Summary
הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.
Abstract
הגילוי של BCR / ABL כאונקוגן נהג בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) הביא לפיתוח של גליבק, אשר, למעשה, הוכיח את הפוטנציאל של מיקוד kinase בסרטן על ידי יעילות טיפול בחולי CML. תצפית זו חוללה מהפכה בפיתוח תרופות למקד קינאז שהעור מעורב בגידולים ממאירים שונים אחרים, כגון, EGFR, B-RAF, KIT וPDGFRs. עם זאת, חסרון עיקרי אחד של טיפולים אנטי-kinase הוא ההופעה של מוטציות עמידות לתרופות טיוח היעד להפחיתה או איבדה את הזיקה לסמים. הבנת המנגנונים המועסקים על ידי גרסאות עמידות לא רק עוזרת בפיתוח מעכבי הדור הבאים, אלא גם נותנת תנופה לניהול קליני באמצעות רפואה אישית. דיווחנו אסטרטגית retroviral וקטור מבוססת הקרנה לזהות את הספקטרום של ההתנגדות המקנה מוטציות בBCR / ABL, אשר סייעה בפיתוח הדור הבא BCR / ABL מעכבים. באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כאן אנו מתארים בשיטות הקרנה חוץ גופית שמנצלות את תאי BAF3 העכבר מבטאים את ספריית המוטציה האקראית של קינאז JAK2.
Introduction
קינאז החלבון הם אנזימים רגולטוריים מרכזיים של מסלולי העברת אותות תוך-תאיים שלכאורה לווסת כל פונקציה סלולרית. בקרה נאותה של איתות kinase בתיווך היא קריטית להומאוסטזיס ופיתוח, אשר רובם מסתמך על רגולציה ראויה של קינאזות, phosphatases והשפלה שלה על ידי UPS (מערכת היוביקוויטין פרוטאזום). קינאז deregulated נמצא במרכז הבמה של סוגי סרטן רבים ומעורב בשורה של מחלות בבני אדם 1. הגנום אנושי מקודד יותר מ -500 קינאז חלבון שנקשר, במישרין או בעקיפין, ל~ 400 מחלות אנושיות 2. תצפיות אלה תמכו ברעיון למיקוד טיפולי של קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנים 3-5.
ההפגנה של מעכבי קינאז ABL, כגון גליבק, בטיפול בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) סיפקה את ההוכחה של מושג לגישה זו 6,7. תצפית זו מהפכה בנמלים לא רקi-kinase טיפול אלא גם נאכף הרעיון לזהות נגעים הגנטיים במחלות אחרות גידולים למיקוד טיפולי, שתובלנה לגילוי של מוטציות סרטניות בJAK2 מפוליציטמיה (PV) וחולים עם שאתות myeloproliferative (MPN). תגלית זו עוררה עניין רב בטיפול בMPNs על ידי מיקוד JAK2 במעכבי קינאז מולקולה קטן. עכשיו, כמעט תריסר של מעכבי JAK2 נמצאים בניסויים קליניים ואחד מהם אושר לאחרונה לטיפול במיילופיברוזיס ראשוני. בעוד מיקוד ספציפי של קינאזות שעור על ידי מעכבי מולקולה קטנים בסרטן להביא תוצאות מבטיחות, היא גם סובלת ממפתחים עמידים לטיפול. למעשה, עד כה, חולים שטופלו במעכבים קינאז, כגון גליבק, ארסתי, Erlotinib וdasatinib פיתחו מוטציות התנגדות בעיקר על ידי רכישת מוטציות בתחום קינאז שתרופה מיועדת ל8-10. התנגדות כתוצאה ממוטציה בגן מדגישה את המגבלות of ממוקדת טיפול יחיד נגד קינאז שהעור, ומייצגת את האתגר הבא בהתפתחות של סרטן כימותרפיה יותר ויותר מוצלחת. השלכות מכניסטית ופונקציונליות של עמידות לתרופות צריכות לספק רציונל לבחירה ועיצוב של תרכובות משלימות לפיתוח תרופות. מוטציות שזוהו באמצעות מסכי במבחנה, הראו רמה גבוהה של מתאם עם אלה שנמצאו בחולים. לכן, הקרנה במבחנה למוטציות המעניקות סמים התנגדות לזוגות יעד תרופה ניתנו באסיסטים פיתוח קליניים או פרה-קליניים בזיהוי דפוסי ההתנגדות שעלול לגרום להישנות קלינית. זיהוי של מוטציות אלה הוא לא רק מועיל בניטור החולים לתגובת סמים ולהרע, אלא גם חיונית לעיצוב של מעכבי הדור הבא חזקים יותר. לדוגמא, פיתוח של מעכבי BCR / ABL הדור הבא, Nilotinib וPonatinib, התאפשרו בגלל MEC יותרהבנות hanistic צברו מmutagenesis, מבני, ומחקרים תפקודיים.
