Summary
Veksten av arvelig motstandskraft mot kinase hemmere utgjør betydelig utfordring for effektiv kreftbehandling. Identifisering og karakterisering av resistente mutasjoner mot en nyutviklet legemiddel hjelper i bedre klinisk ledelse og neste generasjon drug design. Her beskriver vi vår protokoll for in vitro screening og validering av resistente mutasjoner.
Abstract
Oppdagelsen av BCR / ABL som driver onkogen ved kronisk myelogen leukemi (CML) resulterte i utviklingen av imatinib, som i virkeligheten vist potensial for målretting kinase i kreft ved effektivt å behandle KML-pasienter. Denne observasjonen revolusjonert legemiddelutvikling for å målrette de onkogene kinaser er implisert i en rekke andre ondartede sykdommer, for eksempel, EGFR, b-RAF, KIT og PDGFRs. Det er imidlertid en stor ulempe med anti-kinase terapier fremveksten av medikamentresistensmutasjoner gjengivelses målet å ha redusert eller tapt affinitet for legemidlet. Forstå mekanismene ansatt av resistente varianter ikke bare hjelper i å utvikle neste generasjons-hemmere, men gir også impulser til klinisk styring ved hjelp av personlig medisin. Vi rapporterte en retroviral vektor basert screening strategi for å identifisere spekteret av motstand overdragelse mutasjoner i BCR / ABL, som har bidratt i utviklingen av neste generasjon BCR / ABL-hemmere. Hjelp Ruxolitinib og JAK2 som et medikament mål pair, her vi beskrive in vitro screening metoder som utnytter mus BAF3 celler som uttrykker den tilfeldig mutasjon bibliotek av JAK2 kinase.
Introduction
Proteinkinaser er viktige regulatoriske enzymer av intracellulære signaltransduksjonsveiene som tilsynelatende modulerer hver cellular funksjon. En skikkelig kontroll av kinase mediert signalering er avgjørende for homeostase og utvikling, som for det meste er avhengig av riktig regulering av kinaser, fosfataser og dens degradering av UPS (ubiquitin proteasom system). Deregulerte kinaser er på sentrum scene for mange kreftformer og innblandet i rekke menneskelige sykdommer 1. Menneskelige genom koder mer enn 500 protein kinaser som har vært knyttet direkte eller indirekte, til ~ 400 menneskelige sykdommer 2. Disse observasjonene støttet konseptet for terapeutisk målretting av kinaser av små molekyl hemmere 3-5.
Demonstrasjon av ABL kinase hemmere, som Imatinib, i behandling av kronisk myelogen leukemi (KML) forutsatt at proof of concept for denne tilnærmingen 6,7. Denne observasjonen ikke bare revolusjon maureni-kinase terapi, men også håndheves ideen om å identifisere de genetiske lesjoner i andre neoplastiske sykdommer for terapeutisk målretting, noe som fører til oppdagelsen av onkogene mutasjoner i JAK2 fra polycytemi vera (PV) og pasienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN). Denne oppdagelsen vakt stor interesse i behandling MPNs ved å målrette JAK2 med små molekyl kinase hemmere. Nå, nesten et dusin av JAK2 hemmere er i kliniske studier, og en av dem har blitt godkjent nylig for behandling av myelofibrose. Mens spesifikk målretting av onkogene kinaser av små molekyl hemmere i kreft bringe lovende utfallet, det også lider av å utvikle resistens mot behandlingen. Faktisk, så langt, pasienter behandlet med kinase hemmere, som Imatinib, Gefitinib, Erlotinib og Dasatinib utviklet resistens mutasjoner meste ved å anskaffe mutasjoner i kinase domenet som legemiddel rettet mot 8-10. Motstand som et resultat av genmutasjon belyser de begrensninger of målrettet monoterapi mot onkogene kinaser, og representerer den neste utfordringen i utviklingen av stadig mer vellykket kreft kjemoterapi. Mekanistiske og funksjonelle konsekvenser av legemiddelresistens bør gi en begrunnelse for valg og utforming av gratis forbindelser for legemiddelutvikling. Identifiserte mutasjoner via in vitro-skjermer, har vist en høy grad av korrelasjon med de man finner hos pasienter. Derfor in vitro screening for mutasjoner som resistens for en gitt legemiddel målparene i kliniske eller prekliniske utviklings bistår i å identifisere motstands mønstre som sannsynligvis vil føre til klinisk tilbakefall. Identifiseringen av disse mutante former er ikke bare nyttig i overvåkingen av pasienter for narkotika respons og tilbakefall, men også avgjørende for utforming av mer robuste neste generasjons hemmere. For eksempel utvikling av neste generasjons BCR / ABL-hemmere, Nilotinib og Ponatinib, ble gjort mulig på grunn av større mechanistic forståelser fått fra mutagenese, strukturelle og funksjonelle studier.
