Summary
Uppkomsten av genetisk resistens mot terapi kinashämmare innebär betydande utmaning för effektiv cancerbehandling. Identifiering och karakterisering av resistenta mutationer mot en nyutvecklad läkemedel hjälper till bättre klinisk behandling och nästa generations läkemedelsdesign. Här beskriver vi våra protokoll för in vitro screening och validering av resistenta mutationer.
Abstract
Upptäckten av BCR / ABL som förare onkogen vid kronisk myeloisk leukemi (KML) resulterat i utvecklingen av Imatinib, vilket i själva verket visat potential inriktning på kinas i cancer genom att effektivt behandla CML-patienter. Denna observation revolutione läkemedelsutveckling att rikta de onkogena kinaser inblandade i flera andra maligniteter, såsom EGFR, B-RAF, KIT och PDGFRs. Men en stor nackdel med antikinas terapier uppkomsten av läkemedelsresistenta mutationer som gör målet att ha minskat eller förlorat affinitet för läkemedlet. Förstå mekanismer som resistenta varianter inte bara hjälper till att utveckla nästa generations hämmare men ger också impulser till klinisk hantering med hjälp personlig medicin. Vi rapporterade en retroviral vektor baserad screening strategi för att identifiera spektrumet av motstånd ger mutationer i BCR / ABL, vilket har bidragit till att utveckla nästa generations BCR / ABL hämmare. Använda Ruxolitinib och JAK2 som läkemedelsmål par, här beskriver vi i screening vitro-metoder som utnyttjar musen Baf3 cellerna uttrycker slumpmässig mutation bibliotek av JAK2 kinas.
Introduction
Proteinkinaser är viktiga reglerande enzymer av intracellulära signaltransduktionsvägar som synes modulerar varje cellulär funktion. En ordentlig kontroll av kinas medierad signalering är avgörande för homeostas och utveckling, vilket till största delen bygger på korrekt reglering av kinaser, fosfataser och dess nedbrytning av UPS (ubiquitin proteasomsystemet). Avreglerade kinaser är i centrum för många cancerformer och inblandad i många mänskliga sjukdomar 1. Mänskliga genomet kodar mer än 500 proteinkinaser som har länkade direkt eller indirekt, till ~ 400 mänskliga sjukdomar 2. Dessa observationer stödde konceptet för terapeutisk inriktning av kinaser genom småmolekylinhibitorer 3-5.
Demonstrationen av ABL kinashämmare, såsom Imatinib, vid behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) förutsatt proof of concept för detta tillvägagångssätt 6,7. Denna observation inte bara revolution myrani-kinas behandling, men verk också idén att identifiera de genetiska skador i andra neoplastiska sjukdomar för terapeutisk inriktning, som leder till upptäckten av onkogena mutationer i JAK2 från polycytemia vera (PV) och patienter med myeloproliferativa tumörer (MPN). Denna upptäckt genererat stort intresse av att behandla MPNs genom att rikta JAK2 med små molekyler kinasinhibitorer. Nu, nästan ett dussin av JAK2-hämmare är i kliniska prövningar och en av dem har nyligen godkänt för behandling av myelofibros. Även särskild inriktning på onkogena kinaser genom småmolekylinhibitorer i cancer föra lovande resultat, lider också från att utveckla resistens mot behandlingen. I själva verket, så länge patienter behandlade med kinashämmare, såsom Imatinib, Gefitinib, Erlotinib och Dasatinib utvecklat resistens mutationer oftast genom att förvärva mutationer i kinas domän som läkemedelsmål 8-10. Motstånd som ett resultat av genmutation belyser begränsningarna of riktade monoterapi mot de onkogena kinaser, och representerar nästa utmaning i utvecklingen av allt mer framgångsrik kemoterapi. Mekanistiska och funktionella konsekvenser av läkemedelsresistens bör ge en grund för val och utformning av kostnads föreningar för läkemedelsutveckling. Mutationer identifierade genom in vitro-skärmar, har visat en hög grad av korrelation med de som finns hos patienter. Därför in vitro screening för mutationer som ger läkemedelsresistens för en viss läkemedels målparen i klinisk eller preklinisk utveckling hjälper till att identifiera de resistensmönster som kan orsaka kliniska återfall. Identifieringen av dessa muterade former är inte bara till hjälp för att övervaka patienter för läkemedelssvar och återfall men också viktigt för utformningen av mer robusta nästa generations hämmare. Till exempel utvecklingen av nästa generations BCR / ABL-hämmare, Nilotinib och Ponatinib, gjordes möjligt på grund av ökad mechanistic överenskommelser som vunnits från mutagenes, strukturella och funktionella studier.
