Summary
키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
만성 골수성 백혈병 (CML)의 구동 암에서 BCR / ABL의 발견 사실 효과적으로 CML 환자의 치료에 의해 암에서 키나제를 표적의 가능성을 보여, 글리벡의 개발 결과. 이러한 결과는 EGFR, B-RAF, KIT 및 PDGFRs 같은 다양한 다른 악성 종양에 연루 종양 키나제를 표적으로하는 약물 개발에 혁명을. 그러나, 항 - 키나아제 요법 하나의 주요 단점은 타겟 렌더링 약제 내성 돌연변이의 출현을 감소 또는 약물에 대한 친 화성을 잃어버린 것이다. 차세대 억제제를 개발하는 데 도움이뿐만 아니라 개인화 된 약을 사용 임상 관리에 자극을 제공뿐만 아니라 내성 변종에 의해 사용되는 메커니즘을 이해. 우리는 차세대 BCR / ABL 억제제 개발 도왔다 BCR / ABL에 저항을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 확인하는 레트로 바이러스 벡터 기반 스크리닝 전략을보고했다. Ruxoli 사용약물 표적 쌍으로 tinib과 JAK2, 우리가 JAK2 키나제의 무작위 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마우스 BAF3 세포를 이용하여 체외 검사 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
단백질 키나제 겉보기 모든 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로의 중요한 조절 효소이다. 키나제 매개 신호의 적절한 제어는 대부분 UPS에 의해 인산화 효소, 포스 및 성능 저하의 적절한 규제 (유비퀴틴 프로 테아 좀 시스템)에 의존 항상성 및 개발에 매우 중요하다. 탈 조절 키나아제는 다양한 암의 중심 단계에있는 인간 숙주 질환 (1)의 연루. 인간 게놈은 직접 또는 간접적으로 결합 된 500 개 이상의 단백질 키나제, ~ 400에 인간이 질병을 인코딩한다. 이러한 관찰은 작은 분자 억제제 3-5로 키나아제의 치료 표적에 대한 개념을 지원했다.
만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 이러한 글리벡과 같은 ABL 키나제 억제제의 데모는,이 방법 6,7에 대한 개념의 증거를 제공했다. 이러한 관찰뿐만 아니라 개미 혁명I-키나제 치료하지만 또한 골수 증식 성 신 생물 (MPN)과 진성 적혈구 베라 (PV) 환자에서 JAK2에서 발암 돌연변이의 발견으로 이어질 치료 타겟팅 다른 양성 질환의 유전 적 병변을 확인하기 위해 아이디어를 적용. 이 발견은 작은 분자 키나제 억제제 JAK2을 대상으로 MPNs 치료에 큰 관심을 생성합니다. 이제, JAK2 억제제 십여 임상 시험에 있고 그 중 하나는 골수 섬유증의 치료를 위해 최근에 승인되었다. 암의 작은 분자 억제제에 의한 발암 키나제의 표적화는 유망한 결과를 가지고 있지만, 또한 치료에 대한 내성을 발전에서 겪고있다. 사실, 지금까지, 환자는 대부분 약물 8-10을 대상으로 할 키나제 도메인에 돌연변이를 획득함으로써 이러한 글리벡, 게 피티 니브, 플라세보과 스 프라이 셀과 같은 키나제 억제제와 저항 돌연변이를 개발 한 처리. 유전자 돌연변이의 결과로서 저항 O 제한 강조F는 종양 키나제에 대한 단독 요법을 목표로하고, 더욱 성공적인 암 화학 요법의 개발에 다음 도전을 나타냅니다. 약물 내성의 기계적 및 기능적 결과는 선택과 약물 개발을위한 무료 화합물의 설계를위한 이론적 근거를 제공해야한다. 시험 관내 스크린을 통해 확인 된 돌연변이는 환자에서 발견되는 것들과 높은 상관 관계를 보여 주었다. 따라서, 임상 재발을 일으킬 가능성이 저항 패턴을 식별 전임상 또는 임상 개발 어시스트 주어진 약물 표적 쌍에 대한 약물 내성을 부여 돌연변이 시험 관내 스크리닝. 이러한 돌연변이 형태의 식별뿐만 아니라 약물 반응과 재발하지만보다 강력한 차세대 억제제의 설계를위한 필수적의 환자 모니터링에 도움이됩니다. 예, 다음 세대 BCR / ABL 억제제, 닐 로티 닙과 Ponatinib의 개발을위한 때문에 더 멕의 가능하게되었다hanistic 이해는 돌연변이 유발, 구조 및 기능 연구로부터 얻었다.