Tidligere har vi rapportert resultatene av vår skjermen ved hjelp tilfeldig mutagenese av BCR / ABL å avsløre spekteret av mutasjoner som gir resistens mot hemmere som Imatinib 11,12, PD166326 12, og AP24163 13. Resultatene ikke bare identifisert mutasjoner klinisk resistens og sykdom tilbakefall, men også gitt den mekanistisk forståelse av resistens og prinsipper kinase funksjon 11,14. Her vi gi ytterligere metodisk detalj, ved hjelp Ruxolitinib og JAK2 som et medikament mål pair, for å muliggjøre en bredere anvendelse av denne screening strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer i denne protokollen ble gjennomført i henhold til National Institute of Health retningslinjer for etisk behandling og stell av dyr, og i henhold til en godkjent IACUC dyr bruk protokollen.
1. cellelinje Vedlikehold
- Kultur BAF3 celler i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin (100 enheter / ml og 100 ug / ml) og brukt dyrkningsmedium fra WEHI-celler. Vokser HEK293T celler i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin (100 enheter / ml og 100 ug / ml). Opprettholde cellene ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2.
2. Plasmid Construction
- Klone mus JAK2 og dens onkogene isoform JAK2-V617F i pMSCV-puro-GW av LR clonase med standard rekombinasjon kloning prosedyre.
- For bygging av luciferase-ekspresjonsvektor (pMSCV-Luc-Cherry-GW) som brukes i in-vivo imaging, forsterke luciferase fra pLVX-Tet-ON vektor ved PCR hjelp primere (HiL-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG og HiL-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) fulgte med kloning i pENTR-SD-TOPO å generere pENTR-Luc, som brukes å overføre luciferasegenet i retroviral vektor, pMSCV-Cherry-GW ved rekombinasjon mediert kloning ved hjelp av LR clonase.
3. Utarbeidelse av tilfeldig mutasjon Bibliotek, resirkulering og Identifisere Mutasjoner
3.1) Random Mutagenesis
- Clone full lengde av JAK2 villtype og V617F mutasjon i pMSCV-puro-GW retrovirusvektoren bruker en kommersiell rekombinasjon kloning teknologi.
- Bruk en mikrogram av JAK2-V617F plasmid DNA for å forvandle, XL-1 rød, E. coli-celler, som er defekt i DNA reparasjonsmekanismer dermed gi dem muligheten til å innlemme tilfeldige mutasjoner under replikering. Mer spesifikt, blande 50-100 ng DNA (mer enn 100 ng av DNA avtar transformasjonseffektivitet) med 100 pl av kompetente celler i en på forhånd avkjølt polypropylenrør og inkubert på is i 30 minutter, forsiktig virvlende hver 5 min. For et godt bibliotek dekning, bruker 05:56 rør av kompetente celler.
MERK: Mer enn 100 ng DNA avtar transformasjon effektivitet - Dyppe røret i et vannbad ved 42 ° C i et varmesjokk på 45 sekunder og inkuberes på is i 2 min. Deretter legger 1 ml SOC-medium (2,0% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, og 0,4% D-glukose). Inkuber røret ved 37 ° C under risting ved 225 til 250 rpm i 90 min.
