Summary
Aparición de resistencia genética contra la terapia con inhibidores de quinasa plantea reto significativo para la terapia del cáncer eficaz. Identificación y caracterización de mutaciones resistentes contra un fármaco recientemente desarrollado ayuda a una mejor gestión clínica y el diseño de fármacos de próxima generación. A continuación, describimos nuestro protocolo para la detección in vitro y la validación de las mutaciones resistentes.
Abstract
El descubrimiento de BCR / ABL como un oncogén conductor en la leucemia mieloide crónica (CML) dio como resultado el desarrollo de Imatinib, que, de hecho, demostró el potencial de focalizar la quinasa en los cánceres por tratar eficazmente los pacientes con LMC. Esta observación revolucionó el desarrollo de fármacos para orientar las quinasas oncogénicas implicado en varios otros tumores malignos, tales como, EGFR, B-RAF, KIT y PDGFR. Sin embargo, una desventaja importante de las terapias anti-quinasa es la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos que prestan el objetivo de haber reducido o perdido afinidad por la droga. La comprensión de los mecanismos empleados por variantes resistentes no sólo ayuda en el desarrollo de los inhibidores de la próxima generación, sino también da impulso a la gestión clínica usando la medicina personalizada. Nos informó de una estrategia de cribado retroviral vector basado para identificar el espectro de resistencia que confiere mutaciones en BCR / ABL, lo que ha ayudado en el desarrollo de la próxima generación de BCR / ABL inhibidores. Utilizando Ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, aquí nos describen en los métodos de cribado in vitro que utiliza las células BAF3 ratón que expresan la biblioteca mutación aleatoria de JAK2 quinasa.
Introduction
Las proteínas quinasas son enzimas reguladoras clave de las vías de transducción de señales intracelulares que aparentemente modulan cada función celular. Un adecuado control de la señalización mediada por la quinasa es crucial para la homeostasis y el desarrollo, que se basa principalmente en una adecuada regulación de quinasas, fosfatasas y su degradación por UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Quinasas desreguladas están en el centro del escenario de muchos tipos de cáncer e implicado en multitud de enfermedades humanas 1. Genoma humano codifica más de 500 proteínas quinasas que se han relacionado, directa o indirectamente, a ~ 400 enfermedades humanas 2. Estas observaciones apoyaron el concepto de focalización terapéutica de quinasas por los inhibidores de moléculas pequeñas de 3-5.
La demostración de inhibidores de la quinasa ABL, tales como Imatinib, en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML) proporcionó la prueba de concepto para este enfoque 6,7. Esta observación no solo revolucionó la hormigai-quinasa terapia, pero también hace cumplir la idea de identificar las lesiones genéticas en otras enfermedades neoplásicas para el enfoque terapéutico, que conducen al descubrimiento de mutaciones oncogénicas en el JAK2 de la policitemia vera (PV) y los pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN). Este descubrimiento generó gran interés en el tratamiento de las MPN apuntando JAK2 con inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas. Ahora, casi una docena de inhibidores de JAK2 están en ensayos clínicos y uno de ellos ha sido aprobado recientemente para el tratamiento de la mielofibrosis. Si bien la orientación específica de quinasas oncogénicas por inhibidores de moléculas pequeñas en los cánceres traer resultados prometedores, que también sufre de desarrollar resistencia al tratamiento. De hecho, hasta ahora, los pacientes tratados con inhibidores de la quinasa, como Imatinib, Gefitinib, erlotinib y dasatinib desarrollaron mutaciones de resistencia en su mayoría mediante la adquisición de mutaciones en el dominio quinasa de qué fármaco se dirige a 08.10. Resistencia como resultado de la mutación del gen pone de relieve las limitaciones of dirigido monoterapia contra las quinasas oncogénicas, y representa el siguiente reto en el desarrollo de la quimioterapia del cáncer cada vez más éxito. Consecuencias mecánicas y funcionales de resistencia a los medicamentos deben proporcionar una justificación para la selección y el diseño de compuestos de cortesía para el desarrollo de fármacos. Las mutaciones identificadas a través de pantallas in vitro, han demostrado un alto grado de correlación con las que se encuentran en los pacientes. Por lo tanto, la detección in vitro de mutaciones que confieren resistencia a las drogas para un determinado objetivo pares de drogas en asistencias de desarrollo clínico o preclínico en la identificación de los patrones de resistencia que puedan causar la recaída clínica. La identificación de estas formas mutantes no sólo es útil en el seguimiento de los pacientes para la respuesta a los fármacos y la recaída, pero también es esencial para el diseño de inhibidores de próxima generación más robustos. Por ejemplo, el desarrollo de inhibidores de BCR / ABL de próxima generación, nilotinib y Ponatinib, fueron posibles debido a la mayor mecentendimientos hanistic ganaron de mutagénesis, estructurales y estudios funcionales.
