Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Voortplanting van Published: September 25, 2014 doi: 10.3791/51953
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Summary

Hier presenteren we een protocol om Homalodisca vitripennis cellen en HoCV-1 propageren in vitro. Medium werd verwijderd uit HoCV-1 positieve kweken en RNA geëxtraheerd elke 24 uur gedurende 168 uur. Cell overlevingsvermogen werd gekwantificeerd door trypan blauw kleuring. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd na infectie. Geëxtraheerde RNA werd gekwantificeerd door qRT-PCR.

Abstract

De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis) is een zeer vagile en polyfage insect gevonden in de zuidwestelijke Verenigde Staten. Deze insecten zijn de belangrijkste vectoren van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), een-houtvaten beperkt bacterie die de veroorzaker van de ziekte van Pierce (PD) van wijnstok. De ziekte van Pierce is economisch schadelijk; aldus, H. vitripennis hebben een doel voor pathogeen management strategieën worden. A dicistrovirus geïdentificeerd als Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is geassocieerd met een verhoogde mortaliteit in H. vitripennis populaties. Omdat een gastheercel nodig HoCV-01 replicatie, celkweek verschaft een uniforme omgeving voor gerichte replicatie die logistiek als economisch waardevol voor biopesticide productie. In deze studie, een systeem voor grootschalige vermeerdering van H. vitripennis cellen via weefselkweek ontwikkeld, providing een virale replicatie mechanisme. HoCV-01 werd geëxtraheerd uit hele lichaam insecten en gebruikt om gekweekte H. inoculeren vitripennis cellen op verschillende niveaus. Het kweekmedium werd elke 24 uur gedurende 168 uur, RNA geëxtraheerd en geanalyseerd met qRT-PCR verwijderd. Cellen werden gekleurd met trypaanblauw en telde tot cel overlevingskansen te kwantificeren met behulp van een lichtmicroscoop. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd tot 96 uur na infectie, waarbij het tijdstip bepaald voordat totale celkweek ineenstorting opgetreden was. Cellen werden ook onderworpen aan fluorescentiekleuring en bekeken met behulp van confocale microscopie om virale activiteit op de F-actine gehechtheid en kernen integriteit te onderzoeken. De conclusie van deze studie is dat H. vitripennis cellen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor massaproductie van HoCV-01 op een passend niveau productie van een biopesticide mogelijk.

Introduction

De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis Germar 1821) is geïdentificeerd als de belangrijkste vector van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), de veroorzaker van de ziekte van wijnstok (PD) Pierce's in Noord-Amerika 1. Insect beheer bevolking heeft snel de focus van het onderzoek worden bij dit verwoestende probleem om de wijnbouw-industrie te bestrijden in Californië en over de zuidelijke Verenigde Staten. Een positief-sense, enkelstrengs RNA-virus behoort tot de familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is vastgesteld bij wilde H. vitripennis populatie en aangetoond dat de sterfte te verhogen in deze populaties 2-4, terwijl het verlagen van de weerstand van het insect om insecticiden.

Ontwikkeling van methoden om effectief achter besmet H. vitripennis naar volwassenheid in een laboratorium setting zijn moeilijk omdat geweest 5-8 vereisen. Specifieke voorzieningen nodig zijn aan de achterzijde voor live H. vitripennis in de Verenigde Staten; Daarom celkweek economischer en een alternatief, en steeds belangrijker voor HoCV-01 detectie en replicatie 2,9. Terwijl elementaire methoden voor het vaststellen van celculturen van H. vitripennis beschreven, deze methoden zijn nog niet gebruikt voor commerciële productie van biologische bestrijdingsmiddelen, zoals virussen 2.

De algemene doelstelling van de volgende procedures is een hoge concentratie van HoCV-01 geschikt voor gebruik als een biologisch bestrijdingsmiddel te produceren. Virale replicatie vereist een levende cel, waarvan de reden waarom succes cultiveert en het optimaliseren van H. vitripennis culturen is essentieel voor de voortgang van de productie van winstgevende niveaus van het virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Celkweek

OPMERKING: Homalodisca vitripennis vastgesteld door de Dr Wayne Hunter laboratorium aan de USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) cellijnen werden gebruikt om een lab stock bestaat uit gemengde cel stadia waaronder initiële fibroblasten en monolagen initiëren.