- Tallerken celler fra hvert rør på fire 10 cm LB-agarskåler inneholdende 100 ug / ml ampicillin. Inkuber platene for 16 - 24 timer ved 37 ° C.
- Etter synlige kolonier, samle dem ved å skrape platene med en steril plate skraper. Pool-celler fra hver plate og isolere plasmid-DNA ved å bruke et kommersielt plasmid ekstraksjon kit.
MERK: Vanligvis kolonier er mindre og ta 18-24 timer å væresynlig fordi disse er langsomt voksende bakteriestammer. På dette stadium, vurdere heterogenitet av mutasjoner i biblioteket ved restriksjonsspaltning med en hyppig kutter som Sau3A1 eller Taq1 eller sekvensering.
3.2) Fremstilling av retrovirale Supernatanter og Transduksjon
- En dag før transfeksjon, platen 4 x 10 6 HEK 293T-celler over på 100 cm skåler i DMEM inneholdende 10% FCS, penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin.
- Neste dag, erstatte mediet og transfektere cellene med mutagenisert pMSCV-JAK2-V617F bibliotek. For hver 10 cm plate, blande 10 ug DNA (5 pg av plasmid-bibliotek og 5 ug av retroviral pakke plasmid, pCLEco) med 40 ul av Fugene til et totalt volum på 400 ul ved bruk av serumfritt DMEM medier. Inkuber DNA og lipid-blanding i 20 minutter ved romtemperatur. Etter 20 min tilsett DNA-lipidkompleks dråpe klok på toppen av HEK293T celler.
- Etter seks timer, endre transfeksjon media wed friskt medium og inkuber platene i 48 timer ved 37 ° C for virusproduksjon. Etter 48 timers inkubasjon, samle virale supernatantene filtreres gjennom et 0,45 um Acrodisc-filter.
3.3) Valg av resistente kloner In Vitro
- For medikamentresistente JAK2-V617F mutanter, transduce 100 millioner BAF3 celle med 100 ml av virus supernatanter har en viral titer på 0,5-1 x10 6. Mer spesifikt, bland 10 8 celler med 100 ml virus supernatanten til et totalvolum på 300 ml ved bruk av RPMI-medium, inneholdende 10% serum og 24 pg / ml av polyberene (sluttkonsentrasjon på ployberene er 8 ug / ml). Distribuere disse cellebatterier i multippel seks brønners plater (4-5 ml per brønn).
- Sentrifuger platene ved 1250 xg i 90 min ved 25 ° C. Etter sentrifugering, inkuberes platene ved 37 ° C i 24 timer.
- Neste dag, basseng cellene sammen og bland med Ruxolitinib og medium som inneholder myk agar og belagt i six brønners plater. For hver medikamentkonsentrasjon, bland 10 ml BAF3 transduserte celler (10 til 20 millioner celler) med den passende mengde av Ruxolitinib i et 50 ml rør. Gjøre opp volumet til 40 ml ved hjelp RPMI som inneholder 20% serum. Tilsett 10 ml 1,2% agar til cellene, mixcarefully og platen i seks-brønners plater.
- Inkuber platene ved 37 ° C i to uker. Plukk de resistente kolonier som bruker 0,2 ml pipette tips og sub-kultur dem individuelt i 24 brønners plater i 3-4 dager.
- Høste BAF3 resistente celler ved sentrifugering ved 450 x g i fem minutter ved romtemperatur. Isolere genomisk DNA ved hjelp av en kommersiell genomisk DNA isolasjon kit. PCR forsterke full lengde JAK2 cDNA fra 100 ng av genomisk DNA ved hjelp av primere (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG og mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) og langsmal utvide høy fidelity PCR-systemer.