앞서 우리는 글리벡 11, 12, PD166326 (12), 및 AP24163 (13) 억제제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 공개 BCR / ABL의 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 우리의 화면의 결과를보고했다. 결과뿐만 저항 및 임상 질환 재발을 부여하는 돌연변이를 식별 할뿐만 아니라 약제 내성 및 키나제 기능을 관장 11,14 원리 기전 이해를 제공 하였다. 여기에서 우리는이 심사 전략의 광범위한 응용 프로그램을 사용하려면, 약물 표적 쌍으로 Ruxolitinib과 JAK2를 사용하여, 추가 방법 론적 세부 사항을 제공합니다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 동물의 윤리적 인 치료 및 관리를위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 수행하고, 승인 된 IACUC 동물 사용 프로토콜에 따라되었다.
1. 세포주 유지 보수
- RPMI-1640 배지에서 배양 BAF3 세포는 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ml) 및 WEHI 세포의 소비 배지를 보충. 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 성장 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ㎖). 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 세포를 유지한다.
2. 플라스미드 건설
- 마우스 JAK2과 LR에 의해 pMSCV - 퓨로-GW에서의 발암 성 이성체 JAK2-V617F 표준 재조합 복제 절차를 사용하여 clonase을 복제.
- 루시 페라 제 발현 벡터 (pMSCV 뤽 - 체리-GW)의 건설에-VI를에 사용VO 이미징, 사용 pENTR 뤽를 생성 pENTR-SD-TOPO의 복제와 다음 프라이머 (FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC가 LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG 및 LUC-SD를 /)를 사용하여 PCR에 의해 pLVX - 구정-ON 벡터에서 루시 페라 제를 증폭 LR의 clonase를 사용하여 재조합 매개 복제에 의해 레트로 바이러스 벡터, pMSCV - 체리-GW에서 루시 페라 제 유전자를 전송합니다.
무작위 돌연변이 라이브러리 3. 준비, 돌연변이를 검사 및 확인
3.1) 무작위 돌연변이 유발
- JAK2 야생형 및 상업 재조합 복제 기술을 사용하여 pMSCV - 퓨로-GW의 레트로 바이러스 벡터에 V617F 돌연변이의 클론 전체 길이.
- , 변형 JAK2-V617F 플라스미드 DNA 1 μg의 사용 XL-1 레드, E. 따라서이를 복제 중에 랜덤 돌연변이를 도입 할 수 있도록 DNA 복구 메카니즘에서의 결함이 콜라이 세포. 보다 구체적으로는, 50 혼합 - DNA 100 NG를 10 (DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소)0 사전 냉장 폴리 프로필렌 튜브에서 적격 세포의 μL 부드럽게 매 5 분 소용돌이, 30 분 동안 얼음 위에서 배양 하였다. 좋은 라이브러리 커버리지를 들어, 유능한 세포의 4-6 튜브를 사용합니다.
참고 : DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소 - 45 초의 열 쇼크를 위해 42 ℃에서 수조에 담금 튜브를 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 이어서, SOC 배지 1 ㎖ (2.0 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 %의 NaCl, 10 mM의 MgCl2를, 10 mM의 황산, 0.4 % D- 글루코스)를 추가한다. 90 분 동안 225-250 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브.
- 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린을 포함하는 4 개의 10cm LB 한천 플레이트에 각 튜브에서 플레이트 세포. 37 ° C에서 24 시간 - 16 접시를 품어.
- 눈에 보이는 식민지 다음, 멸균 판 스크레이퍼로 판을 긁어를 수집합니다. 상업용 플라스미드 추출 키트를 이용하여 각 플레이트로부터 분리 된 플라스미드 DNA 풀 셀.
일반적으로 식민지가 작고로 18 ~ 24 시간이 걸릴 : 주볼이 느린 성장 균주이기 때문이다. 이 단계에서, 예를 Sau 3A1 또는 Taq1 또는 순서로 자주 커터 제한 효소에 의해 라이브러리의 돌연변이의 이질성을 평가.