Anteriormente, hemos informado de los resultados de nuestra pantalla usando mutagénesis aleatoria de BCR / ABL para revelar el espectro de mutaciones que confieren resistencia a los inhibidores como el Imatinib 11,12, PD166326 12 y 13 AP24163. Los resultados no sólo identificaron las mutaciones que confieren resistencia y la enfermedad recaída clínica, sino que también proporcionan la comprensión mecanicista de la resistencia y de los principios que rigen la función quinasa 11,14 drogas. Aquí proporcionamos detalles metodológicos adicional, usando ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, para permitir una aplicación más amplia de esta estrategia de cribado.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el tratamiento ético y cuidado de los animales, y de acuerdo con un protocolo de uso de los animales aprobado IACUC.
Línea 1. Mantenimiento de la celda
- Cultura células BAF3 en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / ml) y medio de cultivo gastado de las células Wehi. Se cultivan las células HEK293T en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / mL). Mantener las células a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO2.
2. Construcción de plásmidos
- Clonar el ratón JAK2 y su oncogénico isoforma JAK2 V617F-en pMSCV-puro-GW por LR Clonase usando el procedimiento de clonación de recombinación estándar.
- Para la construcción del vector de expresión de luciferasa (pMSCV-Luc-cereza-GW) que se utiliza en el in-viimágenes vo, amplificar la luciferasa de pLVX-Tet-ON vector mediante PCR utilizando cebadores (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG y LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) siguieron con la clonación en pENTR-SD-TOPO para generar pENTR-Luc, que se utiliza para transferir el gen de la luciferasa en el vector retroviral, pMSCV-cereza-GW por recombinación mediada por clonación usando LR clonasa.
3. Preparación de Random Mutación Biblioteca, detección e identificación de las mutaciones
3.1) Random Mutagenesis
- Clon de longitud completa de JAK2 tipo salvaje y la mutación en pMSCV-puro-GW vector retroviral V617F utilizando una tecnología de clonación de recombinación comercial.
- Utilice 1 g de ADN plásmido JAK2 V617F-transformar, XL-1 Rojo, E. coli células, lo que es defectuoso en los mecanismos de reparación del ADN lo que les permite incorporar mutaciones aleatorias durante la replicación. Más específicamente, mezclar 50 - 100 ng de ADN (más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación) con 100 l de células competentes en un tubo de polipropileno pre-enfriada y se incubaron en hielo durante 30 min, agitando suavemente cada 5 min. Para una buena cobertura de la biblioteca, utilice cinco y cincuenta y seis tubos de células competentes.
NOTA: Más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación - Sumerja el tubo en un baño de agua a 42 ° C durante un choque térmico de 45 segundos e incubar en hielo durante 2 min. A continuación, añadir 1 ml de medio SOC (2,0% de triptona, extracto de levadura al 0,5%, 0,05% de NaCl, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, y 0,4% de D-glucosa). Incubar el tubo a 37 ° C con agitación a 225-250 rpm durante 90 min.