מוקדם יותר, יש לנו דיווחו על התוצאות של המסך שלנו באמצעות mutagenesis של BCR / ABL האקראי כדי לחשוף את הספקטרום של מוטציות המקנות עמידות למעכבים כגון 11,12 גליבק, 12 PD166326, ו -13 AP24163. התוצאות לא רק זיהו את המוטציות המקנות הישנות התנגדות ומחלה קלינית, אלא גם סיפקו את הבנת מכניסטית של עמידות לתרופות ולעקרונות המסדירים את תפקוד kinase 11,14. כאן אנו מספקים פירוט מתודולוגיים נוסף, באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כדי לאפשר יישום רחב יותר של אסטרטגית הקרנה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והטיפול האתיים בבעלי חיים, ועל-פי פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC.
תחזוקת קו 1. תא
- תאי BAF3 תרבות במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ובינוני תרבות בילה של תאי Wehi. לגדל תאי HEK293T בDMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר). שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2.
2. פלסמיד בנייה
- לשכפל את העכבר JAK2 ואיזופורם JAK2-V617F שבעור בpMSCV-פור-GW על ידי LR clonase באמצעות הליך שיבוט רקומבינציה סטנדרטי.
- לבניית וקטור הביטוי בלוציפראז (pMSCV-לוק-הדובדבן-GW) המשמש ב- viההדמיה vo, להגביר לוציפראז מוקטור pLVX-ט-ON על ידי PCR באמצעות פריימרים (לוק-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG ולוק-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) ואחריו עם שיבוט בpENTR-SD-TOPO ליצור pENTR-לוק, המשמש להעביר את הגן בלוציפראז בוקטור retroviral, pMSCV-דובדבן-GW על ידי שיבוט תיווך רקומבינציה באמצעות clonase LR.
3. הכנת ספריית מוטציה אקראית, הקרנה וזיהוי המוטציות
3.1) אקראי mutagenesis
- באורך מלא שיבוט של סוג בר JAK2 ומוטצית V617F לתוך וקטור retroviral pMSCV-הפור-GW באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה מסחרית.
- השתמש 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד JAK2-V617F להפוך, XL-1 אדום, E. תאי coli, שהוא פגום במנגנוני תיקון DNA ובכך מאפשר להם לשלב מוטציות אקראיות בעת השכפול. באופן ספציפי יותר, לערבב 50-100 ng של DNA (DNA של יותר מ -100 ng מקטין את יעילות שינוי) עם 100 μl של תאים מוסמכים בצינור פוליפרופילן טרום צונן וטופחו על קרח למשך 30 דקות, בעדינות מתערבלת כל 5 דקות. לכיסוי ספרייה טוב, להשתמש 05:56 צינורות של תאים מוסמכים.
הערה: DNA של יותר מ -100 ng מקטינה את יעילות שינוי - לטבול את הצינור באמבט מים ב 42 ° C להלם חום של 45 שניות ולדגור על קרח במשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום SOC (tryptone 2.0%, 0.5% תמצית שמרים, 0.05% NaCl, 10 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ MgSO4, ושל 0.4% D-גלוקוז). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב225-250 סל"ד 90 דקות.
- תאי פלייט מצינור אחד בארבעה 10 סנטימטרים צלחות LB-אגר המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירה הצלחות ל16-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- בעקבות מושבות גלויות, לאסוף אותם על ידי גירוד הצלחות עם מגרד צלחת סטרילית. תאי בריכה מכל DNA צלחת ופלסמיד המבודד באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרית.
הערה: בדרך כלל מושבות קטנות ולקחת 18-24 שעות כדי להיותגלוי כי אלה הם זני חיידקים הגדלים לאט. בשלב זה, להעריך את ההטרוגניות של מוטציות בספרייה על ידי עיכול הגבלה עם חותך תכוף כגון Sau3A1 או Taq1 או רצף.