레트로 바이러스 상층 액과 형질 3.2) 생산
- 하루 트랜 플레이트 10 % FCS, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민을 함유하는 DMEM에서 100cm 접시 상 4 × 106 HEK 293T 세포의 전.
- 다음 날, 매체를 교체하고 돌연변이 pMSCV-JAK2-V617F 라이브러리와 세포를 형질. 각 10cm 접시를 들어, 무 혈청 DMEM 미디어를 사용하여 400 μL의 총 부피에 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene의 40 μL와 DNA의 10 μg의 (플라스미드 라이브러리의 5 μg의 및 레트로 바이러스 포장 플라스미드의 5 μg의, pCLEco)를 섞는다. 실온에서 20 분 동안 혼합 지질과 DNA를 부화. 20 분 후 HEK293T 세포의 상단에 현명한 DNA 지질 복잡한 드롭을 추가합니다.
- 여섯 시간 후, 형질 감염 매체 w 변경i 번째 신선한 미디어는 바이러스 생산을 위해 37 ° C에서 48 시간 동안 접시를 품어. 배양 48 시간 후, 0.45 μm의 acrodisc 필터로 여과 바이러스 상층 액을 모은다.
체외에서 저항하는 클론의 3.3) 선택
- 약제 내성 JAK2-V617F 돌연변이를 들어, 0.5-1 X10 (6)의 바이러스 역가를 갖는 바이러스 상층 액을 100㎖로 100,000,000 BAF3 세포를 형질 도입. 보다 구체적으로, 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 매체를 사용하여 300 ㎖의 전체 부피로 바이러스 상등액 100 ㎖, 및 polyberene에 24 ㎍ / ㎖ (ployberene의 최종 농도가 8 ㎍ / ㎖의 경우)로 108 세포를 혼합한다. 여러 여섯 잘 접시 (4-5 ml의 웰 당)이 셀 믹서를 배포합니다.
- 25 ° C에서 90 분 동안 1,250 XG에서 접시를 원심 분리기. 원심 분리 후, 24 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다.
- 다음 날, 함께 세포 수영장과 Ruxolitinib과 매체가 부드러운 한천을 함유하는 혼합시에 도금X 잘 접시. 각각의 약물 농도를 들어, 50 ㎖ 튜브에서 Ruxolitinib 적당량 BAF3 형질 세포 (10-20000000 세포) 10 ㎖를 혼합한다. RPMI 20 % 혈청을 포함하여 40 ml의에 볼륨을 확인합니다. 여섯 잘 접시에 mixcarefully, 셀에 1.2 % 한천의 10 ML을 추가하고 판.
- 2 주 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 0.2 ml의 피펫 팁 및 하위 문화들을 3 ~ 4 일 동안 개별적으로 24 웰 플레이트를 사용하여 저항하는 식민지를 선택합니다.
- 실온에서 450 분 동안 다섯 XG에서 원심 분리하여 세포 내성 BAF3 수확. 상업용 게놈 DNA 분리 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리. PCR은 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG 및 mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG)과 고 충실도 PCR 시스템을 확장 긴 템플릿의 100 NG에서 전체 길이 JAK2의 cDNA를 증폭.
- 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분리. JAK2 부호화 프레임을 나타내는 DNA 밴드의 3.4 kb의 절제 및 DNA를 분리상업용 겔 추출 키트를 사용. 시퀀스 8 내부 프라이머 (P1 - P8)을 사용하여 cDNA를 전 길이 상용 소프트웨어를 사용하여 암호화 서열에 걸친 서열 분석.
내성 돌연변이 4. 체외 검증
많은 세포 클론은, 저항의 각 변이 표현형의 기여를 주형으로 테스트 pMSCV-JAK2V-617F 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이에 의해 선택된 변이체를 생성하기 위해, 하나 이상의 돌연변이를 운반.
- 상용 돌연변이 유발 키트와 점 돌연변이를 만들 수 있도록 설계 올리고 뉴클레오티드를 사용 pMSCV-JAK2-V617F 플라스미드에 사이트 돌연변이 유발을 수행합니다. 염기 서열 돌연변이 클론의 ID를 확인합니다.