Tidigare har vi rapporterat resultatet av vår skärm använder slumpmässig mutagenes av BCR / ABL att avslöja det spektrum av mutationer som ger resistens mot hämmare såsom Imatinib 11,12, PD166326 12, och AP24163 13. Resultaten inte bara identifierat de mutationer som ger klinisk resistens och återfall, men också den mekanistiska förståelsen av läkemedelsresistens och principer för kinasfunktionen 11,14. Här ger vi ytterligare metod detalj, med hjälp Ruxolitinib och JAK2 som läkemedelsmål par, för att möjliggöra en bredare tillämpning av denna screening strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla Metoderna i det här protokollet utfördes enligt National Institute of Health riktlinjer för etisk behandling och vård av djur, och enligt en godkänd IACUC djuranvändning protokoll.
1. Cell-Line Maintenance
- Kultur Baf3-celler i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och penicillin / streptomycin (100 enheter / ml och 100 | ig / ml) och förbrukat odlingsmediet av WEHI-celler. Väx HEK293T-celler i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum och penicillin / streptomycin (100 enheter / ml och 100 | ig / ml). Behåll cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2.
2. Plasmidkonstruktion
- Klona musen JAK2 och dess onkogena isoform JAK2-V617F i pMSCV-puro-GW av LR CLONASE hjälp av standard rekombination kloningsförfarande.
- För konstruktionen av luciferasexpressionsvektorn (pMSCV-Luc-Cherry-GW) som används i in-VIvo avbildning, amplifiera luciferas från pLVX-Tet-ON vektorn genom PCR med användning av primrar (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG och LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) följt med kloning i pENTR-SD-TOPO att generera pENTR-Luc, som används att överföra luciferasgenen i retroviral vektor, pMSCV-Cherry-GW genom rekombination medierad kloning med hjälp LR CLONASE.
3. Beredning av Random Mutation Library, Screening och Identifiera Mutationer
3,1) slumpmässig mutagenes
- Klon fulla längd JAK2 vildtyp och V617F mutation i pMSCV-puro-GW retrovirusvektorn med ett kommersiellt rekombination kloningsteknik.
- Använd 1 pg av JAK2-V617F plasmid-DNA för att omvandla, XL-1 Röd, E. coli-celler, som är defekt i DNA-reparationsmekanismer vilket tillåter dem att inkorporera slumpmässiga mutationer under replikering. Mer specifikt, blanda 50-100 ng DNA (mer än 100 ng DNA minskar omvandlingseffektivitet) med 100 il kompetenta celler i en i förväg kyld polypropylenrör och inkuberades på is under 30 min, rullas försiktigt varje 5 min. För ett bra bibliotek täckning, använd 5:56 rör av kompetenta celler.
OBS: Mer än 100 ng DNA minskar omvandlingseffektivitet - Sänk ned röret i ett vattenbad vid 42 ° C under en värmechock på 45 sekunder och inkubera på is i 2 min. Nästa, tillsätt 1 ml SOC-medium (2,0% trypton, 0,5% jästextrakt, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, och 0,4% D-glukos). Inkubera röret vid 37 ° C under skakning vid 225-250 rpm under 90 minuter.
- Plate celler från varje rör på fyra 10 cm LB-agarplattor innehållande 100 pg / ml ampicillin. Inkubera plattorna under 16-24 h vid 37 ° C.
- Efter synliga kolonier, samla ihop dem genom att skrapa plattorna med en steril platta skrapa. Pool celler från varje platta och isolera plasmid-DNA med hjälp av ett kommersiellt plasmid extraktion kit.
OBS: Vanligtvis kolonier är mindre och tar 18-24 timmar för att varasynliga eftersom dessa är långsamt växande bakteriestammar. I detta skede bedöma heterogenitet mutationer i biblioteket genom restriktionsdigestion med en frekvent fräs som Sau3A1 eller Taq1 eller sekvensering.
3.2) Produktion av Retrovirala Supernatanter och transduktion
- En dag före transfektion, plattan 4 x 10 6 HEK 293T celler på 100 cm skålar i DMEM innehållande 10% FCS, penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin.