- Células de la placa de cada tubo en cuatro placas de 10 cm de agar LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina. Incubar las placas durante 16-24 horas a 37 ° C.
- Después de colonias visibles, ellos recoger raspando las placas con un raspador de placa estéril. Piscina células de cada placa y el plásmido aislado de ADN usando un kit de extracción de plásmido comercial.
NOTA: Por lo general, las colonias son más pequeños y toman 18-24 horas para servisible porque estos son cepas bacterianas de crecimiento lento. En esta etapa, evaluar la heterogeneidad de las mutaciones en la biblioteca por digestión de restricción con un cortador frecuentes, tales como Sau3A1 o Taq1 o secuenciación.
3.2) Producción de sobrenadantes retrovirales y la transducción
- Un día antes de la transfección, placa de 4 x 10 6 células HEK 293T sobre 100 cm de platos en DMEM que contenía 10% de FCS, penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina.
- Al día siguiente, reemplace el medio y transfectar las células con mutagenized biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, mezclar 10 g de ADN (5 g de la biblioteca de plásmido y 5 g de plásmido de empaquetamiento retroviral, pCLEco) con 40 l de FuGENE a un volumen total de 400 l de suero utilizando medio DMEM libre. Incubar la mezcla de ADN y lípidos durante 20 min a temperatura ambiente. Después de 20 minutos añadir el complejo de abandono ADN lípidos sabio en la parte superior de las células HEK293T.
- Después de seis horas, cambiar el medio de transfección wITH medio fresco y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C para la producción de virus. Después de 48 horas de incubación, recoger los sobrenadantes virales filtrados a través de un filtro de 0,45 micras acrodisco.
3.3) La selección de clones resistentes in vitro
- Para mutantes resistentes JAK2 V617F-drogas, transducir 100 millones de células BAF3 con 100 ml de sobrenadantes de virus que tienen un título viral de 0,5-1 x10 6. Más específicamente, mezclar 10 8 células con 100 ml de sobrenadante de virus a un volumen total de 300 ml utilizando medio RPMI, conteniendo 10% de suero y 24 mg / ml de polyberene (concentración final de ployberene es de 8 mg / ml). Distribuir estos mezcladores de células en múltiples placas de seis pocillos (4-5 ml por pocillo).
- Centrifugar las placas a 1250 xg durante 90 minutos a 25 ° C. Después de la centrifugación, se incuban las placas a 37 ° C durante 24 horas.
- Al día siguiente, en común las células juntos y mezclar con ruxolitinib y medio con agar blando y chapada en six placas de pocillos. Para cada concentración de fármaco, mezclar 10 ml de células BAF3 transducidas (10-20 millones de células) con la cantidad apropiada de ruxolitinib en un tubo de 50 ml. Completar el volumen a 40 ml usando RPMI que contiene 20% de suero. Añadir 10 ml de 1,2% de agar a las células, mixcarefully y la placa en placas de seis pocillos.
- Incubar las placas a 37 ° C durante dos semanas. Tome las colonias resistentes utilizando puntas de pipeta de 0,2 ml y subcultura individualmente en placas de 24 pocillos durante 3-4 días.
- Recoger las células BAF3 resistentes por centrifugación a 450 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aislar el ADN genómico usando un kit de aislamiento de ADN genómico comercial. PCR amplificar ADNc completo JAK2 de 100 ng de ADN utilizando cebadores genómicos (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG y mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) y largo plantilla ampliar los sistemas de PCR de alta fidelidad.
- Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Escindir el 3,4 kb de banda de ADN que representan JAK2 trama de codificación y aislar el ADNutilizando un kit de extracción de gel comercial. Secuencia de la longitud total de cDNA utilizando 8 cebadores internos (P1 - P8) que abarca la secuencia de codificación y analizar secuencias utilizando el software comercial.
4. En Vitro Validación de mutaciones resistentes
Muchos clones de células llevan más de una mutación, Para probar la contribución de cada mutación en el fenotipo de resistencia, generar variantes seleccionadas por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el plásmido pMSCV-JAK2V-617F como plantilla.