- 레트로 바이러스와 BAF3 세포를 형질 도입은 선택이 1μg / ㎖에서 퓨로 마이신을 사용하여 다음 돌연변이 플라스미드를 사용했다.
- 플레이트 (10) 4-BAF3 JAK2-V617F 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 (10 % FCS와 RPMI 50 μL). 별도37 ° C에서 60 시간 동안 플레이트를 (0, 1, 3, 5, 10 및 20 μM 최종 농도) 및 LY는 부화 플레이트 웰에 걸쳐 ruxolitinib 함유 배지의 50 μL를 추가한다.
- 2-4 시간 동안 37 ℃에서 배양하여 각 웰을 다음에 WST-1 시약 10 μl를 첨가하여 세포 생존율을 평가. 플레이트 판독기를 사용하여 A450 흡광도로 기록. 세중 플롯의 모든 분석을 수행는 INCB018424 농도에 대한 흡광도를 평균. 비선형 커브 피팅 알고리즘을 사용하여 최적의 S 자형 곡선을 수행합니다. 셀룰러 IC50 50 %의 세포 생존율에 얻어진 약물 농도 점수.
- 다음에, ruxolitinib의 농도를 증가시키고, 37 ℃에서 4-6 시간 동안 배양하여 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 여섯 웰 플레이트에서 JAK2 변이체를 발현하는 BAF3 플레이트 육백 만 세포.
- 4 ° C에서 다섯 분 동안 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 20 mM 트리스 - CL의 셀을 한 PBS와 시간,로 용해 워시 (PH 7.5), (50)mM의 염화나트륨, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 5mM의 EDTA, 1mM의 EGTA, 1 mM의 불소화 나트륨, 2 mM의 나트륨 바나 데이트, 5 % 글리세롤 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충. 5X 겔 로딩 완충액 (첨가하여 1 분간 세포 현탁액을 초음파 처리 350 mM의 트리스 -HCl [하여 pH 6.8], 500 mM의 DTT, 15 % SDS, 10 mM의 벤즈 아미 딘, 5 mM의 EDTA 5 mM의 EGTA, 5 mM의 나트륨 바나 데이트 , 단백질 분해 효소 칵테일, 50 % 글리세롤, 5 ~ 10 분 동안 70 ° C에서 0.001 % 브로 모 페놀 블루)과 변성.
- 변성 조건에서 8 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 단백질을 해결합니다. 마우스 단일 클론 항 phopsho의 STAT5와 면역 블 수행합니다. 말을 벗기고 토끼 다 클론 항 SATA5 항체 reprobed. 공급 업체의 권고에 따라 ECL 시약을 사용하여 밴드를 시각화.
생체 검증 5.
- 루시 페라 제와 체리를 표현 BAF3 세포를 형질 도입 (pMSCV 뤽 - 쉐어 만든 레트로 바이러스 형질 도입JAK2-V617F 및 내성 변종을 표현하는 바이러스와 공예 GW). JAK2와 저항 변이의 발현에 대한 퓨로 마이신 선택 살아남 셀을 선택합니다.
- 꼬리 정맥 주사를 통해 6을 Balb / C 마우스에 PBS 200 μL에 JAK2-V617F 및 내성 변종을 들고 이백만 적극적으로 성장 BAF3 룩 / 체리 세포를 주입한다.
- 세포 이식의 삼일 후, 2 주 동안 하루에 두 번 Ruxolitinib (100 ㎎ / ㎏)와 마우스를 주입.
- 촬상 시스템으로 루시 페라 제의 생물 발광 계 촬상을 수행한다. .
- 요컨대, 멸균 증류수 300 mg을 25 ㎖, 작은 볼륨 및 저장소 분취 루시페린을 용해시켜 용액을 제조.
참고 : -80 ° C에서 저장 루시페린과 사용할 때까지 빛으로부터 보호합니다. - 각 마우스에서 125 ㎎ / ㎏을 달성하기 위해 IP에 의해 각 마우스에 250 μl를 주입한다. 함께 실드 박스에서 흡입 이소 플루 란 (1.5 % -2.0 %)을 사용하여 동일한 그룹에서 쥐를 마취. 일에 수의사 연고를 적용즉 안구 건조를 방지한다.