3.2) ייצור Supernatants retroviral והתמרה
- יום אחד לפני transfection, צלחת 4 x 10 6 תאי 293T HEK על 100 מנות סנטימטר בDMEM המכילות 10% FCS, פניצילין / סטרפטומיצין וL-גלוטמין 2 מ"מ.
- למחרת, להחליף את המדיום וtransfect התאים עם ספריית pMSCV-JAK2-V617F mutagenized. לכל צלחת 10 סנטימטרים, לערבב 10 מיקרוגרם של ה- DNA (5 מיקרוגרם של ספריית פלסמיד ו5 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה retroviral, pCLEco) עם 40 μl של FuGENE להיקף כולל של 400 μl באמצעות תקשורת DMEM חופשית בסרום. דגירה תמהיל DNA ושומנים בדם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר 20 דקות להוסיף הטיפה המורכבת DNA שומנים בדם חכם על גבי תאי HEK293T.
- לאחר שש שעות, לשנות את תקשורת transfection wה- i תקשורת טרי ודגירת הצלחות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס לייצור וירוס. לאחר 48 שעות של דגירה, לאסוף supernatants ויראלי המסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר acrodisc.
3.3) בחירה של שיבוטים עמידים במבחנה
- למוטציות JAK2-V617F תרופה עמידות, transduce 100 מ'BAF3 תא עם של supernatants וירוס שיש כייל נגיף של 0.5-1 x10 6 100 מיליליטר. באופן ספציפי יותר, לערבב 10 8 תאים עם של supernatant וירוס 100 מיליליטר להיקף כולל של 300 מיליליטר באמצעות תקשורת RPMI, סרום המכיל 10% ו -24 מיקרוגרם / מיליליטר של polyberene (ריכוז סופי של ployberene הוא 8 מיקרוגרם / מיליליטר). להפיץ מערבלי תאים אלה במספר רב של שש צלחות היטב (4-5 מיליליטר לכל טוב).
- צנטריפוגה הצלחות ב 1,250 XG למשך 90 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- למחרת, בריכת התאים יחד ומערבבים עם Ruxolitinib ובינוני המכילים אגר רך ומצופה בsix צלחות גם. עבור כל ריכוז תרופה, לערבב 10 מיליליטר של תאי transduced BAF3 (10-20 מיליון תאים) עם הכמות המתאימה של Ruxolitinib בשפופרת 50 מיליליטר. מרכיבים את הנפח 40 מיליליטר באמצעות RPMI המכיל סרום 20%. הוסף 10 מיליליטר של אגר 1.2% לתאים, mixcarefully וצלחת בשש צלחות גם.
- דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. פיק המושבות עמידות באמצעות טיפים פיפטה 0.2 מ"ל ותת-תרבותם בנפרד ב 24 צלחות גם במשך 3-4 ימים.
- קציר תאי BAF3 העמידים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות בטמפרטורת חדר. לבודד את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי מסחרית. PCR להגביר אורך מלא JAK2 cDNA משל פריימרים הגנומי DNA באמצעות (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG וmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) וארוכת תבנית להרחיב מערכות PCR איכות גבוהה 100 ng.
- הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. בלו 3.4 kb של להקת DNA המייצג מסגרת קידוד JAK2 ולבודד את ה- DNAבאמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרית. רצף באורך המלא של cDNA באמצעות 8 פריימרים פנימיים (P1 - P8) פורש רצף הקידוד ורצפים לנתח באמצעות תוכנה מסחרית.
4. במבחנת אישור של מוטציות עמידות
שיבוטים תא רבים לשאת מוטציה יותר מאחד, כדי לבדוק את תרומתו של כל מוטציה בפנוטיפ התנגדות, ליצור גרסאות שנבחרו על ידי מוטגנזה מכוונת באמצעות פלסמיד pMSCV-JAK2V-617F כתבנית.
- בצע mutagenesis האתר מכוון על פלסמיד pMSCV-JAK2-V617F באמצעות ערכת mutagenesis מסחרית וoligonucleotides נועד ליצור מוטציות נקודה. לאשר את זהותם של שיבוטים מוטציה על ידי רצף.
