाद सेल जीवित रहने की कमी हुई करने के लिए उच्च वायरल भार संस्कृति में कोशिकाओं को मरने के लिए शुरू के रूप में 48 घंटे और 72 घंटे के बाद संक्रमण के बीच वायरल निकासी वायरल कणों के सेलुलर टूटने को कम करने के लिए आदर्श हो सकता है यह दर्शाता है कि नेतृत्व कि दिखाता है तेजी से. कम प्रारंभिक वायरल लोड पर निकालना गुना अधिक अस्पष्ट हैं, लेकिन 144 घंटे के बाद सेल जीवित रहने में नाटकीय घटने के साथ, यह इष्टतम निकासी समय 24 होगा कि अनुमान लगाया जा सकता है - उस समय बिंदु से पहले 48 घंटे. इष्टतम वायरल निकासी समय का निर्धारण एच के खिलाफ इस्तेमाल के लिए जैवकीटनाशकों का अमोघ उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है vitripennis infestations और इस अध्ययन उन समय के निर्धारण की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम उठाया है.
माइक्रोस्कोपी सेल संस्कृति के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है और इस अध्ययन एच साथ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए पहले से एक है vitripennis कोशिकाओं. इमेजिंग प्रोटीन लगाव वृद्धि या गिरावट और की बहुतायतसेल नाभिक विट्रो में HoCV-01 के intracellular गतिविधि में अधिक विस्तृत अध्ययन की दिशा में पहला कदम है. इस अध्ययन के दौरान, सेल संस्कृतियों नहीं दिखाई रूपात्मक deteriorations के साथ रखा गया. प्रत्येक बाद सेल पारित होने के बाद, सामान्य fibroblast वृद्धि एक monolayer के गठन के द्वारा पीछा किया, मनाया गया. कोशिकाओं के आकार और आकार में एक समान रहे. संक्रमित संस्कृतियों confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged थे हालांकि, जब सेल आकारिकी गिरावट के उच्च और निम्न प्रारंभिक वायरल भार दोनों के साथ, विशेष रूप से 72 घंटा समय बिंदु पर मनाया गया. छोटे छेद संरचनाओं की तरह संभवतः कोशिका मृत्यु के कारण और intracellular सामग्री के खदेड़ने सेल सतहों पर देखा जा सकता है. कुप्पी सतह भर कोशिकाओं सूखा और अंत में सतह से अलग करने के लिए शुरू किया. उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के इस पहले प्रयोग से निहितार्थ सेल survivability विश्लेषण में देखा परिणामों के लिए सहसंबंधी और बढ़ा वायरल पढ़ाई के लिए अन्य संभावित उपयोगों को जन्म देता है. उन्नत मीलHoCV-01 के लिए एंटीबॉडी विकास आयोजित किया गया अगर croscopy तकनीक इसकी अधिकतम क्षमताओं का उपयोग किया जा सकता है. वायरस के लिए एंटीबॉडी वायरल कणों की कहनेवाला कामकाज के दृश्य की अनुमति होगी ही नहीं बल्कि प्रसार दरों का निर्धारण और भी अधिक सटीक एक्सट्रैक्शन बार मदद कर सकता है.
कोशिकाओं की बड़ी biomasses वायरस के लिए काटा और फिर क्षेत्रों के लिए लागू कर रहे हैं, जहां एक बिंदु के लिए एक प्रभावी जैविक नियंत्रण एजेंट का उत्पादन करने के लिए इस अध्ययन में विकसित उत्पादन के तरीके को स्केलिंग की प्रक्रिया ज्यादातर लागत की बात है. बड़े पैमाने पर सिस्टम के निर्माण की प्रारंभिक लागत अधिक है और कई कारकों जैसे, विचार किया जाना है: लाभ, सेल और वायरस उत्पादकता, सेल संस्कृति के माध्यम लागत, आवेदन दर, बड़े पैमाने पर उत्पादन और बैच उत्पादन लागत 12. प्रारंभिक लागत के बावजूद, संभावित वेतन नापसंद निवेश के लायक हैं. धारा शुद्धि मुद्दों नीचे, सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग करके बहुत BE कम हो रहे हैंपेट सूक्ष्म जीव और एक पूरे शरीर कीट के भीतर पाया अन्य वायरस की संभावना बेहद लाइव कीट रखरखाव और पालन के लिए सुविधा लागत, साथ ही कम हो रहे हैं कारण.
पहले से ही प्रोटीन, जैवकीटनाशकों और अन्य दवाइयों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जा रहा सेल संस्कृति के साथ, अनुसंधान के इस क्षेत्र के लिए आर्थिक मूल्य बढ़ रही है. कृषि के क्षेत्र में जैवकीटनाशकों का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए, यह एक यहाँ पूरा लेकिन एक बड़ा सेल के विकास प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक ऐसे ही अध्ययन की कोशिश करना फायदेमंद होगा. बायोरिएक्टर और 3 डी मैट्रिक्स सेल बढ़ रही प्रणाली की नई पद्धति ही सम्मान में बड़ी मात्रा में कोशिकाओं का उत्पादन और,, वायरल उत्पादन 20 की बड़ी मात्रा के लिए अनुमति देते हैं. बड़े पैमाने पर सिस्टम के निर्माण की प्रारंभिक लागत अधिक है, वहीं उत्पादन किया जा करने में सक्षम उत्पाद की मात्रा में अदायगी भी अधिक होने की संभावना है. बहुत बड़े पैमाने पर सिस्टम describ में संचरण पढ़ाई को आगे बढ़ाने के लिए उधार होता है कि अध्ययन के क्षेत्रएड ऊपर एंटीबॉडी डिजाइन है. एंटीबॉडी डिजाइन यह HoCV-01 के लिए एक समय लेने और विस्तृत प्रक्रिया है, जबकि यह confocal माइक्रोस्कोपी के साथ इन विट्रो में वायरल गतिविधि के दृश्य के लिए अनुमति होगी, एचआईवी और हेपेटाइटिस सी जैसी बीमारियों के लिए वायरल पढ़ाई में तेजी से इस्तेमाल किया गया है और अन्य को ले जा सकता है जांच के क्षेत्रों.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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