참고 : 마우스 걸리는 시간은 잠 (10 ~ 15 분) 피크에 루시페린 활동을 허용했다. 변화를 피하기 위해 그룹 간 일관된 시간을 유지합니다.
- 요컨대, 멸균 증류수 300 mg을 25 ㎖, 작은 볼륨 및 저장소 분취 루시페린을 용해시켜 용액을 제조.
- 영상 실 단계로 즉시 마우스 이동 및 이미징 과정에서 1.5 % 이소 플루오 란에서 마취를 유지합니다. 순차 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, 및 300 초의 노출 이미지 쥐. 이미지를 캡처하고 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 생물 발광 강도를 정량. 이미지가 케이지에 다시 마우스를 반환 다음.
- , 생체 키메라 수확 총 bonemarrow 세포하십시오. 경추 탈구 다음 5 분 동안 CO 2와 쥐를 안락사. 수확 뼈 골수를 수집하는 차가운 PBS 4 mL에 호감. 형광 현미경 하에서 퍼센트 체리 양성 세포를 FACS 분석을 이용하여 정량화. 각 샘플에서 이만 이벤트를 수집합니다.
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Representative Results
유전 적 돌연변이의 출현 대상 방지 키나제 치료에 큰 도전을 포즈. 돌연변이 연구는 선택과 차세대 신약 개발의 디자인에서 쓸모있는 기계적인 기능적인 통찰력을 제공하는 외에, 또한 더 나은 임상 관리를 할 수 있으며 미래에 맞춤 치료에 더 도움이 될 수 있습니다. 이 실험에서, 우리는 JAK2-V617F 키나제에 ruxolitinib 저항 돌연변이 (그림 1)에 대한 검사를 표시합니다. 우리는 pMSCV - 체리-GW로 전체 길이 마우스 JAK2-V617FcDNA을 도입하여 pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway 벡터를 구축 하였다. 그것은 인해 시퀀스 바이어스 큰 유전자 조각과 관련된 제한 증폭하기 어려운로, PCR 인 방법의 가장 인기있는 선택을 통해 무작위 돌연변이를 개발하는 박테리아 숙주 (대장균 XL-1 빨간색 변형)을 사용하는 것이 좋습니다 . 무작위 돌연변이 DNA 라이브러리는 레트로 바이러스 생산 HEK293T 세포에 형질 감염시켰다. 이러한 돌연변이 비르용도로는, 1 또는 5 μM의 Ruxolitinib 하나와 IL-3의 부재하에 소프트 한천 콜로니 성장 선정 하였다 BAF3 세포를 형질 도입하는데 사용 하였다. 이러한 조건 하에서, 콜로니 키나아제의 작용 및 내성 변이체를 발현 JAK2V-617F cDNA를 운반 세포에서만 발생한다. 10 후 - 14 일, 잘 분리 된 개별 식민지는 크기가 다양하고, 액체 문화를 확장하는, 포착되었다. 게놈 DNA는 이들 세포로부터 단리 하였다. 프로 바이러스는 직접 구조 또는 PCR에 의해 회수 하였다. 복구 proviruses은 돌연변이 (그림 1)를 식별하는 순서가 있었다. 서열 분석은 Lasergene DNASTAR의 패키지를 사용하여 수행 하였다.