  1. Voer de volgende procedures in een steriele testomgeving gehandhaafd bij een temperatuur van 20-24 ° C met 25 cm2 cultuur flessen.
  2. Cultiveren en kweken handhaven 25 cm2 weefselkweek kolven met H2G + Leafhopper medium, een gemodificeerd WH2 honingbij medium 10 (tabel 1).
  3. Incubeer cultuur kolven bij 24 ° C met ~ 53% luchtvochtigheid.
  4. Gebruik een omgekeerde microscoop bij een totale vergroting (TM) van 100X te controleren groei cultuur, bijvoorbeeld, controleren of er geen abnormale celgroei, controleren op eventuele verontreinigingen, en laat de groei vooruitgang in de cultuur oppervlak.
  5. Voer een compleet medium verandering (~ 4 ml kweekmedium per fles) elke 7-10 dagen zonder de cultuur oppervlak verstoren.
  6. Ga kweken wanneer de kweekoppervlak ongeveer 80% onder celgroei (confluent) met 0,25% trypsine bevattende ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) om cellen dissociëren. Voeg ~ 2 - 3 ml trypsine aan elke cultuur kolf en bloot cultuur (s) om het enzym gedurende korte tijd (5 - 10 min) tot het volledig celdissociatie bereiken.
  7. Voeg een gelijke hoeveelheid vers medium aan de kweek kolf (en) (~ 2 - 3 ml) om enzymactiviteit te stoppen en breng de hele oplossing tot een conische buis centrifugeren.
  8. Pellet cellen door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 6 min bij 350 x g.
  9. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet en voeg ~ 8 ml vers medium aan elke buis. Voorzichtig homogeniseren cellen met een pipet.
  10. Split culturen op een 1: 2 verhouding voor 25 cm 2 flessen (~ 4 ml cel solutiop per kolf) en laat vers doorgegeven kweken ongestoord gedurende 48 uur om cellen in suspensie te stevig aan het oppervlak van de kolf.
    OPMERKING: Cultuur van cellen in 48-well steriele weefselkweekplaten met een groei oppervlak van 1 cm2 is ook mogelijk en kunnen worden gehandhaafd op dezelfde wijze als kolven met een vermindering van de hoeveelheid kweekmedium ~ 250 ul.

2 Hele Virus Extraction

  1. Homogeniseren hele lichamen van virus positieve H. vitripennis in fosfaatbuffer, pH ~ 7,2, met 0,02% natrium diethyldithiocarbamaat trihydraat (DETCA) door vortexen ~ 10 seconden intervallen tot er geen klontjes meer groot weefsel aanwezig. Extract virus via supersnel centrifugatie bij 124.500 g gedurende 4 uur bij 4 ° C en 22.000 g gedurende 16 uur bij 4 ° C. Als er een neerslag vormt boven, verwijderen met een steriel wattenstaafje 11.
  2. Verwijder het supernatant.
  3. Verzamel de pellet enoplossen met 5 ml van 10 mM fosfaatbuffer (geen DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-deoxycholinezuur en 4% polyethyleenglycol hexadecyl ether (Brij 52).
    1. De pellet meng, verwijdert de pellet van de zijkant van de buis en crush tot in oplossing indien nodig.
    2. Voeg meer 10 mM fosfaatbuffer in stappen ~ 5 ml om de pellet in oplossing gaan indien nodig en combineren tot 2 tubes 11.
  4. Centrifugeer de oplossing bij 300 xg gedurende 15 min 11.
  5. Verwijder de bovenstaande vloeistof en laat de oplossing door een 0,45 pm filter, en verzamel het filtraat in grote collectie buis 11.
  6. Transfer filtraat een dialysemembraan met een molecuulgewicht cut off (MWCO) van 3,5 kD, met kleine hoeveelheden van 10 mM fosfaatbuffer (pH 7) die geen DETCA indien nodig 11.
  7. Plaats het dialysemembraan in een groot bekerglas gevuld met DDH 2 O bij 4 ° C. Wijzig de DDH 2 O elk uur fof 5 - 6 uur, totdat een wit neerslag vormt in het membraan 11.
  8. Verzamel de gezuiverde virus vanuit het membraan en onderwerpen 100% virusoplossing een 10-voudige verdunningsreeks door 10 pi oplossing van 90 ul van DDH 2 O. Vervolgens voeg 10 ul van de verdunning naar de andere 90 ul van DDH 2 O tot het bereiken van een verdunning van 1: 100.000.
  9. WINKEL virus oplossing bij -80 ° C.