- Nästa dag, byt medium och transfektera cellerna med mutageniserad pMSCV-JAK2-V617F bibliotek. För varje 10 cm platta, blanda 10 pg DNA (5 | ig av plasmiden biblioteket och 5 pg av retrovirala packande plasmid, pCLEco) med 40 pl av FuGENE till en total volym av 400 | il med hjälp av serumfritt DMEM-medium. Inkubera DNA och lipid mix för 20 min vid rumstemperatur. Efter 20 min till DNA-lipidkomplex droppvis ovanpå HEK293T celler.
- Efter sex timmar, ändra transfektion media wed färskt medium och inkubera plattorna under 48 h vid 37 ° C för virusproduktion. Efter 48 timmars inkubation, samla virala supernatanter filtrerade genom ett 0,45 ìm Acrodisc filter.
3,3) Val av resistenta kloner in vitro
- För läkemedelsresistenta JAK2-V617F mutanter, omvandla 100 miljoner BaF3 cell med 100 ml virus supernatanter med en viral titer av 0,5-1 x10 6. Mer specifikt, blanda 10 8 celler med 100 ml av virussupernatant till en total volym av 300 ml med användning av RPMI-medium, innehållande 10% serum och 24 | ig / ml av polyberene (slutlig koncentration av ployberene är 8 pg / ml). Fördela dessa cell blandare i flera sex-hålsplattor (4-5 ml per brunn).
- Centrifugera plattorna vid 1250 xg under 90 minuter vid 25 ° C. Efter centrifugering, inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h.
- Nästa dag, pool cellerna tillsammans och blanda med Ruxolitinib och medium innehållande mjuk agar och pläterad i six brunnsplattor. För varje läkemedelskoncentration, blanda 10 ml av transducerade Baf3-celler (från 10 till 20.000.000 celler) med den lämpliga mängden av Ruxolitinib i ett 50 ml rör. Gör upp volymen till 40 ml med hjälp RPMI innehållande 20% serum. Tillsätt 10 ml 1,2% agar till cellerna, mixcarefully och plattan i sex-brunnsplattor.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C under två veckor. Plocka de resistenta kolonierna som använder 0,2 ml pipettspetsar och subkultur dem individuellt i 24-hålsplattor för 3-4 dagar.
- Skörda resistenta Baf3 cellerna genom centrifugering vid 450 xg under fem minuter vid rumstemperatur. Isolera det genomiska DNA med användning av ett kommersiellt genomiskt DNA-isoleringskit. PCR förstärka fullängds JAK2 cDNA från 100 ng genomiska DNA med hjälp primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG och mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) och lång mall expandera high fidelity PCR-system.
- Separera PCR-produkter med hjälp av agarosgelelektrofores. Punktskatter de 3.4 kb DNA-bandet representerar JAK2 kodningsram och isolera DNAanvändning av ett kommersiellt gelextraktionskit. Sekvens hela längden av cDNA använder åtta interna primers (P1 - P8) spänner den kodande sekvensen och analysera sekvenser med hjälp av kommersiell programvara.
4. In Vitro Validering av Resistenta mutationer
Många cellkloner bära mer än en mutation, att testa bidraget från varje mutation i motstånds fenotyp, generera utvalda varianter av riktad mutagenes använder pMSCV-JAK2V-617F plasmiden som mall.
- Utför riktad mutagenes på pMSCV-JAK2-V617F plasmid med ett kommersiellt mutagenes kit och oligonukleotider som syftar till att skapa punktmutationer. Bekräfta identitet muterade kloner genom sekvensering.
- Transducera Baf3 celler med retrovirus görs med muterade plasmider följt med valet att använda puromycin på 1 ng / ml.
- Plate 10 4 Baf3-JAK2-V617F celler (50 | il RPMI med 10% FCS) i varje brunn i en 96 brunnars platta. Separatmatiskt till 50 ul av ruxolitinib innehållande media till brunnarna över plattan (slutkoncentration: 0, 1, 3, 5, 10, och 20 | iM), och inkubera plattorna under 60 h vid 37 ° C.
- Bedöm cellviabilitet genom tillsättning av 10 | il WST-1-reagens till varje brunn följt med inkubation vid 37 ° C under 2-4 h. Record absorbans vid A450 med hjälp av en plattläsare. Utför alla analyser i tre exemplar och komplott genomsnitt absorbansen mot INCB018424 koncentrationer. Utför en bästa passform sigmoidal kurva med hjälp av en icke-linjär kurvanpassning algoritm. Betyg läkemedelskoncentrationen vilket resulterade i 50% cellviabilitet som cellulära IC50.