- Transduce תאי BAF3 עם רטרווירוסים נעשה באמצעות פלסמידים מוטציה אחריו עם בחירה באמצעות puromycin ב1μg / ml.
- צלחת 10 4 תאי BAF3-JAK2-V617F (50 μl של RPMI עם 10% FCS) לבאר כל צלחת גם 96. נפרדly להוסיף 50 μl של תקשורת ruxolitinib המכיל את הבארות על פני הצלחת (הריכוז הסופי: 0, 1, 3, 5, 10, ו -20 מיקרומטר), ודגירת הצלחות במשך 60 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- להעריך את כדאיויות תא על ידי הוספת 10 μl של מגיב WST-1 לכל ואחרי היטב עם דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. שיא הספיגה ב A450 באמצעות קורא צלחת. לבצע את כל מבחני בשלושה עותקים ועלילה בממוצע ספיגה נגד INCB018424 ריכוזים. לבצע עקומת sigmoidal מיטבית באמצעות אלגוריתם הולם עקומה ליניארית. ציון ריכוז התרופה וכתוצאה מכך 50% כדאיות תא כIC50 הסלולרי.
- בשלב הבא, צלחת שישה מ'BAF3 תאים לבטא גרסאות JAK2 בשש צלחות גם במדיום RPMI המכיל סרום 10% עם עלייה בריכוזים של ruxolitinib וטופחו במשך 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, וlyse ב -20 מ"מ טריס-Cl (pH 7.5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 5 מ"מ EDTA, 1 המ"מ EGTA, 1 פלואוריד מ"מ נתרן, 2 מ"מ נתרן Vanadate, ו -5% גליצרול בתוספת מעכבי מעכבי פרוטאז קוקטייל וphosphatase. Sonicate ההשעיה תא 1 דקות ואחריו תוספת של חיץ טעינת ג'ל 5x (350 מ"מ טריס-HCl [pH 6.8], 500 מ"מ DTT, 15% SDS, 10 מ"מ Benzamidine, 5 מ"מ EDTA, 5 מ"מ EGTA, 5 מ"מ נתרן Vanadate , קוקטייל פרוטאז, 50% גליצרול, ו0.001% bromophenol כחול) וdenaturation על 70 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- לפתור את החלבונים על 8% ג'ל polyacrylamide SDS בתנאי denaturing. בצע immunoblotting עם STAT5 אנטי-phopsho חד שבטי עכבר. להפשיט את הכתמים וreprobed עם נוגדן אנטי SATA5 polyclonal ארנב. דמיינו את הלהקות באמצעות ריאגנטים ECL בהתאם להמלצתו של הספק.
5. בVivo אישור ב
- Transduce תאי BAF3 להביע לוציפראז ודובדבן (transduced עם רטרווירוסים עשויים pMSCV-לוק-cherר"י GW) עם וירוסים להביע JAK2-V617F וריאנטים עמידים. בחר תאים ששורדים בחירת puromycin לביטוי של JAK2 וריאנטים התנגדותה.
- הזרק שני מיליון תאים / דובדבן BAF3-לוק ומתרחבים ביצוע JAK2-V617F וריאנטים העמידים שלה ב -200 μl של PBS על 6 עכברי BALB / C באמצעות הזרקה לוריד זנב.
- אחרי שלושה ימים של השתלות תאים, להזריק עכברים עם Ruxolitinib (100 מ"ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך שבועיים.
- לבצע הדמיה פליטת אור מבוסס לוציפראז עם מערכת הדמיה. .
- בקיצור, להכין פתרון luciferin ידי המסת 300 מ"ג ל- 25 מיליליטר של מים סטריליים deionized, aliquot בנפח ובחנות קטנים יותר.
הערה: luciferin החנות ב -80 ° C ולהגן מפני אור עד לשימוש. - להזריק 250 μl לכל עכבר על ידי IP כדי להשיג 125 מ"ג / קילוגרם בכל עכבר. להרדים את העכברים מאותה קבוצה יחד באמצעות isoflurane בשאיפה (1.5% -2.0%) בקופסא אטומה. החל משחה וטרינר על העין אלקטרוני למניעת יובש.
הערה: הזמן שלוקח לעכברים לישון (10-15 דקות) אפשרה פעילות luciferin לשיא. שמור את הזמן עקבי בין הקבוצות, כדי למנוע וריאציה.