- Separer PCR-produktene etter agarosegel-elektroforese. Skjære de 3,4 kb av DNA-band som representerer JAK2 koding ramme og isolere DNAved hjelp av en kommersiell gel utvinning kit. Sekvens den fulle lengde av cDNA ved anvendelse av 8 interne primere (P1 - P8) som strekker seg over den kodende sekvensen og analysere sekvenser ved hjelp av kommersiell programvare.
4. In Vitro Validering av Resistente Mutasjoner
Mange celleklonene bære mer enn én mutasjon, å teste bidraget fra hver mutasjon i motstand fenotype, generere utvalgte varianter av seterettet mutagenese ved hjelp pMSCV-JAK2V-617F plasmid som mal.
- Utføre nettstedet mutagenese på pMSCV-JAK2-V617F plasmid ved hjelp av en kommersiell mutagenese kit og oligonukleotider utformet for å skape punktmutasjoner. Bekrefte identiteten til muterte kloner ved sekvensering.
- Transduce BAF3 celler med retrovirus laget ved hjelp av mutante plasmider fulgt med valg med puromycin på 1 ug / ml.
- Platen 10 4 BAF3-JAK2 V617F-celler (50 pl RPMI med 10% FCS) i hver brønn av en 96-brønners plate. Separatly tilsett 50 pl av ruxolitinib inneholdende medium til brønnene på tvers av platen (sluttkonsentrasjon: 0, 1, 3, 5, 10 og 20 pM), og inkuber platene i 60 timer ved 37 ° C.
- Vurdere cellelevedyktigheten ved tilsetning av 10 ul WST-1-reagens til hver brønn fulgt med inkubering ved 37 ° C i 2-4 timer. Posten absorbans ved A450 med en plateleser. Utføre alle analyser i tre eksemplarer og tomten gjennomsnitt absorbans mot INCB018424 konsentrasjoner. Utføre en best-fit sigmoidkurven ved hjelp av en ikke-lineær kurvetilpasning algoritme. Resultat legemiddelkonsentrasjonen som resulterer i 50% celleviabilitet som den cellulære IC50.
- Deretter plate seks millioner BAF3 celler som uttrykker JAK2 varianter i seks-brønners plater i RPMI medium inneholdende 10% serum med økende konsentrasjoner av ruxolitinib og inkubert i 4-6 timer ved 37 ° C.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 450 x g i fem minutter ved 4 ° C. Vask cellene en gang med PBS, og lyse i 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumvanadat, og 5% glycerol supplert med protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitorer. Sonikere cellesuspensjon i 1 minutt, etterfulgt av tilsetning av 5 x gel lastebuffer (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM natriumvanadat , Protease cocktail, 50% glyserol og 0,001% bromfenolblått) og denaturering ved 70 ° C i 5-10 min.
- Løse proteiner på en 8% SDS polyacrylamidgel henhold denaturerende forhold. Utføre immunoblotting med monoklonalt anti-phopsho STAT5. Stripe blotter og reprobed med en kaninpolyklonalt anti-SATA5 antistoff. Visual bandene bruker ECL reagenser i henhold til leverandørens anbefaling.
5. I Vivo Validation
- Transduce BAF3 celler som uttrykker luciferase og kirsebær (transdusert med retrovirus laget av pMSCV-Luc-cherry GW) med virus som uttrykker JAK2-V617F og resistente varianter. Velg celler som overlever puromycin utvalg for uttrykket av JAK2 og dets motstand varianter.
- Injisere to millioner aktivt voksende BAF3-Luc / kirsebær celler som bærer JAK2-V617F og dens resistente varianter i 200 ul PBS til 6 Balb / C-mus via halevene-injeksjon.
- Etter tre dagers celletransplantasjoner, injisere musene med Ruxolitinib (100 mg / kg) to ganger daglig i to uker.
- Utføre luciferase-basert Bioluminescens bildebehandling med et bildebehandlingssystem. .
- I korte trekk fremstille luciferin oppløsning ved å oppløse 300 mg i 25 ml sterilt avionisert vann, målt andel i mindre volumer og lagre.