3 Virale replicatie

  1. Zaad cellen in 48 putjes en groeien alle rijen tot celgroei is 80% samenvloeiing (ongeveer 72 uur na pas als de cellen groeien met een gemiddelde snelheid).
  2. Inoculeer elke rij van cellen met de seriële verdunde virus eenmaal celgroei confluentie bereikt, dat wil zeggen een rij van een 1:10 verdunning, een rij van een 1: 100 verdunning, etc., behalve de bovenste rij. Gebruik de bovenste rij als controle en voeg 10 ul van DDH 2 O aan elk en een volumeregelaar.
    1. Om een ​​conferentie basislijn celconcentratie vast ter vergelijking met experimentele celtellingen, dissociëren en tel het eerste putje van elke rij vóór de initiële inoculatie van elke putjes in de kweken met virus.
  3. Monitor kweekplaten elke 24 uur na virale inoculatie voor kleurverandering in het medium aangeeft een pH-verandering en wijzigingen in celmorfologie.
  4. Afbeelding een kolom van de testplaat op elk tijdstip, met een omgekeerde microscoop bij 100x TM.
  5. Verwijder alle medium uit de kolom die werd afgebeeld op elke 24 uur tijdstip en opslaan korte termijn bij -20 ° C voor RNA extractie en virale kwantificering of lange termijn bij -80 ° C.
  6. Cellen losmaken van de putjes na wegnemen van medium zoals eerder beschreven in stap 1,6-1,9, met alleen ~ 250 ul 0,25% trypsine EDTA en vers medium om enzymactiviteit ~ 250 ul vers medium stoppen om resuspendeer de cel pellet.
  7. Voeg 10 ul van 0,4% trypan blue stain aan elke buis bevattende cellen celtellingen voeren na celdissociatie voor elke periode van 24 uur meer dan een week. Laat vlek te zitten voor 10 minuten voor het uitvoeren van cel-tellingen.
    1. Voer celtellingen binnen 1 uur blootstelling beitsen of levensvatbare cellen begint te vlek als niet-levensvatbare cellen respons Het.
  8. Voeg langzaam 10 ul van de gekleurde celoplossing aan elke kant van een standaard hemocytometer met een micropipet. Laat de oplossing worden gemaakt door capillaire werking om luchtbellen te voorkomen.
  9. Tel het aantal levensvatbare (niet gekleurd) cellen aan beide zijden van de hemocytometer (het equivalent van 4 tellen van de 16 vierkanten in de hemocytometer). Voer celtellingen voor elk putje van de kolom die werd verwijderd.
  10. Het gemiddelde van de cel-tellingen van elke kolom en gebruikt u de volgende formule om de totale celgetal nummer te verkrijgen: (gemiddeld aantal cellen / 4) x verdunningsfactor = aantal cellen x 10

4 Virus Winning van Cell Culture

  1. Verwijder behandeld H. vitripennis cellen van kweekflessen zoals eerder beschreven in stap 1,6-1,8, met alleen ~ 250 ul 0,25% trypsine EDTA en vers medium om enzymactiviteit te stoppen.
  2. Verwijder het supernatant.
  3. Uittreksel virus van kweekcellen volgens het protocol eerder beschreven in stap 2,3-2,8.

5 RNA extractie

  1. Uittreksel RNA van mediummonsters gedurende elke week virus proef met een guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie ontworpen voor vloeibare monsters per protocol van de fabrikant verzameld.
  2. WINKEL geëxtraheerde monsters bij -80 ° C.

6. RT-PCR

  1. Vast virale standaarden voor RT-PCR door het uitvoeren van PCR met de traditioneleprimerpaar HoCV RT-PCR-primer 1 (forward 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-omgekeerde ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') met virusisolaat van hele lichaam H. vitripennis.
  2. Betreft PCR product aan elektroforese gel gedurende 60 minuten bij 120 V in een 2% agarose gel die 0,1% ethidiumbromide.
  3. Accijnzen de banden van de gel en zuiveren met behulp van een gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Pool al uitgesneden en gel gezuiverd product en verder te zuiveren door elementaire ethanolprecipitatie. Elueer de precipitatie product in ongeveer 30 pl Tris EDTA (TE) de algemene monsterconcentratie verhogen.
  5. Kwantificeren van de mate van cDNA in gepoolde monsters via spectrofotometrie met behulp van 260/230 golflengte instellingen voor nucleïnezuur detectie.
  6. Voer een tienvoudige seriële verdunningsreeks van het gezuiverde monster variërend van 57 ng / ul tot 57 ag / pl (10 -18). Voer de seriële verdunning vergelijkbaar met die beschreven in 2.8 met aanpassingen voor het verschil in concentratie-eisen.
  7. Bepaal detectielimieten van de verdunningsreeks door het uitvoeren qRT-PCR met een qRT-PCR kit met betrouwbare kwantificatie van lage abundantie transcripten.
    OPMERKING: Virale concentraties lager dan 5 x 10 -3 kopieën zijn niet detecteerbaar.
  8. Uittreksel RNA experimentele monsters zoals eerder beschreven in stap 5.1 en kwantificeren met spectrofotometrie.
  9. Normaliseren alle geëxtraheerde monsters 5 ng / ul met nuclease vrij water.
  10. Voer qRT-PCR op alle monsters in duplo, zoals 25 ul reacties middels een stap qRT-PCR kit met de mogelijkheid om lage aantal kopieën voelen als volgt: 50 ° C houden gedurende 10 min; 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden; smelt 50-99 ° C gedurende 5 seconden op elke stap.
    1. Maak de master mix, zodat elk reactiemengsel bevat 12,5 ul 1x master mix, 1,0 pl (0,3 uM) van de forward primer, 1,0 pl (0,3 uM) van de reverse primer, 0,25 pl van reverse transcriptase en variabele hoeveelheden template op basis van standaardisatie waarden.
    2. Breng het totale reactievolume op 25 ui met RNase-free water.
    3. Onder meer vijf standaard concentraties in elke PCR uitgevoerd met de volgende kopie nummers: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, en 5 x 10 -2 exemplaren. Stel de drempel voor elke run tot net onder een fluorescentie van 10x -2,5 tot geluidsoverlast tijdens de vroege overname aan het begin van elke run te verminderen.