- Realizar mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido pMSCV-JAK2-V617F utilizando un kit de mutagénesis comercial y oligonucleótidos diseñados para crear mutaciones puntuales. Confirmar la identidad de los clones mutantes por secuenciación.
- Transducir células BAF3 con retrovirus hacen usando plásmidos mutantes seguidos con la selección utilizando puromicina de 1 g / ml.
- Plate 10 4 células BAF3-JAK2-V617F (50 l de RPMI con 10% de FCS) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Separadoly añadir 50 l de los medios de comunicación ruxolitinib que contiene a los pozos a través de la placa (concentración final: 0, 1, 3, 5, 10 y 20 mM), e incubar las placas durante 60 horas a 37 ° C.
- Evaluar la viabilidad celular mediante la adición de 10 l de reactivo WST-1 a cada pocillo seguido con incubación a 37 ° C durante 2-4 h. Absorbancia Record en A450 usando un lector de placas. Realizar todos los ensayos por triplicado y parcela promedio de absorbancia contra INCB018424 concentraciones. Realice una curva sigmoidal de ajuste óptimo usando un algoritmo de ajuste de curva no lineal. Puntuación de la concentración de fármaco resultante en la viabilidad celular 50% como el IC50 celular.
- A continuación, la placa de seis millones de células que expresan variantes BAF3 JAK2 en placas de seis pocillos en medio RPMI que contenía 10% de suero con concentraciones crecientes de ruxolitinib y se incubaron durante 4-6 horas a 37 ° C.
- Recoger las células por centrifugación a 450 g durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar las células una vez con PBS, y se lisan en 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, fluoruro de sodio 1 mM, 2 mM de sodio vanadato, y 5% de glicerol suplementado con inhibidores de cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa. Sonicar la suspensión de células durante 1 min seguido por adición de 5x tampón de carga de gel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], DTT 500 mM, 15% de SDS, benzamidina 10 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 5 mM de sodio vanadato , cóctel de proteasa, 50% de glicerol, y 0,001% de azul de bromofenol) y desnaturalización a 70 ° C durante 5-10 min.
- Resolver las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS 8% en condiciones desnaturalizantes. Realizar inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal de ratón anti-phopsho STAT5. Pele los borrones y reprobed con un anticuerpo policlonal de conejo anti-SATA5. Visualice las bandas utilizando reactivos ECL según la recomendación del proveedor.
5. En Vivo Validación
- Transducir células BAF3 expresan luciferasa y cereza (transducidas con retrovirus hechos de pMSCV-Luc-cherry GW) con virus que expresan JAK2-V617F y variantes resistentes. Seleccionar las células que sobreviven a la selección de puromicina para la expresión de JAK2 y sus variantes de resistencia.
- Inyectar dos millones de células en crecimiento activo / cereza BAF3-Luc llevan JAK2-V617F y sus variantes resistentes en 200 l de PBS a 6 ratones Balb / C a través de la inyección de la cola de la vena.
- Después de tres días de trasplantes de células, inyectar a los ratones con ruxolitinib (100 mg / kg) dos veces al día durante dos semanas.
- Realizar imágenes de bioluminiscencia basado en la luciferasa con un sistema de imagen. .
- En resumen, preparar la solución de luciferina por disolución de 300 mg a 25 ml de agua desionizada estéril, la alícuota en volúmenes más pequeños y tienda.
NOTA: luciferina tienda a -80 ° C y protegido de la luz hasta su uso. - Inyectar 250 l a cada ratón por IP para alcanzar 125 mg / kg en cada ratón. Anestesiar a los ratones de un mismo grupo juntos utilizando isoflurano inhalado (1,5% -2,0%) en una caja sellada. Aplique un ungüento veterinario en el the ojo para prevenir la sequedad.