- בקיצור, להכין פתרון luciferin ידי המסת 300 מ"ג ל- 25 מיליליטר של מים סטריליים deionized, aliquot בנפח ובחנות קטנים יותר.
- העבר את העכברים מייד לבמת חדר הדמיה ולשמור על הרדמה בisofluorane 1.5-2% במהלך הליכי הדמיה. עכברי תמונה עם חשיפת שניות רציפה 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, ו -300. צלם תמונות ולכמת עוצמת פליטת אור באמצעות רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. בעקבות הדמיה להחזיר את העכברים חזרה לכלוב שלה.
- ל, הכולל תאים bonemarrow in vivo קציר chimerism. להרדים את העכברים עם CO 2 דקות 5 אחריו עם נקע בצוואר הרחם. לקצור את העצמות ולמחוץ ב 4 מיליליטר PBS הקר כדי לאסוף את מח העצם. נתח את התאים חיוביים דובדבן אחוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות FACS. לאסוף עשרים אלף אירועים מכל מדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הופעתה של מוטציות גנטיות מהווה אתגר גדול עבור הטיפול אנטי kinase הממוקד. מחקרי מוטאציות, מלבד מתן תובנות מכניסטית ופונקציונליות שהם סייעו בבחירה ועיצוב של פיתוח תרופות מהדור הבא, גם מאפשר ניהול קליני טוב יותר ועשויים בעתיד להיות מועיל יותר לטיפול מותאם אישית. בניסוי זה, אנו מציגים הקרנה למוטציות ruxolitinib התנגדות בkinase JAK2-V617F (איור 1). אנו נבנו וקטור pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway על ידי החדרת העכבר באורך מלא JAK2-V617FcDNA לpMSCV-הדובדבן-GW. מומלץ להשתמש במאכסן (XL-1 זן אדום של E. coli) לפתח מוטציות אקראיות על הבחירה הפופולרית ביותר של שיטה, שהוא PCR, בשל מגבלותיה הקשורים לברי הטיה רצף וגן גדול יותר קשים כדי להגביר . ספריית DNA mutagenized באופן אקראי הייתה transfected לתאי HEK293T לייצור רטרו-וירוס. vir מוטציה אלהשימושים שמשו ל, transduce תאי BAF3 שנבחרו לצמיחת מושבה ברכה-אגר בהעדר IL-3 עם 1 או 5 מיקרומטר של Ruxolitinib. בתנאים אלה, מושבות נובעות רק מהתאים הנושאים cDNAs JAK2V-617F שמבטא גרסה פונקציונלית ועמידה של קינאז. אחרי 10 - 14 ימים, מושבות בודדות מופרדות היטב נקטפו, אשר מגוון בגודלם, והרחיב אותם בתרבות הנוזלית. הדנ"א הגנומי היה מבודד מהתאים אלה. Provirus נמצא על ידי הצלה ישירה או על ידי PCR. Proviruses התאושש היו רצף לזהות מוטציות (איור 1). ניתוחי רצף בוצעו באמצעות חבילת DNASTAR של Lasergene.
בגלל שיבוטים תא רבים נשאו מוטציה יותר מפעם אחת, אנו ממליצים בחום אימות מוטציות אלה בבידוד על ידי שני במבחנה ובמבחני vivo (איורים 2 ו -3). כדי לאמת את הפעילות של גרסאות בבידוד,גרסאות שנבחרו נוצרו על ידי אתר מכוון mutagenesis של רצף JAK2V-617F. גרסאות אלו מחדש לתאי BAF3, ונמדדו ביכולת התפשטות תאים במינון של Ruxolitinib שונה כדי להעריך IC50 (ערכי IC50, איור 2 א). מבחני ביוכימיים מבוצעים לphosphotyrosine או phospho-STAT5 על ידי ניתוח immunoblot על lysates החלבון של תאי BAF3 שהודגרו עם הגדלת מינון של Ruxolitinib כדי לשלול כל התנגדות יעד את תיווך (איור 2). מוטציות מציגות ערכי IC50 משופרים וautophosphorylation המתמשך בריכוזים גבוהים יותר ובכך Ruxolitinib אישרו להיות גרסאות עמידות בפני תרופה. מכיוון שרבי מוטציות עמידות להראות תגובת מינון משתנה, ולכן זה הכרחי כדי לבדוק אם מוטציות אלה תקנינה גם בהתנגדות vivo. בדרך כלל, אנו ממליצים לבחון רק 2 -3 גרסאות שונות לניסויי in vivo, כפי שהם יקרים ומייגע. כדי לאמת את התנגדות in vivo, תאי BAF3 הונדסו לבטא גרסאות JAK2-V617F ולוציפראז / דובדבן, כדי לאפשר מעקב in vivo. עכברים הוזרקו 1-2 מיליון תאי דובדבן חיוביים (להביע גרסאות JAK2 ולוציפראז), ואחריו הזרקת Ruxolitinib במשך שבועיים. אחרי שבועיים, עכברים הם צילמו לפליטת אור-זרז לוציפראז (איור 3), וגם לchimerism BAF3 בbonemarrow ודם היקפי על ידי מדידת הקרינה של תאים חיוביים דובדבן (איור 3). עכברים להביע JAK2-V617F רגישים לRuxolitinib, ואילו גרסאות עמידות להראות תוספת מתקדמת בפליטת אור על פני תקופת טיפולים, ובכך מצביעה על כך שתאי BAF3 להביע גרסת JAK2-V617F עמידים לטיפול Ruxolitinib in vivo.