7 confocale microscopie

  1. Groeien Homalodisca vitripennis cellen in een twaalf wells plaat met dekglaasjes meet 18 mm in diameter in elk putje.
  2. Inoculeer een kolom op de plaat elke 24 uur gedurende een periode van vier dagen nadat een monolaag bereikt. Zorg ervoor dat elke column bevat een controle goed, een lage virale verdunning (1:10) goed en een hoge virale verdunning (1: 100.000) goed. Gebruik virus oplossingen verkregen uit stap 2.8.
  3. Verwijder alle media op de vijfde dag en was de cellen tweemaal met 1x PBS (pH 7,4).
  4. Fixeer de cellen met koude 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
  5. Voeg 500 ul van 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de cellen en wassen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker bij lage snelheid. Was de cellen drie keer.
  6. Voeg 500 ul van 0,1% Triton X-100 aan de cellen te permeabiliseren. Laat zitten voor 10 min bij kamertemperatuur.
  7. Was de cellen opnieuw zoals eerder beschreven in stap 7.5.
  8. Voeg 500 ul van een 5% bovine serum albumine (BSA) oplossing om cellen te blokkeren bij kamertemperatuur. Laat zitten voor 2 uur en vervolgens te verwijderen.
  9. Verdunnen voorraad Rhodamine rood-geconjugeerde phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS met 5% BSA en voeg 250 ul van de verdunning aan elk putje om beits voor F-actine.
  10. Afdekplaat in aluminium folie te voorkomen dat de kleurstof van bleken en incubeer cellen bij 4 ° CO / N.
  11. Verwijder de RCP na 12 uur incubatie en vervangen door 250 ul van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (250 ug / ml) verdund in 1 x PBS bevattende 5% BSA, de kernen van de cellen vlek .
  12. Incubeer de cellen met DAPI bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  13. Was de cellen drie keer met 1x PBS zoals eerder beschreven in stap 7.5.
  14. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de putten en monteren op dia microscoop met een montage media met een anti-fade reagens.
  15. Laat de dia's te drogen in lichtdichte dozen totdat bekeken onder de confocale microscoop. Bekijk voorbereid dia's zo snel mogelijk als kleurstoffen snel kan vervagen.
  16. Afbeelding gekleurde cellen met behulp van een confocale systeem uitgerust met een microscoop met een 63X (olie) van plan-apochromate lens.
    1. Stel de laser golflengte tot 543 ± 10 nm excitatie en 575 ± 10 nm emissie voor Rhoadmine rood-conjucated phalloidin, En 369 ± 10 nm excitatie en 450 ± 30 nm emissie voor DAPI.
    2. Gebruik identieke gain en off-set instellingen voor de melder om alle beelden te verkrijgen.
    3. Proces beelden met behulp van de juiste software voor het verwerken en sorteren en import gewenste beelden in een beeld het beheren van software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cel aanhechting en groei werd gezien binnen de 48 uur van de passage in zowel kleine als grote kweekflessen, van primaire culturen en voortgezet passages. Groei en ontwikkeling van fibroblasten werd ook waargenomen binnen dit tijdsbestek. Bij nieuw geplaatste flessen werden verstoord vóór 48 uur, was er een zichtbare vermindering van celhechting, wat leidt tot langzamer groeiende kweken en soms niet gehecht of groei meer. Cellen werden ongeveer 80% confluent binnen een week passing en vormden een monolaag 10-14 dagen (figuur 1). Primaire culturen die werden gekweekt in de inleiding van dit onderzoek, hebben 30 + celpassages overleefd zonder enige morfologische verslechtering of algehele levensvatbaarheid van de cellen daling.

Cel aanhechting en groei werd gezien binnen de 48 uur van passage uit kolven om platen. Monolaag vorming werd bereikt in een kortere periode, ongeveer 5-6 dagen, omdat het een lagere groei oppervlak. Geïnfecteerde kweken fotografeerde eent 100X onder lichtmicroscopie tekenen van afnemende integriteit cel vorm. Op 48 uur na infectie, wat lijken grote gaten op het oppervlak van cellen. Over cultuurflessen, cellen gekrompen en losgemaakt van het kweekoppervlak ongeveer 72-96 uur na besmetting met onverdunde HoCV-01 (figuur 2).