NOTA: El tiempo necesario para que los ratones dormir (10-15 min) permitió la actividad luciferina a pico. Mantenga el tiempo constante entre los grupos para evitar la variación.
- En resumen, preparar la solución de luciferina por disolución de 300 mg a 25 ml de agua desionizada estéril, la alícuota en volúmenes más pequeños y tienda.
- Transferir los ratones inmediatamente a la etapa de cámara de imágenes y mantener la anestesia en el 1,5-2% isofluorano durante los procedimientos de imagen. Ratones imagen secuencial con 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, y 300 segundos de exposición. Captura imágenes y cuantificar la intensidad de la bioluminiscencia usando adquisición de imágenes y software de análisis. Siguiendo imágenes devolver los ratones de nuevo a su jaula.
- Para bonemarrow totales, células in vivo cosecha quimerismo. La eutanasia a los ratones con CO 2 durante 5 min seguido con dislocación cervical. Cosecha de los huesos y aplastar en 4 ml de PBS frío para recoger la médula ósea. Analizar las células positivas por ciento de cerezo bajo el microscopio de fluorescencia y cuantificar mediante FACS. Recoge veinte mil eventos de cada muestra.
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Representative Results
La aparición de mutaciones genéticas plantea un gran desafío para la terapia anti-quinasa específica. Mutacional estudios, además de proporcionar conocimientos sobre mecánica y funcionales que son instrumentales en la selección y el diseño de desarrollo de fármacos de nueva generación, que también permite una mejor gestión clínica y puedan en el futuro ser más útil para el tratamiento personalizado. En este experimento, se muestra la detección de mutaciones de resistencia ruxolitinib en JAK2 V617F-quinasa (Figura 1). Construimos pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vector mediante la introducción de la longitud completa de ratón JAK2-V617FcDNA en pMSCV-cereza-GW. Se recomienda utilizar huésped bacteriano (XL-1 cepa roja de E. coli) para desarrollar mutaciones aleatorias sobre la elección más popular de método, que es la PCR, debido a sus limitaciones asociadas con fragmentos de secuencia de polarización y más grande de genes son difíciles de amplificar . Aleatoriamente mutagenizado biblioteca de ADN se transfectó a las células HEK293T para la producción de retrovirus. Estos vir mutanteusos se utilizaron para, transducir las células BAF3 que se seleccionaron para el crecimiento de colonias en agar blando en ausencia de IL-3, ya sea con 1 o 5 M de ruxolitinib. Bajo estas condiciones, las colonias sólo surgen a partir de células que llevan ADNc JAK2V-617F que expresa variante funcional y resistente de la quinasa. Después de 10 - 14 días, las colonias individuales bien separadas fueron recogidos, que variaban en tamaño, y los expandida en cultivo líquido. ADN genómico se aisló de estas células. El provirus se recuperó por rescate directo o por PCR. Los provirus recuperados se secuenciaron para identificar mutaciones (Figura 1). Análisis de secuencias se realizaron con el paquete DNASTAR de Lasergene.