איור 2:. תכנית מראה באימות מבחנה באמצעות מבחני תלויים מינון שגשוג תאים (א) ומערבי (B) סופג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3: ייצוג סכמטי של לוציפראז in vivo באמצעות אימות זרז מדידת פליטת אור. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה הקלינית של גליבק בטיפול CML הפגינה לא רק את הפוטנציאל של מיקוד קינאז האודם על ידי מעכבי מולקולה קטנים, אבל מגבלות גם חשפו טיפול ממוקד: חזרה קליני והופעה של מוטציות עמידות לתרופות בגן המטרה. זיהוי מוטציות התנגדות מסייע בניהול ופיתוח טובים יותר של מעכבי הדור הבא קליניים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לזהות מוטציות עמידות לתרופות בגן הממוקד. שיטה זו משתמשת בספריית פלסמיד mutagenized באופן אקראי שנבנתה בE. coli, כדי לבטא את חלבוני המוטציה. הספרייה לאחר מכן הציגה בBAF3 תאים (רגישים לשינוי על ידי אונקוגן), אחריו עם בחירה של שיבוטים תא בנוכחות של חומרים כימותרפיים. רצף של גן ממוקד משיבוטים עמידים מזהה מוטציות מקנות התנגדות. לבסוף, מוטציות המזוהים מחדש על ידי אתר מכוון mutagenesis כדי לאמת אותם לעמידות לתרופות.
באמצעות אסטרטגיה זו הגדרנו את הספקטרום של המוטציות בJAK2 וBCR / ABL המקנות התנגדות לRuxolitinib וגליבק, בהתאמה. אנו מזוהים יותר ממאה מוטציות בBCR / ABL. חוץ מזה, זיהוי כל המוטציות העיקריות שזוהו בחולים, שיטת ההקרנה שלנו אפשרה לנו לזהות החלפות רומן של שאריות הן בתוך ומעבר לתחום קינאז. מעניין, כל המוטציות מהמסך שלנו זוהו בדגימות מטופל אך תהליך זה לקח כמעט יותר מ -10 שנים 15, הממחיש את היכולת של מסך זה כדי לצפות מוטציות שתהווינה עמידות לתרופות קליניות בעייתית וכך. בעוד הקרנה עמידה באמצעות mutagenesis האקראי מספקת יתרונות רבים בהשוואה לשיטות אחרות, יש בעיות פוטנציאליות להיות מודעת כאשר בעקבות הליך מיון. לכל הקרנה, מומלץ מאוד לBAF3 תאים להיות תלוי באופן מלא ביעד שנגדו רזהעמדה הוא ביקש. כישלון או תלות חלקית בגן המטרה עשוי שלא לפתח שיבוטים עמידים נכונים וסביר להניח לפתח חיוביים שגוי. לדוגמא, ארבעה מחקרים שונים שבוצעו הקרנה עמידה נגד מעכבי JAK2 באמצעות BAF3 תאים transduced עם או EPO או קולטני MPL כדי להקל על תלות JAK2-V617F 16-19. רק שמונה מוטציות עמידות מוגבלות לkinase תחום זוהו ממסכים אלה, אם כי שיבוטים עמידים רבים פיתחו שחסרי מוטציות, ככל הנראה בשל הופעתה של תוצאות חיוביות שגויות, שיוחסה לheterodimerization של JAK1 וJAK3 עם קולטנים ציטוקינים. לכן, כדי למנוע אובדן של תלות JAK2 בצענו הקרנה עמידה בBAF3 רגיל שהראתה מבחר חזק של שיבוטים עמידים נגד Ruxolitinib וכל שיבוטים אלה הראו נוכחות של