: Levende celtellingen voor controle en experimentele monsters werden berekend en uitgezet verschillen in overvloed levende cellen tussen virale last in de tijd (figuur 3) tonen. Een constante groei van levende cellen voor de controlegroep aanwezig is, wijst gezonde cellen. Relatief, alle behandelingsgroepen hadden een duidelijke daling van het aantal levende cellen aanwezig zijn in de tijd. De hogere virale behandelingsgroepen geven een veel scherpere daling in gezondheid kweek met een sterke daling in levende cellen tussen 48-72 uur, terwijl de lagere virale groepen langzaam dalen zolang afgeven ongeveer 144 uur. Een twee-weg ANOVA with Bonferroni post-hoc analyse werd gebruikt om de verschillen in celkweek kill rates testen door HoCV-01 gebaseerd op levende celtellingen in elke behandelingsgroep vergeleken met elk tijdstip in het onderzoek, en tussen groepen. De tweeweg variantieanalyse een significant hoofdeffect van de factor tijd, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, wat suggereert dat de tijdsduur kweken werden blootgesteld aan een behandeling getroffen cultuur levensduur. Het effect van het soort behandeling culturen kregen was eveneens significant, F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, wat aangeeft dat de hoeveelheid viral load cultuur aanvankelijk ontvangt beïnvloedt cultuur overleving. Een significant effect van de interactie tussen de tijdsfactor en behandeling factor is aanwezig, F (35, 432) = 17.63, p <0,0001, onderstreept dat hoe hoger de viral load ontvangen kortere tijd die nodig is om cultuur film verminderen en omgekeerd hoe lager de viral load, delangere tijd nodig is voor hetzelfde effect. Bonferroni post hoc proeven tonen een significant verschil tussen de behandelingsgroepen en controlegroepen, hetgeen een opmerkelijke dosis respons.

Overlevingskans van cellen geënt met een hogere virale behandelingen was lager getest door Kaplan-Meier curves (figuur 4), correleren met de conclusies van het gemiddelde levend celgetal analyses. Er was een 100% overleving voor de controle of niet-geïnfecteerde cellen. Cellen blootgesteld aan de hoge virale behandelingen hadden een duidelijke daling overlevingskans tijd, terwijl lagere virale behandelingen hebben een grotere overlevingskans tot 144 uur, daarna een daling overlevingskans aanwezig is. Cox proportional hazards model analyse was niet significant, behandeling coeff = 0,8812 (95% CI [0,76, 1,02]), p> 0.05. Hoewel niet significant, de gegevens suggereren dat cellen blootgesteld aan virus 88% eerder lagere overleving in de tijd vertonen.

Voor elke qRT-PCR run, de hogere virale normen opgevoerd eerder dan lagere viral normen en experimentele monsters. Van elke run, repliceren Ct-waarden werden geanalyseerd met behulp van een twee-weg ANOVA om te testen voor verschillen in de overvloed van HoCV-01 RNA aanwezig is in de experimentele monsters en waarden met elkaar vergelijken om meerdere controle waarden. De tweeweg variantieanalyse toonde geen significant hoofdeffect van de factor tijd, F (7, 289) = 0,38, p> 0,05, of in de interactie tussen tijd en behandelingsgroepen, F (63, 289) = 0.14, p > 0,05. Een significant hoofdeffect tussen de groepen, F (9, 289) = 135,7, p <0.0001, wat aangeeft dat de hoeveelheid virus in eerste instantie ingevoerd om de celcultuur van invloed op de hoeveelheid viraal RNA gedetecteerd werd waargenomen. Bonferroni post-hoc testen werden uitgevoerd en tonen significante interacties tussen de groepen en controlemaatregelen, maar geen significante interacties tussen de behandeling gde andere groepen alleen, aangeeft dat er geen meetbare dosis-respons.

Verschillen in cel morfologie van gezonde en HoCV-01 geïnfecteerde H. vitripennis cellen bij 24 en 72 uur werden waargenomen onder fluorescentie. De daling van het aantal kernen aanwezig en de misvormde verschijning van F-actine in de cellen blootgesteld aan HoCV-01 vergeleken met controles blijkt dat het virus heeft een grote invloed op de gezondheid cultuur. Cellen blootgesteld aan de hogere 1:10 viral load zien zou pijn dan de cellen blootgesteld aan de lagere virale behandeling. Controle cellen verschijnen overvloediger en normale morfologie tussen beide tijdstippen (figuur 5) hebben.

Grace's Insect medium (aangevuld 1x) 210 ml
0,06 M L-histidine monohydraat oplossing (pH = 6,5) 290 ml
Medium 199 (10x) 10 ml
Medium 1066 (1x) 17 ml
Evenwichtige Zouten Hank's (1x) 33 ml
L-Glutamine (100x) 1.5 ml
MEM, amino acid mix (50x) 1.5 ml
1 M MgCl oplossing 6 ml
Pen-Strep (w / Glutamine) 2,5 ml / 500 ml
Nystatine 1.0 ml / 500 ml
Gentamycine 1.5 ml / 500 ml
Dextrose 1,8 g
Fetal Bovine Serum 10% van het uiteindelijke volume

Tabel 1 H2G + leafhopper mediumcomponenten.