- Härnäst platt sex miljoner Baf3-celler som uttrycker JAK2 varianter i sex-brunnsplattor i RPMI-medium innehållande 10% serum med ökande koncentrationer av ruxolitinib och inkuberades under 4-6 h vid 37 ° C.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 450 xg under fem min vid 4 ° C. Tvätta cellerna en gång med PBS, och lyserar i 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumvanadat, och 5% glycerol kompletterat med proteasinhibitorcocktail och fosfatashämmare. Sonikera cellsuspensionen under 1 min följt av tillsats av 5x gelladdningsbuffert (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM bensamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM natriumvanadat , Proteas cocktail, 50% glycerol, och 0,001% bromfenolblått) och denaturering vid 70 ° C under 5-10 min.
- Lös de proteinerna på en 8% SDS-polyakrylamidgel under denaturerande betingelser. Utför immunoblotting med mus monoklonal anti-phopsho STAT5. Skala blottarna och reprobed med en kanin polyklonal anti-SATA5 antikropp. Visualisera banden använder ECL reagens enligt leverantörens rekommendation.
5. In vivo Validering
- Transducera Baf3 celler som uttrycker luciferas och körsbär (transducerad med retrovirus gjorda av pMSCV-Luc-cherry GW) med virus som uttrycker JAK2-V617F och resistenta varianter. Välj celler som överlever puromycinselektion för uttrycket av JAK2 och dess motstånds varianter.
- Injicera två miljoner aktivt växande Baf3-Luc / körsbär celler som bär JAK2-V617F och dess resistenta varianter i 200 ul PBS till 6 Balb / C-möss via svansven injektion.
- Efter tre dagar av celltransplantationer, injicera möss med Ruxolitinib (100 mg / kg) två gånger dagligen i två veckor.
- Utför luciferas baserad mareld avbildning med ett bildsystem. .
- I korthet, förbereda luciferin lösning genom upplösning av 300 mg till 25 ml sterilt avjoniserat vatten, alikvot i mindre volymer och lagra.
OBS: Affär luciferin vid -80 ° C och skyddas från ljus fram till användning. - Injicera 250 l till varje mus med IP för att uppnå 125 mg / kg i varje mus. Bedöva möss från samma grupp tillsammans med användning av inhalerat isofluran (1,5% -2,0%) i en sluten låda. Applicera veterinär salva på the ögat för att förhindra torrhet.
OBS: Den tid det tar för möss att sova (10-15 min) tillät luciferin aktivitet till topp. Håll tiden konsekvent mellan grupperna för att undvika variation.
- I korthet, förbereda luciferin lösning genom upplösning av 300 mg till 25 ml sterilt avjoniserat vatten, alikvot i mindre volymer och lagra.
- Överför mössen omedelbart avbildning kammare scenen och underhålla anestesi vid 1,5-2% isofluoran under avbildningsförfaranden. Bild möss med sekventiell 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, och 300 sek exponering. Fånga bilder och kvantifiera mareld intensitet använder bildtagning och analysprogram. Efter avbildning returnera mössen tillbaka till sin bur.
- För, in vivo chimerism skörd totala bonemarrow celler. Euthanize mössen med CO2 under 5 min följt med cervikal dislokation. Skörda benen och krossa i 4 ml kall PBS för att samla benmärgen. Analysera procent körsbär positiva celler under fluorescensmikroskop och kvantifiera med användning av FACS. Samla tjugotusen händelser från varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppkomsten av genetiska mutationer innebär stor utmaning för den riktade anti kinas terapi. Mutationsstudier, förutom att ge mekanistiska och funktionella insikter som är avgörande för val och utformning av nästa generations läkemedelsutveckling, ger också bättre klinisk behandling och kan i framtiden vara mer användbar för personlig behandling. I detta experiment visar vi screening för ruxolitinib resistensmutationer i JAK2-V617F kinas (Figur 1). Vi konstruerade pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vektor genom att införa den hellånga mus-JAK2-V617FcDNA in pMSCV-Cherry-GW. Det rekommenderas att använda bakterievärd (XL-1 röd stam av E. coli) att utveckla slumpmässiga mutationer över det mest populära valet av metod, vilket är PCR, på grund av dess begränsningar förknippade med sekvens partiskhet och större genfragmenten är svåra att förstärka . Slumpvis mutagenis DNA-biblioteket transfekterades till HEK293T celler för retrovirusproduktion. Dessa mutanta viranvändningsområden användes för att, transducera de Baf3-celler som hade valts ut för kolonitillväxt i mjuk agar i frånvaro av IL-3 med antingen en eller 5 pM Ruxolitinib. Under dessa betingelser, kolonier uppstår endast från celler som bär JAK2V-617F cDNA som uttrycker funktionell och resistent variant av kinaset. Efter 10-14 dagar, var väl separerade enskilda kolonier plockas, som varierade i storlek, och expanderade dem i flytande kultur. Genomiskt DNA isolerades från dessa celler. Proviruset utvanns genom direkt räddning eller med PCR. De återvunna provirus sekvenserades för att identifiera mutationer (Figur 1). Sekvens analyser utfördes med hjälp DNASTAR paket av Lasergene.