מוטציות עמידות. בהתבסס על תצפיות אלה, במטרה לרתום את מלוא הספקטרום של מוטציות עמידות, אנו ממליצים שתא BaF3ים צריך להיות תלוי באופן מלא בkinase הממוקד כדי למנוע את ההופעה של תוצאות חיוביות שגויות, כפי שהיה מקובל בהקרנות עמידות קודמות שבוצעו נגד מעכבי JAK2 16,17. בנוסף, הוא קריטי כדי למנוע תנאי תרבות בתפזורת שבו תאי מחסה מוטציות שונות הם אספו יחד ואפשרו להרחיב בתרבות הנוזלית, שכן זה יכול להוביל לדומיננטיות משובטים של כמה גרסאות מאוד עמידות בפני תרופה. לדוגמא, במהלך בחירה ראשונית לimatinib-התנגדות של mutagenized BCR-ABL בתרבות נוזל בכמות גדולה, מצאנו רק 4 מוטציות שהיו מיוצגות מספר פעמים בתוך 100 הראשונים מבודדים רצף. לכן, הקרנה באמצעות אגר רך מאפשרת שיבוטים גדלו איטיים בדרגות צנועות יותר של עמידות לתרופות שניתן להפיק שלא להיות מזוהה באמצעות תרבות בתפזורת. מסיבה זו, מומלץ לגדול תרבות בתפזורת לפני הבחירה רק ל14-16 שעות, ואחריו עם בחירת תרופה ללא IL3 באגר רך. באקס שלנוperience, גדל תרבויות מעבר 36 שעות לאחר התמרה ויראלית נוטה להיות נשלטת על ידי שיבוטים שגשוג מאוד, אשר מהווה סיכון לאבד שיבוטים גדלו איטי (בחולשה טרנספורמטיבי). כמו כן, שימוש בתאים מנקודתי זמן קודמת כגון 6-8 שעות לאחר התמרה ויראלית נוטות לבחור עבור שיבוטים טרנספורמטיבי או overexpressing מאוד, ובכך גורם להטיה ומצג שווא בזהות ובתדירות של שיבוטים התנגדות. לכן, אנו ממליצים על שימוש בתאים שגודלו עבור התמרה 14-16 לאחר שעות נגיפיות להקרנה, המספק מבחר הדוק של שיבוטים בודדים ומונעת דומיננטיות משובטים נצפו בדרך כלל בתרבויות נוזל בכמות גדולה.
זה חיוני כדי לאשר את היכולת של מוטציה מועמד להקנות עמידות בבידוד, שכן חלק השיבוטים זוהו יש מוטציות רבות. עבור מסך JAK2-V617F, אנחנו מחדש ברוב של המוטציות שזוהו מספריית mutagenesis האקראי שלנו באמצעות mutage אתר מכווןNesis. לאחר שהציג את מוטציות בודדות לתוך תאים טריים, הם היו אז גדלו בנוכחות של תרופות שונות כדי לקבוע IC50s עבור כל מוטציה. גם בדקנו שתי גרסאות שונות עמידות להתנגדות in vivo על ידי ניטור פליטת אור כדי לאשר את היכולת של מוטציות בודדות אלה כדי לגרום לעמידות לתרופת in vivo נוסף.
לאור ההצלחה של טיפול אנטי-kinase בטיפול בסוגי הסרטן שמגולוון גל של מעכבי קינאז במרפאות, חשוב לזהות את ההתנגדות קלינית הבעייתית מקנות מוטציות לטוב ניהול מטופל ופיתוח תרופות שיכולים למקד אותם. אסטרטגית הקרנה זו שמשה בהצלחה לזהות מוטציות בBCR / ABL, JAK2 וFLT3 20; עם זאת, אנו מאמינים שזה יהיה בדרך כלל החלים על מגוון רחב של חומרים אנטי-נאופלסטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