Figuur 1
Figuur 1 Afbeeldingen van H. vitripennis cell groei in vitro gevangen bij 100X TM. (A) Cellen twee dagen (48 uur) na doorgang vertonen hechting en fibroblast ontwikkeling. (BE) Cells vier, zes, acht en tien dagen na passage blijven aangroeien in kweekoppervlak. (F) monolaag vorming optreedt ~ 10- 14 dagen. Schaal bars:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 Infected H. vitripennis cellen afgebeeld op 100X TM tot morfologische veranderingen vast te leggen. (A) Fibroblast groei vóór de inoculatie. (B) cellen 24 uur na infectie. (C) cellen 48 uur na infectie. (D) 96 uur na infectie cellenmeestal los van de cultuur oppervlak en medium is troebel geworden. Schaal bars:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 Bar grafiek toont de gemiddelde live-cel-tellingen voor experimentele monsters. Mean live cell tellingen werden berekend voor experimentele monsters door virale lading ontvangen voor elke dag tijdens de experimentele periode en worden hier getoond met standaarddeviatie bars. De gemiddelde celtellingen een aanzienlijke daling in levende cellen ~ 72 uur na infectie met hoge virale lading en significante afname in levende celtelling bij ~ 144 uur na infectie met lagere virale lading. Zoomklik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 Kaplan-Meier analyse van vijf verschillende HoCV-01 behandelingen vergeleken met een niet-geïnfecteerde controle in H. vitripennis celkweken. Controlekweken gehandhaafd 100% overleving in vergelijking met de vijf behandelingsgroepen. De laagste overlevingskans werd gezien in de hoge dosisgroep en alle behandelingsgroepen richting nul overlevingskans bij 168 hr wanneer n = 10. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figu. re 5. confocale beelden van controle en geïnfecteerde cellen H.vitripennis Homalodisca vitripennis cellen werden geïnfecteerd met serieel verdund HoCV-01 in 1:10 en 1: 100.000 concentraties 24 uur intervallen. Cellen werden behandeld met rhodamine falloïdine en DAPI vlekken F-actine en kernen in de kweken te visualiseren. Confocale beelden werden vastgelegd met 63X en tonen een uitsplitsing in cel morfologie bij 72 uur bij zowel lage als hoge virale verdunningen. Schaal bars:. 1 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stijgende bezorgdheid over de instroom van invasieve landbouwgewassen hebben geleid tot een toenemende vraag naar nieuwe methodieken om te verdedigen tegen nieuwe plagen en pathogenen. Een focus van ziektepreventie en-beheer omvat het beheer van de ziekteverwekker vectoren en was het primaire doel van deze studie. Economie spelen een vitale rol in de beslissing om dit soort biopesticide om pathogeen vectoren te beheren in de landbouw, omdat de praktische toepassing moet zijn grote hoeveelheden over grote gebieden, maar tegen een lage kostprijs 12 te produceren. De praktijk van het gebruik van celkweek voor onderzoek en ontwikkeling steeds vaker en als zodanig, de effecten van deze studie zijn significant. Het identificeren van economisch haalbaar geïntegreerde gewasbescherming (IPM) strategieën is de sleutel tot verdere succesvolle agrarische productie wereldwijd en de bevindingen in deze studie een bijdrage leveren aan de vooruitgang in het verbeteren van IPM strategieën en het verminderen van het optreden van de PD van wijnstok.

H. vitripennis celkweken werden gepropageerd en gehandhaafd voor meer dan een jaar zonder enige zichtbare morfologische verslechtering. Passage nummers kan drastisch de resultaten van in vitro studies in zoogdiercellen beïnvloeden door het veranderen van de celstofwisseling en groei-eigenschappen 13. Zoals cellen repliceren in vivo en in vitro, telomeren korter bij elke ronde van celdeling en uiteindelijk een kritische grens waar telomeren te kort wordt bereikt en induceren cellulaire senescentie 14. Wanneer ernstige telomeerverkorting optreedt, genetische instabiliteit en tenslotte crisis, of massale celdood optreedt 15. Vanwege dit verschijnsel, culturen overleven zelden meer dan 50 subcultivations of een jaar, geacht het Hayflick Limit basis van de volgende criteria: retentie van sexchromatine, histotypical differentiatie, inadaptability cultuur, niet-maligne kenmerken in vivo, eindige limiet van teelt opschorten, Vergelijkbaar celmorfologie primaire weefsel verhoogde zuurproductie opzichte cellijnen, behoud van Coxsackie A9 receptor stof en het gemak waarmee stammen kunnen worden ontwikkeld 16. De mogelijke complicaties van passage nummers werden niet waargenomen tijdens de duur van dit onderzoek aangeeft dat deze wijze van cellijn propagatie kan continu groei gedurende langere perioden. Door gebruik van celkweek dan levende insecten kweek of andere dure en ingewikkelde productiemethoden wordt snel gemeengoed in vele disciplines, de levensduur van dit type cellijn vele praktische toepassingen. Indien goed onderhouden, kan een enkele primaire cellijn worden gebruikt voor meerdere rondes van virusproductie.