Debido a que muchos clones de células llevan más de una mutación, se recomienda encarecidamente validar estas mutaciones en aislamiento por tanto in vitro e in vivo (Figuras 2 y 3). Para verificar la actividad de las variantes de forma aislada,variantes seleccionadas fueron generados mediante mutagénesis dirigida de la secuencia de JAK2V-617F. Estas variantes se reintrodujeron en células BAF3, y se miden por la capacidad de proliferación celular en diferentes dosis de ruxolitinib para evaluar IC50 (valores de IC50, la Figura 2A). Ensayos bioquímicos se llevan a cabo para fosfotirosina o fosfo-STAT5 mediante análisis de inmunotransferencia de lisados de proteína de las células BAF3 que se incubaron con dosis crecientes de ruxolitinib para descartar cualquier desviado resistencia mediada (Figura 2B). Los mutantes que exhiben valores de IC50 mejoradas y autofosforilación persistente en concentraciones más altas ruxolitinib tanto, se confirman a ser variantes resistentes a los fármacos. Debido a que muchas mutaciones resistentes muestran respuesta a la dosis variable, por lo que es imprescindible para probar si estas mutaciones confieren resistencia in vivo también. Por lo general, se recomienda probar sólo 2 -3 diferentes variantes para los experimentos in vivo, ya que son caros ylaborioso. Para validar la resistencia in vivo, las células BAF3 fueron diseñados para expresar variantes JAK2 V617F-y luciferasa / cereza para permitir el seguimiento en vivo. Los ratones fueron inyectados con 1-2 millones de células positivas de cereza (que expresan variantes de JAK2 y luciferasa), seguido por la inyección ruxolitinib durante dos semanas. Después de dos semanas, los ratones fueron imágenes de bioluminiscencia catalizada por luciferasa (Figura 3), y también para BAF3 quimerismo en bonemarrow y sangre periférica mediante la medición de la fluorescencia de células positivas de cerezo (Figura 3). Los ratones que expresan JAK2-V617F son sensibles a ruxolitinib, mientras que las variantes resistentes muestran incremento progresivo de la bioluminiscencia durante el período de los tratamientos, lo que sugiere que las células que expresan BAF3 variante JAK2-V617F es resistente al tratamiento ruxolitinib in vivo.
Figura 2:. Un esquema que muestra en la validación in vitro utilizando ensayos de dosis dependientes de proliferación celular (A) y el Western Blot (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3: Representación esquemática de la validación in vivo utilizando luciferasa catalizada medición de bioluminiscencia. Haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.
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Discussion
El éxito clínico de imatinib en el tratamiento de la LMC demostró no sólo la posibilidad de dirigirse a las rouge quinasas por inhibidores de moléculas pequeñas, pero las limitaciones también al descubierto de la terapia dirigida: recaída clínica y la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos en el gen diana. Identificación de mutaciones de resistencia ayuda a una mejor gestión clínica y el desarrollo de inhibidores de la próxima generación. Este protocolo describe una metodología para identificar las mutaciones resistentes a los medicamentos en el gen diana. Este método utiliza una biblioteca de plásmido mutagenizado azar construido en E. coli, para expresar las proteínas mutantes. La biblioteca se introduce entonces en las células BAF3 (susceptibles a la transformación por un oncogén), seguido de la selección de clones de células en presencia de agentes quimioterapéuticos. La secuenciación del gen diana a partir de clones resistentes identifica las mutaciones que confieren resistencia. Por último, las mutaciones identificadas son recreadas mediante mutagénesis dirigida para validarlos pararesistencia a los medicamentos.
Utilizando esta estrategia se definió el espectro de mutaciones en JAK2 y BCR / ABL que confieren resistencia a ruxolitinib y Imatinib, respectivamente. Hemos identificado más de cien mutaciones en BCR / ABL. Además, la identificación de las principales mutaciones detectadas en pacientes, nuestro método de cribado permitió identificar nuevas sustituciones de residuos dentro y fuera del dominio quinasa. Curiosamente, todas las mutaciones de nuestra pantalla se han identificado en muestras de pacientes pero este proceso se llevó casi más de 10 años 15, lo que demuestra la capacidad de esta pantalla para anticipar las mutaciones que plantear resistencia a los fármacos clínicamente problemática. Mientras que el cribado resistente utilizando mutagénesis aleatoria ofrece muchas ventajas en comparación con otros métodos, hay peligros potenciales a tener en cuenta cuando se