Eftersom många cellkloner genom mer än en mutation, rekommenderar vi starkt att validera dessa mutationer i isolering genom både in vitro och in vivo (figur 2 och 3). För att verifiera aktiviteten varianter isolerat,utvalda varianter genererade av platsriktad mutagenes av JAK2V-617F-sekvensen. Dessa varianter återinfördes till Baf3-celler, och mättes med avseende på cellproliferation förmåga att vid olika dosering av Ruxolitinib att utvärdera IC50 (IC50-värden, figur 2A). Biokemiska analyser utförs för fosfotyrosin eller fosfor-STAT5 genom immunoblotanalys på proteinlysat av Baf3 celler som inkuberades med ökande doser av Ruxolitinib att utesluta eventuella från målet medierad resistens (figur 2B). Mutanter som uppvisar förbättrade IC50-värden och ihållande autofosforylering vid högre Ruxolitinib koncentrationer alltså bekräftats vara läkemedelsresistenta varianter. Eftersom många resistenta mutationer visar responsvariabel dos, det är därför viktigt att testa om dessa mutationer kommer ge in vivo resistens också. Vanligtvis rekommenderar vi att testa bara 2 -3 olika varianter för in vivo experiment, eftersom de är dyra ochmödosam. För att validera in vivo resistens, var Baf3 celler för att uttrycka JAK2-V617F varianter och Luciferase / körsbär för att möjliggöra in vivo spårning. Möss injicerades med 1-2 miljoner körsbärs positiva celler (som uttrycker JAK2 varianter och luciferas), följt av Ruxolitinib injektion i två veckor. Efter två veckor, mössen avbildas för luciferas-katalyserad bioluminescens (Figur 3), och även för Baf3 chimerism i bonemarrow och perifert blod genom mätning av fluorescensen av körsbär positiva celler (Figur 3). Möss som uttrycker JAK2-V617F är känsliga för Ruxolitinib, medan resistenta varianter visar progressiva inkrement i bioluminescens under perioden av behandlingar, vilket tyder på att Baf3-celler som uttrycker JAK2-V617F varianten är resistent mot Ruxolitinib behandling in vivo.
Figur 2:. Ett system som visar in vitro validering med hjälp dosberoende cellproliferationsanalyser (A) och western blotting (B) Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3: En schematisk bild av validering använder luciferas in vivo katalyserad bioluminiscens mätning. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kliniska framgångar Imatinib vid behandling KML visade inte bara potentialen att rikta de rouge kinaser genom småmolekylinhibitorer, men också avslöjats begränsningar av målinriktad terapi: klinisk återfall och uppkomst av läkemedelsresistensmutationer i målgenen. Identifiering av resistensmutationer hjälper bättre klinisk förvaltning och utveckling av nästa generations hämmare. Detta protokoll beskriver en metod för att identifiera läkemedelsresistenta mutationer i riktade genen. Denna metod använder en slumpmässigt mutageniserad plasmidbibliotek byggs i E. coli, för att uttrycka mutantproteinerna. Biblioteket introduceras sedan i Baf3-celler (som är mottagliga för transformering av en onkogen), följt med urval av cellkloner i närvaro av kemoterapeutiska medel. Sekvensering av målinriktad gen från resistenta kloner identifierar mutationer som ger resistens. Slutligen identifierade mutationer skapas genom riktad mutagenes att validera dem förläkemedelsresistens.