De twee belangrijkste factoren succesvolle lange termijn onderhoud van deze cellen waren verstoring tijd vers gezaaide culturen en goede mediumbereiding. Culturen die onaangeroerd bleef voor de eerste 48 uur na passage liet een duidelijke toename van de cross-fles groei ten opzichte van degenen die binnen die eerste raam werden verplaatst. Bij rust gelaten, de snelle replicatie van cellen verkregen monolagen in slechts tien dagen na passage in kweekflessen. Medium voorbereiding was zo belangrijk tijdens de studie als verstoring keer zo ver als de algemene gezondheid cultuur betreft. Zelfs met antibiotica aanwezig in het medium, bacteriële contaminatie nog steeds een belangrijke factor om te overwegen bij het opstellen medium. Doordat aliquots drager bij kamertemperatuur blijven enkele dagen voor gebruik in kweken, de waarschijnlijkheid van een verwoestende reeks cultuur stort vanwege bacteriële besmetting werd verminderd tot een nagenoeg onbestaande factor. Antibiotica, zoals gentamicine en streptomycine, worden vaak gebruikt in celkweekmedium voor bacteriën gevonden in de cellen en van buitenaf verontreiniging te bestrijden. Beide antibiotica zijn gekoppeld aan een depressie van celgroei in zoogdieren kweken eend een daling van het gebruik van aseptische technieken en zorg voor het vergroten van de kans op het ontwikkelen antibiotica resistente stammen van bacteriën 17,18. Antibiotica mogen niet overmatig worden gebruikt; echter, het gebruik nodig voor het voorkomen celkweek verontreinigingsproblemen.

De implicaties van deze factoren zijn zodanig dat opschaling productie van cellen is een haalbare optie voor snelle massaproductie van biopesticide materialen met kleine stappen om de kwaliteit van celculturen waarborgen. Bioreactoren ontstond in de 1950 en 1960, en sindsdien geëvolueerd efficiënte wijze produceren miljarden cellen in een uitzonderlijk korte tijd 19 verschaffen. Veel soorten bioreactoren bestaan ​​die kunnen worden toegepast beoogt men de aantal H. vitripennis cellen geproduceerd in een keer en het proces van het ontwikkelen van deze vorm van productie-systeem zou de ontwikkeling van een methode nodig om cellen te voorkomen dat het scheren weer behandelenm groei van oppervlakken in bioreactoren.

Succesvolle verdere groei van cellijnen is cruciaal voor HoCV-01 replicatie en vervolgens voor worden gebruikt om de vraag hoeveel virus nodig kwantificeerbare in vitro replicatie en hoe lang adres moet het virus worden toegestaan ​​binnen culturen blijven. Een duidelijke correlatie gevonden tussen de hoeveelheid eerste virale door cellen ontvangen belasting en de tijdsduur virusdeeltjes mochten incuberen in cellen. Hoe hoger de viral load ontvangen, hoe lager de vereiste tijd voor celdood, die snel virale replicatie. Echter, voor alle behandelingen celaantallen daalden tot onder de drempelwaarde van 25 x 10 4 cellen / ml ongeveer 144 uur na infectie, waaruit een overkoepelende celkweek overlevingsvermogen drempel. De resultaten illustreren dat grote hoeveelheden virus snel kunnen ontstaan ​​als grotere hoeveelheden virus zijn beschikbaar voor eerste infectie of dat Increased hoeveelheden virus kan worden geproduceerd gedurende een langere tijd bij lagere initiële dosering. Variabiliteit in de relatie tussen de concentratie en tijd factoren maakt een zekere flexibiliteit in de productie mogelijkheden voor grootschaliger studies met een optimale virale extractie tijd van 72-96 uur na infectie.