MERK: Oppbevar luciferin ved -80 ° C og beskyttes mot lys inntil bruk. - Injisere 250 ul til hver mus ved bruk av IP for å oppnå 125 mg / kg i hver mus. Bedøve mus fra samme gruppe sammen ved hjelp av inhalert isofluran (1,5% -2,0%) i en forseglet boks. Påfør dyrlege salve på the øye å hindre tørrhet.
MERK: Tiden det tar for mus å sove (10-15 min) lov luciferin aktivitet til topp. Hold tid konsekvent mellom gruppene for å unngå variasjon.
- I korte trekk fremstille luciferin oppløsning ved å oppløse 300 mg i 25 ml sterilt avionisert vann, målt andel i mindre volumer og lagre.
- Overfør mus umiddelbart til bildebehandling kammer scenen og opprettholde anestesi på 1,5-2% isofluorane under bilde prosedyrer. Bilde mus med sekvensiell 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 og 300 sek eksponering. Ta bilder og kvantifisere Bioluminescens intensitet ved hjelp av bildeopptak og analyseprogramvare. Etter avbildning returnere musene tilbake til sitt bur.
- For, in vivo kimerisme høste totale bonemarrow celler. Avlive mus med CO 2 for 5 min fulgt med halshugging. Høste bein og knuse i 4 ml kald PBS å samle benmargen. Analyser prosent kirsebær positive celler under fluorescens mikroskop og kvantifisere hjelp FACS. Samle tjue tusen hendelser fra hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Veksten av genetiske mutasjoner utgjør stor utfordring for den målrettede anti kinase terapi. Mutasjonsstudier, foruten å gi mekanistiske og funksjonelle innsikt som er medvirkende i valg og utforming av neste generasjons narkotika utvikling, gjør det også bedre klinisk ledelse og kan i fremtiden være mer nyttig for personlig behandling. I dette forsøket viser vi screening for ruxolitinib resistensmutasjoner i JAK2-V617F kinase (figur 1). Vi konstruerte pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vektor ved å innføre full-lengde mus JAK2-V617FcDNA inn pMSCV-Cherry-GW. Det anbefales å bruke bakteriell vert (XL-1 rød stamme av E. coli) for å utvikle tilfeldige mutasjoner i løpet av de mest populære valget av metoden, som er PCR, på grunn av begrensninger i forbindelse med sekvens forspenning og større genfragmenter er vanskelige å forsterke . Tilfeldig mutagenisert DNA-biblioteket ble transfektert til HEK293T celler for retrovirus produksjon. Disse mutant viranvendelser ble brukt for å, omsette de BAF3 celler som ble valgt for kolonivekst i bløt agar i fravær av IL-3 med enten en eller 5 uM Ruxolitinib. Under disse betingelser kolonier oppstå i forbindelse med celler som bærer JAK2V-617F cDNA som uttrykker funksjonelle og resistent variant av kinase. Etter 10 - 14 dager, ble godt separerte individuelle kolonier plukket, som varierte i størrelse, og utvidet dem i flytende kultur. Genomisk DNA ble isolert fra disse celler. Den provirus ble utvunnet ved direkte redning eller ved PCR. De gjen provirus ble sekvensert for å identifisere mutasjoner (figur 1). Sekvensanalyser ble utført ved hjelp av DNASTAR pakke av Lasergene.
Fordi mange cellekloner gjennomført mer enn én mutasjon, anbefaler vi på det sterkeste å validere disse mutasjonene i isolasjon av både in vitro og in vivo (Figur 2 og 3). For å verifisere aktivitet varianter i isolasjon,utvalgte varianter ble generert ved seterettet mutagenese av JAK2V-617F-sekvensen. Disse variantene ble gjeninnføres i BAF3 celler, og måles for celleproliferasjon evne til forskjellig dosering av Ruxolitinib å evaluere IC50 (IC50-verdier, figur 2A). Biokjemiske analyser er utført for fosfotyrosin eller fosfor-STAT5 ved immunoblotanalyse på proteinlysatene av BAF3 celler som ble inkubert med økende doser av Ruxolitinib å utelukke noen utenfor mål mediert motstand (figur 2B). Mutanter som viser forbedrede IC50 verdier og vedvarende autofosforylering ved høyere Ruxolitinib konsentrasjoner dette bekreftes å være resistente varianter. Fordi mange resistente mutasjoner viser variabel doserespons, derfor er det viktig å teste om disse mutasjonene vil konferere in vivo motstand også. Vanligvis anbefaler vi å teste bare 2 -3 ulike varianter for in vivo eksperimenter, som de er dyre ogstrevsom. Å validere in vivo motstand, ble BAF3 celler konstruert for å uttrykke JAK2-V617F varianter og Luciferase / kirsebær for å aktivere in vivo sporing. Mus ble injisert med 1-2 millioner kirsebær positive celler (som uttrykker JAK2 varianter og luciferase), etterfulgt av Ruxolitinib injeksjon i to uker. Etter to uker ble mus avbildes for luciferase-katalysert bioluminescens (figur 3), og også for BAF3 kimerisme i bonemarrow og perifert blod ved å måle fluorescensen av kirsebær-positive celler (figur 3). Mus som uttrykker JAK2-V617F er følsomme for Ruxolitinib, mens resistente varianter viser progressiv økning i bioluminescens over perioden for behandlinger, og dermed tyder på at celler som uttrykker BAF3 JAK2-V617F variant er motstandsdyktig mot Ruxolitinib behandling in vivo.
Figur 2:. En ordning som viser in vitro validering ved hjelp av doseavhengige celle proliferasjonsanalyser (A) og western blotting (B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: En skjematisk fremstilling av in vivo validering ved hjelp av luciferase katalysert Bioluminescens måling. Klikk her for å se et størreversjon av denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kliniske suksessen Imatinib i behandling av KML demonstrert ikke bare potensialet for målretting rouge kinaser av små molekyl hemmere, men også avdekket begrensninger av målrettet terapi: klinisk tilbakefall og fremveksten av resistensmutasjoner i målet genet. Identifisering av resistensmutasjoner hjelper i bedre klinisk ledelse og utvikling av neste generasjons hemmere. Denne protokollen beskriver en metode for å identifisere resistente mutasjoner i den målrettede genet. Denne metoden bruker en tilfeldig mutagenisert plasmid bibliotek bygget i E. coli, for å uttrykke de mutante proteiner. Biblioteket blir deretter innført i BAF3 celler (som er mottakelige for transformasjon av et onkogen), etterfulgt med utvalg av cellekloner i nærvær av kjemoterapeutiske midler. Sekvensering av målrettet genet fra resistente kloner identifiserer mutasjoner gir resistens. Til slutt identifiserte mutasjoner blir gjenskapt av nettstedet mutagenese å validere dem forresistens.