많은 세포 클론은 하나 이상의 돌연변이를 수행하기 때문에, 우리는 강하게 생체 외 및 생체 내 분석 모두에 의해 격리 이들 돌연변이를 확인하는 추천 (도 2 및도 3). 분리 변형의 활동을 확인하려면,사이트에 의해 생성 된 선택 변형은 JAK2V-617F 서열의 돌연변이 유발을 지시했다. 이러한 변형은 BAF3 세포 내로 재 도입하고, IC50 (IC50 값,도 2a)을 평가하기 Ruxolitinib의 상이한 투여시 세포의 증식 능력을 측정 하였다. 생화학 적 분석은 해제 대상 매개 저항 (그림 2B)를 배제하기 위해 Ruxolitinib의 용량 증가와 함께 배양 하였다 BAF3 세포의 단백질 용 해물에 면역 블롯 분석에 의해 포스 또는 포스 STAT5 수행된다. 높은 Ruxolitinib 농도에서 강화 된 IC50 값과 지속적인 인산화을 보이는 돌연변이 따라서 약제 내성 변종를 확인하고 있습니다. 많은 내성 돌연변이 가변 용량 반응을 표시하기 때문에, 따라서, 이들 돌연변이뿐만 아니라 생체 내 내성에 부여할지 여부를 테스트하기 위해 필수적이다. 그들이 비싸고 일반적으로, 우리는, 생체 내 실험 2-3 만 다른 변이체를 테스트하는 추천힘드는. 생체 저항을 확인하려면 BAF3 세포는 생체 내 추적을 가능하게 JAK2-V617F 변이와 루시 페라 제 / 체리를 표현하기 위해 설계되었다. 마우스를 2 주 동안 Ruxolitinib 주입 하였다 1-2000000 체리 양성 세포 (JAK2 변형 및 루시퍼 라제를 발현하는) 주사 하였다. 이주 후, 마우스 체리 양성 세포의 형광 (그림 3)를 측정하여 bonemarrow 및 말초 혈액에서 BAF3의 키메라에 대해서도 루시 페라 제 - 촉매 생물 발광 (그림 3)에 대한 영상화 하였다. 내성 변종 따라서 JAK2-V617F 변형을 표현 BAF3 세포가 생체 내에서 Ruxolitinib 치료에 내성이 있음을 시사 치료의 기간 동안 생물 발광에서 진보적 인 증가를 보여 동안 JAK2-V617F을 표현하는 마우스는, Ruxolitinib에 민감하다.
그림 2 :. 방식은 농도 의존적 세포 증식 분석 (A)와 서부 블로 팅 (B)를 사용하여 체외 검증에 보여주는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 3 : 생체 검증 사용 루시 페라 제의 개략도는 생물 발광 측정을 촉매. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.
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Discussion
임상 적 재발과 표적 유전자의 약제 내성 돌연변이의 출현 : CML 치료에 글리벡의 임상 성공은 작은 분자 억제제에 의해 루즈 키나제를 표적으로의 가능성 만 대상으로 치료도 발견 제한뿐만 아니라 보여 주었다. 저항 돌연변이의 식별 더 나은 임상 관리 및 차세대 억제제의 개발에 도움이됩니다. 이 프로토콜은 표적 유전자에 약제 내성 돌연변이를 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 E. 내장 무작위 돌연변이 플라스미드 라이브러리를 사용하여 대장균, 돌연변이 단백질을 표현. 이어서 BAF3 라이브러리 세포 (종양 유전자에 의해 변환에 민감)에 도입되어, 화학 요법 제의 존재하에 세포 클론의 선택에 따라. 내성 클론에서 대상 유전자의 염기 서열은 저항을 부여하는 돌연변이를 식별합니다. 마지막으로, 사이트에서 재현 확인 된 돌연변이에 대한 유효성을 검증하는 돌연변이 지시약물 내성.
이 전략을 사용하여 우리는 각각 Ruxolitinib과 글리벡에 대한 내성을 부여 JAK2 및 BCR / ABL 돌연변이의 스펙트럼을 정의했다. 우리는 BCR / ABL에 100 개 이상의 돌연변이를 확인했다. 또한, 환자에서 검출 모든 주요 돌연변이를 식별, 우리의 스크리닝 방법은 우리가 내부와 키나제 도메인을 넘어 모두 잔류의 새로운 대체를 식별 할 수 있었다. 흥미롭게도, 우리의 화면에서 모든 돌연변이는 환자 샘플에서 발견되었습니다하지만이 과정은 따라서 임상 적으로 문제가있는 약물 내성을 제기 할 것이다 돌연변이를 예상하려면이 화면의 능력을 보여주는, 거의 10 년 이상 15했다. 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 저항력이 스크리닝하는 다른 방법에 비해 많은 장점을 제공하지만, 잠재적 함정 스크리닝 절차에 따라지지 알고있다. 