Met celkweken virale studies is afhankelijk van het vermogen om het doelwit virus detecteren en kwantificeren van de resultaten van de studie. Een betrouwbare methode hiervoor is het gebruik van PCR om te controleren op de aanwezigheid van viraal RNA sequenties binnen de experimentele monsters. De analyse van de Ct-waarden van PCR data in dit onderzoek heeft een duidelijk antwoord op wat de optimale extractie tijd van het virus zou zijn niet te geven; Echter, het ontbreken van een definitieve extractie is niet indicatief voor een onvermogen om te repliceren HoCV-01 in vitro, maar van de gevoelige aard van virale studies. Celtellingen behulp trypanblauw lenen voor een duidelijker beeld van de beste afzuiging tijden, maar zijn geenszins een definitive antwoord. Celdood data zien dat hoge virale lading tot sterk verminderde celdood overlevingskansen na 72 uur, wat aangeeft dat virale extractie tussen 48 uur en 72 uur na infectie ideale cellulaire verdeling van virusdeeltjes kunnen verminderen als de cellen in de kweek af te sterven exponentieel. Extractie bij lagere initiële virale last zijn dubbelzinnig, maar met dramatische afname in cel overlevingskansen na 144 uur kan worden gespeculeerd dat optimale extractietijd 24 zou - 48 uur vóór dat tijdstip. Bepaling van optimale virale extractietijd is essentieel om effectief productie van biopesticiden voor gebruik tegen H. vitripennis plagen en deze studie is een belangrijke stap op weg naar de vaststelling van die tijd genomen.

Microscopie is een belangrijk instrument voor de celcultuur analyse en deze studie is de eerste die confocale microscopie gebruiken met H. vitripennis cellen. Imaging eiwit beslag stijging of daling en de overvloed aancelkernen is de eerste stap op weg naar meer gedetailleerde studies naar de intracellulaire activiteit van HoCV-01 in vitro. In deze studie werden celkweken gehandhaafd zonder zichtbare morfologische verslechteringen. Na elke volgende passage van de cellen, werd de normale fibroblast groei waargenomen, gevolgd door de vorming van een monolaag. Cellen bleven uniform van vorm en grootte. Wanneer geïnfecteerde kweken werden afgebeeld met confocale microscopie, werden dalingen celmorfologie waargenomen, vooral bij het 72 uur tijdstip, met zowel hoge als lage initiële virale last. Gaatje structuren te zien op celoppervlakken, mogelijk als gevolg van celdood en verdrijven van intracellulair materiaal. Cellen in de kolf oppervlak verschrompeld en uiteindelijk begon los te maken van het oppervlak. De implicaties van deze eerste toepassing van hogere resolutiemicroscopie correleren met de resultaten gezien in de cel overlevingsvermogen analyse en leidt tot andere mogelijke toepassingen voor verhoogde virale studies. Geavanceerde microscopy technieken kunnen worden gebruikt om de maximale vermogens als antilichaam ontwikkeling HoCV-01 uitgevoerd. Antilichamen voor het virus niet alleen visualisatie van intracellulaire werking van de virale deeltjes mogelijk, maar kan ook helpen bepalen proliferatiesnelheden en nog nauwkeuriger extracties keer.

Het proces van schaalvergroting productiemethoden ontwikkeld in deze studie een effectief biologisch bestrijdingsmiddel produceren een punt waar grote biomassa van cellen geoogst voor virus en vervolgens op velden grotendeels een kwestie van kosten. Initiële kosten van het opbouwen van grootschalige systemen is hoog en vele factoren moeten worden beschouwd, zoals: rentabiliteit, cel en productiviteit virus, celcultuurmedium kosten, verbruik, productie-omvang en batch productiekosten 12. Ondanks initiële kosten, de potentiële pay offs zijn de investering waard. Door gebruik te maken van celcultuur technieken, stroomafwaarts zuivering problemen worden sterk worden verminderdveroorzaken mogelijkheid darm microbe en andere virussen binnen een hele lichaam insect worden sterk gereduceerd, en facilitaire kosten voor levende insecten onderhoud en fokken.

Met celcultuur al wordt gebruikt voor de productie van eiwitten, biopesticiden en andere geneesmiddelen, wordt de economische waarde voor dit gebied van onderzoek verhogen. Voor grootschalige productie van biopesticiden in de landbouw, zou het voordelig zijn om een ​​soortgelijke studie om de hier afgesloten, maar met grotere celkweeksysteem proberen. Bioreactoren en de methodologie voor 3D matrixcel kweeksystemen voor grotere volume productie van cellen en in hetzelfde opzicht grotere hoeveelheden virale productie 20. Hoewel de initiële kosten van het opbouwen van grootschalige systemen is hoog, de uitbetaling van de hoeveelheid product kunnen produceren heeft de potentie om nog groter. Een gebied van onderzoek dat sterk zou lenen aan het bevorderen van overdracht studies in grootschalige systemen described hierboven is antilichaam ontwerp. Antilichaam ontwerp is meer gebruikt in studies voor virale ziekten zoals HIV en hepatitis C. Hoewel het een tijdrovend en gedetailleerde werkwijze voor HoCV-01, zou het mogelijk maken visualisatie van virale activiteit in vitro met confocale microscopie en kan leiden tot andere onderzoeksgebieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LS Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit Qiagen 204243
4% paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Reagent grade, crystalline
PBS Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Tags

Infectie , Celkweek de ziekte van wijnstok Pierce,
Voortplanting van<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biesbrock, A. M., Powell, C. M.,… More

Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter