Summary
Selv om en kjent modell, representerer marsvin for tiden en nisje i eksperimentelle dyre vitenskaper og begrenset informasjon er tilgjengelig for utførelse av de fleste fremgangsmåter. Her presenterer vi fire forskjellige tilnærminger til ikke-terminal in vivo blodprøvetaking teknikker i enten bevisst eller bedøvede marsvin.
Abstract
Marsvin har flere biologiske likheter med mennesker, og er validert eksperimentelle dyremodeller 1-3. Imidlertid representerer bruk av marsvin i dag et relativt smalt område for forskning og beskrivende data om spesifikke metode er tilsvarende begrenset. De anatomiske trekk av marsvin er litt forskjellig fra andre gnagere modeller, derav modulering av sampling teknikker for å tilrettelegge for artsspesifikke forskjeller, f.eks. Mot mus og rotter, er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig og høy kvalitet prøver. Som både lang og kort sikt in vivo studier ofte krever gjentatt blod prøvetaking valg av teknikk bør være godt vurderes for å redusere stress og ubehag for dyrene, men også for å sikre overlevelse samt etterlevelse av kravene i utvalgsstørrelse og tilgjengelighet. Venøse blodprøver kan fås på en rekke steder i marsvin f.eks., Saphenous og venavener, hver teknikk som inneholder både fordeler og ulemper 4,5. Her presenterer vi fire forskjellige blodprøvetaking teknikker for enten bevisst eller bedøvede marsvin. Prosedyrene er alle ikke-terminal prosedyrer gitt at prøvevolumer og antall prøver ikke overstiger retningslinjer for blodprøvetaking hos forsøksdyr seks. Alle de beskrevne metodene har blitt grundig testet og anvendt for gjentatt in vivo blodprøvetaking av studier innenfor vår forskning anlegget.
Introduction
Marsvin er en verdifull og validert eksperimentell dyremodell på grunn av en rekke biologiske likheter med mennesker slik som et krav for et diett-tilførsel av vitamin C, tilsvar plasma lipoprotein metaboliserende enzymer og lipoproteinprofiler, samt felles likheter med human og placentation prenatal utvikling 1-3,7,8. Dette gjør marsvin en attraktiv og egnet modell for å studere effektene av diettrelaterte sykdommer slik som ikke-alkoholholdige fettleversykdom, kardiovaskulære sykdommer og mulige effekter av vitamin C-mangel, men også virkningen av f.eks. Maternal kost inngrep på utvikling avkom.
Gjentatte blodprøvetaking er ofte nødvendig i både lang og kort sikt in vivo studier. Med hensyn til det artsspesifikke anatomiske forskjeller modulering av prøvetagningsteknikk er nødvendig for å oppnå blodprøver hos marsvin sammenlignet med andre gnagermodeller
Her presenterer vi fire forskjellige blodprøvetaking teknikker for enten bevisst eller bedøvede marsvin. Procedures er alle ikke-terminal prosedyrer gitt at prøvevolumer og antall prøver ikke overstiger retningslinjer for blodprøvetaking hos forsøksdyr seks. Det er av hensyn til god vitenskap samt dyrevelferd at stress bør holdes på et minimum. Dermed kan bare godt trente og kompetente personlige bør utføre dyre prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De viste prosedyrer ble utført i henhold til protokoller som er godkjent av det danske forsøk med dyr Datatilsynet under Ministry of Food, landbruk og fiskeri.
1. Blodprøvetaking fra Lateral saphena eller Tarsal Vein
- Utfør denne prosedyren uten bedøvelse og ved hjelp av en etterforsker, en håndtering av marsvin, og en innsamling av prøven.
- Barbere tarsal regionen i bakbenet med en barbermaskin til venene er synlige. Sikre at området er stort nok til å unngå pels forstyrrer stikkstedet.
- Plasser bakben i et lunkent vannbad og forsiktig gni beinet, noe som gjør blodårene mer utvidet og tydelig.
- Tørk av beinet med et rent håndkle og desinfisere stikkstedet med gasbind eller bomullspinne fuktet med 70% alkohol.
- Begrense marsvin og forlenge bakben nedover mens bruk milde press umiddelbart over kneleddet to gi stasis.
- Punkter venen ved hjelp av en 21 G nål eller Lancet. Samle blod f.eks., Ved hjelp av en samling eller kapillarrør. Forsiktig manipulere benet for å hjelpe blodstrømmen.
- Slipp stasis, en gang prøven har blitt oppnådd. Påfør et stykke gasbind eller bomullsdott med lett press på punksjonsstedet inntil blødningen har stoppet.
- Returnere dyret til buret sitt og monitor for 5-10 min å sikre hemostase.
2. Blodprøvetaking fra ørevenen
- Utfør denne prosedyren uten bedøvelse enten alene eller fortrinnsvis ved hjelp av en kollega.
- Desinfiser framsiden av øret ved hjelp av gasbind eller bomullspinne fuktet med 70% alkohol.
- Bruk lett trykk på undersiden av øret for å gi stasis.
- Punkter venen ved hjelp av en 21 G nål eller Lancet, og samle blod.
- Slipp stasis, når prøven er oppnådd, Påfør et stykke gasbind eller bomullsdott med gentle press på punksjonsstedet inntil blødningen har stoppet.
- Returnere dyret til buret sitt og monitor for 5-10 min å sikre hemostase.
3. Blodprøvetaking fra halsvenen
- Utfør denne prosedyren med hjelp av ett ekstra etterforsker; en håndtering av marsvin, og man innsamling av prøven.
- Anaesthetize marsvin med en egnet bedøvelse for hele varigheten av denne fremgangsmåten. En blanding av tiletamine (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xylazin (1,49 mg / kg) og butorfanol (0,06 mg / kg) kan brukes.
- Plasser bedøvet marsvin på ryggen og forsiktig trekke forbena caudally.
- Barbere og desinfisere (f.eks., Med 70% alkohol) ventrale del av halsen.
- Coat sprøyten med enten heparin eller EDTA før prøvetaking for å redusere risikoen for blodpropp.
- Palper krageben og sette inn en 25 G (eller 23 G) nål montert på en 1 ml sprøyte apsvis totalt 1 cm lateralt i forhold til midtlinjen på nivå med skulderleddet. Oppbevar sprøyten i en svak oppadgående og medial vinkel mens søknad et svakt undertrykk. Unngå å skade den underliggende strukturer som halsvenen ligger ganske overfladisk. Vippe halsen av marsvin litt bakover for å gi økt stase av venen.
- Slipp forbena når blodprøven blir oppnådd, og lindre stasis før nålen er trukket tilbake. Bruk en tørr stykke gasbind eller bomullsdott til å bruke milde press på stikkstedet.
- Returnere dyret til en recovery bur og overvåke for å sikre hemostase og utvinning fra anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire ulike tilnærminger til ikke-terminal in vivo blodprøvetaking teknikker i enten bevisst eller bedøvede marsvin har blitt presentert. Figur 1 illustrerer løpet av lateral saphena og tarsal blodåre i marsvin og mulige injeksjonssteder. Øret vener synlige på den dorsale overflate av et marsvin øret er illustrert i figur 2. Disse årer kan benyttes ved blodprøvetaking når bare en meget lite volum kreves. Posisjonen til marsvin for jugular blodprøvetaking er viser i figur 3. Forløpet av vena jugularis er illustrert med piler med den øverste pil som peker på den anbefalte punkteringsstedet.
Figur 1. Den laterale saphenous og tarsal blodåre i marsvin. Illustrerer Bildet kurset ogstikkstedet for blodprøvetaking fra den laterale saphena (øvre pil) eller tarsal vene (nederst pil) i marsvin.
Figur 2. Ear årer. Dette bildet illustrerer øret årer (piler) som vises på framsiden av et marsvin øre. Disse årer kan benyttes ved blodprøvetaking når bare et meget lite volum kreves.
Figur 3. Plassering av marsvin for halsvene blodprøver. Dette illustrerer posisjonen til marsvin og punkteringsstedet for halsvene blodprøver. Pilene viser løpet av halsvenen med den øverste pil som peker mot den anbefalte stikkstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med mus og rotter, marsvin er engstelig av natur og må nærmet rolig og håndteres på riktig måte for å redusere stress. Fra et dyrevelferd synspunkt, opptrer med forsiktighet er naturligvis en prioritet; men dette vil også redusere risikoen for angstassosierte effekter på de innsamlede data, f.eks., økte blodnivåer av kortikosteroider og glukose 12.. Likeledes vil daglige håndtering tilvenne dyrene til normale prosedyrer og kan tjene til å redusere stress ytterligere. Praktisk kompetanse i et bestemt blodprøvetaking teknikken bør oppnås ved først å observere en erfaren operatør og deretter gjennomføre teknikken under tilsyn inntil kompetanse er oppnådd. Den valgte teknikken bør ideelt både redusere stress og ubehag til et minimum, men også for å sikre overlevelse samt etterlevelse av kravene i utvalgsstørrelse og tilgjengelighet. For alle presenterte blodprøvetakingsmetoder aseptiske teknikker bør værebrukes for å minimalisere risikoen for infeksjon, og sikre samlingen av ukontaminert prøver.
De illustrerte tilnærminger til blodprøvetaking sikre overlevelse av dyr forutsatt at prøvevolum og frekvens er oppnådd i henhold til retningslinjene, og alle kan bli brukt for gjentatt prøvetaking i både kortsiktige og langsiktige studier seks. Dette gjør konsekvent oppfølging av individuelle dyr over tid herved redusere varians og antall inkluderte dyr i samsvar med de 3R '(reduksjon) 13,14. Teknikkene som presenteres her har ulike områder av oppnåelig prøvevolum (noen ul opp til 1-2 ml) som bør vurderes før du starter et eksperiment. Selv om fremgangsmåter for å samle blod fra vena jugularis i un-bedøvet marsvin har blitt beskrevet 12 Vi anbefaler bruk av anestesien for å redusere stress og ubehag så mye som mulig. Når du gjør dette, bør valget av anestesi være forsiktigy adressert, og bemerker at marsvin er notorisk vanskelig å anaesthetize og vise store variasjoner effektiviteten av bedøvelsen, så vel som en høy følsomhet overfor indusert depresjon respirasjon 15,16. Som halsvenen hos marsvin er verken synlig eller følbar noen reduksjon i stasis / venøs dilatasjon kan øke prøvetakings vanskeligheter, slik at det er generelt anbefalt å unngå vaso-constricting agenter i anestesiblandinger. . Videre kjente effekter av spesifikke bedøvende midler som kan forstyrre den ønskede datainnsamling f.eks kardiovaskulære effekter og / eller økte blodsukkernivåer etter α 2 - bør agonist handlinger i gnagere vurderes 16,17. Bruken av innånding anestesi som isofluran kan også være et alternativ, men som intubasjon hos marsvin er en svært vanskelig oppgave omsorg må tas for å unngå interferens ved innånding-maske med hodet / nakken posisjon som dette kan complicspiste prosedyren unødvendig. Generalisert anestesi f.eks., Ved inhalering er også nødvendig for hjertepunksjon som kan gi et større prøvevolum. Imidlertid er hjertepunktur en terminal prosedyre og derfor ikke relevant for gjentatt sampling og vil ikke bli beskrevet ytterligere.
Mulige bivirkninger som blødninger, blåmerker, blodpropp, infeksjon og arr kan oppstå etter punktering av en blodåre. Etter vår erfaring, ikke marsvin ikke oppviser en økt risiko for slike uønskede komplikasjoner i forhold til andre gnagermodeller, forutsatt at fremgangsmåten utføres som beskrevet i det aktuelle manuskript. Som halsvenen ikke kan visualiseres fra den ytre overflaten, er det meget viktig å avlaste stasis før kanylen trekkes ut og til å gi tilstrekkelig hemostase for å minimalisere risikoen for peri-venøse blødning og bruising. Ved bivirkninger bør behandlingen alltid søkes fra ansvarlig veterinænarian. Av hensyn til god dyrevelferd og vitenskap, må alvorlige betraktninger tas hensyn til den kombinerte effekten av prøvevolum og frekvens, og valg av prøvetakingsteknikk. Alle de beskrevne blodprøvetaking teknikker har blitt grundig testet og anvendt for gjentatt in vivo blodprøvetaking av studier innen vår forskning anlegget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre. Alle prosedyrer ble godkjent av forsøk med dyr loven av Danmark, som er i samsvar med Europarådets konvensjon ETS 123.
Acknowledgments
Vi erkjenner dyktig hjelp av Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft og dyre vaktmester ved Institutt for eksperimentell medisin, Frederiksberg Campus, Fakultet for helse og medisinske basalfag, Universitetet i København, Danmark. Jacob Lønholdt takkes for hans utmerkede teknisk assistanse i filme prosedyrene. Denne studien ble støttet delvis av LIFEPHARM Senter for in vivo Farmakologi og Københavns Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electric shaver | Wella (Contura), Denmark | 273207 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Syringes | B.Braun-Omnifix-F, Germany | 9161406V | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Needles | BD Microlance, Spain | 301156 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Microvette collection tube | Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany | 201,288,100 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Accu-Check analyzer | Roche A/S Diagnostics, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Heparin 5000 IE/ml | LEO Pharma, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Zoletil 50, Chemvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Neutral eye ointment | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Gauze or a cotton swab | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Disinfectant (70% alcohol) | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
References
- DeOgburn, R., et al. Effects of increased dietary cholesterol with carbohydrate restriction on hepatic lipid metabolism in Guinea pigs. Comp.Med. 62 (2), 109-115 (2012).
- Fernandez, M., Volek, J. S. Guinea pigs a suitable animal model to study lipoprotein metabolism, atherosclerosis and inflammation. Nutr Metab (Lond). 3 (17), (2006).
- Frikke-Schmidt, H., Tveden-Nyborg, P., Birck, M. M., Lykkesfeldt, J. High dietary fat and cholesterol exacerbates chronic vitamin C deficiency in guinea pigs. Br J Nutr. 105 (1), 54-61 (2011).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig, ferret and mink. Lab Anim. 32 (4), 364-368 (1998).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Guillen, J.
- Ye, P., Cheah, I. K., Halliwell, B. High fat diets and pathology in the guinea pig Atherosclerosis or liver damage. Biochim Biophys Acta. 1832 (2), 355-364 (2013).
- Tveden-Nyborg, P., et al. Maternal vitamin C deficiency during pregnancy persistently impairs hippocampal neurogenesis in offspring of guinea pigs. PLoS One. 7 (10), 12-18391 (2012).
- Schjoldager, J. G., Tveden-Nyborg, P., Lykkesfeldt, J. Prolonged maternal vitamin C deficiency overrides preferential fetal ascorbate transport but does not influence perinatal survival in guinea pigs. Br J Nutr. 110 (9), 1573-1579 (2013).
- Greulich, S., et al. Secretory products of guinea pig epicardial fat induce insulin resistance and impair primary adult rat cardiomyocyte function. J Cell Mol Med. 15 (11), 2399-2410 (2011).
- Swifka, J., Weiss, J., Addicks, K., Eckel, J., Rosen, P. Epicardial fat from guinea pig a model to study the paracrine network of interactions between epicardial fat and myocardium. Cardiovasc Drugs Ther. 22 (2), 107-114 (2008).
- Pilny, A. A.
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Van, L. J., et al. eAssessing the application of the 3Rs a survey among animal welfare officers in The Netherlands. Lab Anim. 47 (3), 210-219 (2013).
- Sloan, R. C., et al. High doses of ketamine-xylazine anesthesia reduce cardiac ischemia-reperfusion injury in guinea pigs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (3), 349-354 (2011).
- Jacobson, C. A. A novel anaesthetic regimen for surgical procedures in guinea pigs. Lab Anim. 35 (3), 271-276 (2001).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine xylazine anesthesia in rats mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med(Maywood). 230 (10), 777-784 (2005).