Med hjälp av denna strategi som vi definierat det spektrum av mutationer i JAK2 och BCR / ABL ger resistens mot Ruxolitinib och Imatinib, respektive. Vi identifierade mer än hundra mutationer i BCR / ABL. Dessutom identifierar alla större mutationer upptäcks hos patienter, vår screeningmetod tillät oss att identifiera nya substitutioner av rester både inom och utanför kinasdomänen. Intressant nog har alla mutationer från vår skärm identifierats i patientprover, men denna process tog nästan mer än 10 år 15, vilket visar förmågan hos denna skärm för att förutse mutationer som kommer utgöra kliniskt problematisk drogmotstånd. Även resistent screening med hjälp slumpmässig mutagenes ger många fördelar jämfört med andra metoder, det finns potentiella fallgropar att vara medveten om när man följer ett screeningförfarande. För varje screening, rekommenderas det starkt för Baf3 celler att vara helt beroende av målet mot vilket resihållning söks. Ett misslyckande eller partiell beroende målgenen får inte utvecklas sanna resistenta kloner och troligen utvecklar falska positiva. Till exempel har fyra olika studier utförts resistenta screening mot JAK2-hämmare som använder Baf3 celler omvandlade med antingen EPO eller MPL receptorer för att underlätta JAK2-V617F beroende 16-19. Endast åtta resistenta mutationer begränsade till kinasdomän identifierades från dessa skärmar, även om många resistenta kloner utvecklats som saknade mutationer, förmodligen på grund av uppkomsten av falska positiva, vilket tillskrivs hetero av JAK1 och JAK3 med cytokinreceptorer. Därför, för att undvika förlust av JAK2 beroende vi genomfört resistent screening i vanlig BaF3 som visade robust urval av resistenta kloner mot Ruxolitinib och alla dessa kloner visade förekomst av resistenta mutationer. Baserat på dessa observationer, för att utnyttja hela spektrumet av resistenta mutationer, rekommenderar vi att BaF3 cellens bör vara helt beroende av den riktade kinas att undvika uppkomsten av falska positiva, vilket har varit en norm i tidigare resistenta filmvisningar utförs mot JAK2-hämmare 16,17. Dessutom är det viktigt att undvika massodlingsbetingelser i vilka celler som härbärgerar olika mutationer poolade tillsammans och tillåts att expandera i flytande kultur, eftersom detta kan leda till klonal dominans på några mycket läkemedelsresistenta varianter. Till exempel, under första urval för imatinib-resistens av muta BCR-ABL i bulk flytande kultur, fann vi bara 4 muterade former som var representerade flera gånger inom de första 100 isolerar vi sekvens. Därför säkerhetskontroll med mjuk agar tillåter långsamt växande kloner med mer blygsamma grader av läkemedelsresistens som skall återvinnas som inte skulle kunna identifieras genom samlings kulturen. Av denna anledning är det rekommenderat att växa bulk kultur före valet bara för 14 till 16 timmar, följt med drog val utan IL3 i mjuk agar. I vår exfarenhet, växande kulturerna än 36 timmar efter viral transduktion tenderar att domineras av mycket proliferativa kloner, som utgör en risk för att förlora långsamt växande kloner (svagt omvälvande). Likaså använder celler från en tidigare tidpunkter som 6-8 timmar efter viral transduktion är benägna att välja för mycket omvälvande eller överuttrycker kloner, vilket leder till en bias och vilseledande i identifiering och förekomst av resistens kloner. Därför rekommenderar vi att du använder celler som odlas för 14-16 timmar efter viral transduktion för screening, vilket ger tät urval av enskilda kloner och förhindrar klonal dominans vanligen observerats i bulkkulturer.
Det är nödvändigt att bekräfta ett kandidatmutation förmåga att ge resistens i isolering, eftersom vissa kloner identifierades att ha flera mutationer. För JAK2-V617F skärmen, återskapas vi en majoritet av de mutationer som identifierats från vår slumpmässig mutagenes bibliotek med hjälp site riktad mutageNesis. Efter införandet av de isolerade mutanterna in i färska celler, var de sedan odlad i närvaro av olika läkemedel för att bestämma IC50 för varje mutant. Vi testade också två olika resistenta varianter för in vivo-resistens genom att övervaka bioluminescence att ytterligare bekräfta förmågan hos dessa enkla mutationer för att orsaka läkemedelsresistens in vivo.
Med tanke på framgången av anti-kinas terapi vid behandling av cancer som galvaniserade en våg av kinashämmare på kliniker, är det viktigt att identifiera kliniskt problematisk motståndet ger mutationer för bättre patienthantering och utveckla läkemedel som kan rikta dem. Denna screening strategi har framgångsrikt använts för att identifiera mutationer i BCR / ABL, JAK2 och FLT3 20; Men vi tror att det kommer att vara tillämplig för ett brett spektrum av antineoplastiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