Ved hjelp av denne strategien vi definert spekteret av mutasjoner i JAK2 og BCR / ABL gir resistens mot Ruxolitinib og Imatinib, henholdsvis. Vi identifisert mer enn hundre mutasjoner i BCR / ABL. Dessuten, å identifisere alle de store mutasjoner påvist hos pasienter, tillot vår screening metode for oss å identifisere nye erstatninger av rester både innenfor og utenfor kinasedomenet. Interessant nok har alle mutasjoner fra vår skjerm blitt identifisert i pasientprøver, men denne prosessen tok nesten mer enn 10 år 15, og dermed demonstrerer evne til denne skjermen for å forutse mutasjoner som vil utgjøre klinisk problematisk motstand. Mens motstandsdyktig screening ved hjelp av tilfeldig mutagenese gir mange fordeler i forhold til andre metoder, er det potensielle fallgruver å være klar over når du følger en screening prosedyre. For noen screening, er det sterkt anbefalt for BAF3 celler til å være fullstendig avhengig av målet mot der resiholdning er søkt. En svikt eller delvis avhengighet av målgenet kan ikke utvikle sanne resistente kloner og mest sannsynlig utvikler falske positiver. For eksempel har fire ulike studier utført motstandsdyktig screening mot JAK2 hemmere ved hjelp BAF3 celler transdusert med enten EPO eller MPL reseptorer å lette JAK2-V617F avhengighet 16-19. Bare åtte resistente mutasjoner begrenset til kinasedomene ble identifisert fra disse skjermene, selv om mange resistente kloner utviklet som manglet mutasjoner, antagelig på grunn av fremveksten av falske positiver, som ble tilskrevet heterodimerisering av JAK1 og JAK3 med cytokinreseptorer. Derfor, for å unngå tap av JAK2 avhengighet vi utført motstandsdyktig screening i ren BAF3 som viste sterk seleksjon av resistente kloner mot Ruxolitinib og alle disse kloner viste tilstedeværelse av resistente mutasjoner. Basert på disse observasjonene, for å utnytte hele spekteret av resistente mutasjoner, anbefaler vi at BaF3 celles bør være helt avhengig av den målrettede kinase å unngå fremveksten av falske positiver, som har vært en norm i tidligere resistente screenings utført mot JAK2 hemmere 16,17. I tillegg er det viktig å unngå massedyrkningsforhold i hvilke celler som inneholder forskjellige mutasjoner kan grupperes sammen og tillates å utvide seg i flytende kultur, siden dette kan føre til klonal dominans av et par sterkt medikament-resistente varianter. For eksempel, i løpet av første utvalget for imatinib-resistens av mutageniserte BCR-ABL i bulk flytende kultur, fant vi bare 4 mutante former som var representert flere ganger i løpet av de første 100 isolerer vi sekvensert. Derfor screening ved hjelp av myk agar lar langsomt voksende kloner med mer moderate grader av medikamentresistens som skal gjenvinnes som ikke ville bli identifisert ved hjelp av masse kultur. Av denne grunn er det anbefalt å øke bulk kultur før valget bare for 14 til 16 timer, fulgt med medikamentseleksjon uten IL3 i myk agar. I vår exerfart, vokser de kulturene utover 36 timer etter viral transduksjon tendens til å bli dominert av svært proliferative kloner, som utgjør en risiko for å miste sakte voksende kloner (svakt transformative). På samme måte, ved hjelp av celler fra en tidligere tidspunkter som 6-8 timer etter viral transduksjon er tilbøyelige til å velge for høyt transformative eller overekspresjon kloner, og dermed forårsaker en skjevhet og feilaktig fremstilling i identitet og hyppighet av motstands kloner. Derfor anbefaler vi å bruke celler dyrket for 14-16 timer etter viral transduksjon for screening, som gir tett utvalg av individuelle kloner og hindrer klonal dominans vanligvis observert i flytende bulk kulturer.
Det er viktig å bekrefte en kandidat mutasjon evne til å gi resistens i isolasjon, ettersom noen kloner ble identifisert til å ha flere mutasjoner. For JAK2-V617F skjermen, gjenskapt vi et flertall av de identifiserte mutasjoner fra vår tilfeldig mutagenese bibliotek bruker nettstedet rettet mutageNesis. Etter innføring av de isolerte mutanter i friske celler, de ble deretter dyrket i nærvær av forskjellige stoffer for å bestemme IC50s for hver mutant. Vi har også testet to forskjellige resistente varianter for in vivo resistens ved å overvåke Bioluminescens for ytterligere å bekrefte evnen til disse enkeltmutasjoner å forårsake resistens in vivo.
Gitt suksess av anti-kinase terapi i behandling av kreft som galvaniserte en bølge av kinase hemmere i klinikker, er det avgjørende å identifisere klinisk problematisk motstand overdragelse mutasjoner for bedre pasientbehandling og utviklings medikamenter som kan målrette dem. Dette screening strategien har blitt brukt til å identifisere mutasjoner i BCR / ABL, JAK2 og FLT3 20; men vi mener at det vil være aktuelt generelt til et bredt spekter av antineoplastiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