sigue un procedimiento de detección. Para cualquier selección, es muy recomendable para BAF3 células para ser totalmente dependiente de la diana contra la que resiSe buscó la postura. Un fallo o dependencia parcial en el gen diana pueden no desarrollar clones resistentes verdaderos y lo más probable desarrollar falsos positivos. Por ejemplo, cuatro estudios diferentes han realizado cribado resistente a los inhibidores de JAK2 utilizando BAF3 células transducidas con cualquiera de EPO o receptores de MPL para facilitar la dependencia JAK2 V617F-16-19. Sólo ocho mutaciones resistentes limitado a quinasa dominio fueron identificados a partir de estas pantallas, aunque numerosos clones resistentes desarrolladas que carecía de mutaciones, presumiblemente debido a la aparición de falsos positivos, que se atribuyó a la heterodimerización de JAK1 y JAK3 con receptores de citoquinas. Por lo tanto, para evitar la pérdida de la dependencia de JAK2 se llevó a cabo el cribado resistente en BAF3 claro que mostró robusta selección de clones resistentes contra ruxolitinib y todos estos clones mostró presencia de mutaciones resistentes. Basándose en estas observaciones, a fin de aprovechar todo el espectro de mutaciones de resistencia, se recomienda que el celular BaF3s debe depender totalmente de la quinasa específica para evitar la aparición de falsos positivos, como ha sido la norma en proyecciones resistentes previos realizados contra inhibidores de JAK2 16,17. Además, es fundamental para evitar las condiciones de cultivo en masa en la que las células que albergan diferentes mutaciones se agruparon y se les permite expandirse en cultivo líquido, ya que esto puede conducir a la dominancia clonal de algunos altamente variantes resistentes a los medicamentos. Por ejemplo, durante la selección inicial de imatinib-resistencia de mutagenized BCR-ABL en cultivo líquido a granel, se encontraron sólo 4 formas mutantes que estuvieron representadas varias veces dentro de los primeros 100 aislamientos secuenciado. Por lo tanto, la detección usando agar blando permite clones de crecimiento lento con más modestas grados de resistencia a los medicamentos para ser recuperado que no se identificó utilizando cultivo en masa. Por esta razón, se recomienda a crecer cultivo en masa antes de la selección sólo para 14 a 16 hr, seguido de la selección de medicamentos sin IL3 en agar blando. En nuestro exexperiencia, el cultivo de las culturas más allá de 36 horas después de la transducción viral tienden a estar dominados por los clones de proliferación, lo que plantea un riesgo de perder clones de crecimiento lento (débilmente transformadora). Del mismo modo, el uso de células de un puntos de tiempo anteriores, tales como 6-8 horas después de la transducción viral son propensos a seleccionar clones altamente transformadoras o sobreexpresan, causando así un sesgo y la tergiversación de la identidad y la frecuencia de clones de resistencia. Por lo tanto, se recomienda la utilización de células cultivadas por 14-16 h después de transducción viral para la detección, el cual proporciona una selección estricta de los clones individuales y previene la dominación clonal típicamente observado en cultivos líquidos a granel.
Es esencial para confirmar la capacidad de una mutación candidato para conferir resistencia en forma aislada, ya que se identificaron algunos clones tener múltiples mutaciones. Para la pantalla JAK2-V617F, recreamos la mayoría de las mutaciones identificadas de nuestra biblioteca de mutagénesis aleatoria usando sitio dirigido mutagenesis. Después de la introducción de los mutantes aislados en células frescas, que se cultivaron después en presencia de diversos fármacos para determinar CI50 para cada mutante. También probamos dos variantes resistentes diferentes para la resistencia in vivo mediante el control de la bioluminiscencia para confirmar aún más la capacidad de estas mutaciones individuales para causar resistencia a los fármacos in vivo.
Dado el éxito de la terapia anti-kinasa en el tratamiento de cánceres que galvanizaron una oleada de inhibidores de quinasa en las clínicas, es crucial para identificar la resistencia clínicamente problemática que confiere mutaciones para un mejor manejo del paciente y desarrollar fármacos que puedan dirigirse a ellos. Esta estrategia de cribado se ha utilizado con éxito para identificar mutaciones en el BCR / ABL, JAK2 y FLT3 20; sin embargo, creemos que será generalmente aplicable a una amplia gama de agentes anti-neoplásicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
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- Melnikova, I., Golden, J.
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