모든 심사를 들어, 강하게 대상에 완전히 의존하는 BAF3 세포에 권장되는 RESI에 대하여자세는 추구한다. 표적 유전자에 고장 또는 부분 의존 사실에 강한 클론을 개발하고 대부분 오탐 (false positive)을 개발하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 네 개의 다른 연구는 JAK2-V617F 의존성 16-19을 용이하게하기 위해 EPO 또는 MPL 수용체 중 하나 형질 BAF3 세포를 이용하여 JAK2 억제제에 대한 내성 검사를 수행했습니다. 다수의 저항 클론으로 인해 사이토 카인 수용체와 JAK1 및 JAK3의 헤테로 다이머에 기인 한 오탐 (false positive)의 출현 아마도, 돌연변이 부족이 개발 있지만 도메인 키나아제 제한 만 여덟 내성 돌연변이는,이 화면에서 확인되었다. 따라서, JAK2 의존성의 손실을 방지하기 위해 우리는 내성 돌연변이의 존재를 보여 주었다 Ruxolitinib 이러한 모든 클론에 대한 내성 클론의 강력한 선택을 보여 주었다 일반 BAF3에 내성 검사를 실시했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 내성 돌연변이의 전체 스펙트럼을 활용하기 위해, 우리는 것이 좋습니다 BaF3 세포JAK2 억제제 (16, 17)에 대해 수행 이전 내성 검사의 표준이되었습니다로들, 오탐 (false positive)의 출현을 방지하기 위해 대상 키나제에 완전히 의존해야한다. 이 높은 몇 가지 약제 내성 변종의 클론 지배로 이어질 수 있기 때문에 또한, 그것은 다른 돌연변이를 품고 세포가 함께 풀링 및 액체 배양에 확장 허용되는 대량 배양 조건을 방지하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 대량의 액체 배양에서 돌연변이 BCR-ABL의 글리벡 내성 초기 선택하는 동안, 우리는 첫 번째 100 우리가 염기 서열을 분리 내에서 여러 번 표현했다 단지 4 돌연변이 형태를 발견했다. 따라서, 부드러운 한천을 사용하여 선별하는 것은 대량 배양을 사용하여 식별 할 수없는 것입니다 복구 할 약물 내성의 더 겸손한도 느린 성장 클론을 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 전에 만 14 시간 16에 대한 선택에 대량 문화를 성장하는 것이 좋습니다, 부드러운 한천에 IL3없이 약물 선택에 따라. 우리의 예에서바이러스 성 전달 속도가 느린 성장 클론을 잃을 위험 (약하게 변형을) 포즈 높은 증식 클론에 의해 지배되는 경향이 후 perience 36 시간을 넘어 문화를 성장. 마찬가지로, 이전 시점에서 세포를 이용하여 바이러스 성 전달 후 6 ~ 8 시간, 따라서 저항 클론의 정체성과 주파수의 바이어스 및 허위 진술을 일으키는 원인이 매우 변형 또는 과발현 클론을 선택하는 경향이있다 등. 따라서, 우리는 개별 클론의 엄격한 선택을 제공하고, 일반적으로 대량의 액체 배양에서 관찰 클론 지배력을 방지 검사를위한 14 ~ 16 시간 포스트 바이러스 성 전달, 재배 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
그것은 몇 가지 클론 여러 돌연변이를 가지고 확인 된 이후, 절연 저항을 부여 할 수있는 후보 돌연변이의 능력을 확인하는 것이 필수적이다. JAK2-V617F 화면을 위해, 우리는 현장 감독 mutage를 사용하여 우리의 무작위 돌연변이 라이브러리에서 확인 된 돌연변이의 대부분을 다시nesis. 신선한 세포로 격리 돌연변이를 도입 한 후, 그들 각각에 대한 돌연변이의 IC50을 결정하기 위해 여러 가지 약물의 존재하에 배양 하였다. 우리는 또한 생체 내에서 추가의 약제 내성을 유발하는 단일 돌연변이 이들의 능력을 확인하기 위해 생물 발광을 모니터함으로써 생체 내 내성에 대해서 두 개의 다른 변형 저항성을 시험 하였다.
클리닉 키나아제 억제제의 서지 아연 암을 치료하는 항 - 키나아제 요법의 성공을 고려할 때 더 잘 관리하고 환자를 대상으로 약물 개발 수를 부여하는 돌연변이 임상 저항 문제를 식별하는 데 중요하다. 이 스크리닝 전략은 성공적 BCR / ABL, JAK2 FLT3 및 20에 돌연변이를 식별하는데 사용되었다; 그러나, 우리는 항신 생물의 넓은 범위에 일반적으로 적용 될 것이라고 생각합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
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