Summary
Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.
Abstract
Kronik miyeloid lösemi (KML) bir sürücü onkogen olarak BCR / ABL keşif aslında, etkin bir KML hastaları tedavi ile kanserlerde kinaz hedefleyen potansiyelini gösterdi, Imatinib, geliştirme sonuçlandı. Bu gözlem gibi EGFR, B-RAF, KIT ve PDGFRs, gibi çeşitli diğer maligniteler, karıştığı onkojenik kinazlar hedef ilaç geliştirme devrim. Ancak, anti-kinaz tedavilerin bir büyük dezavantajı hedef render ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması azalır veya ilaç için afinite kaybetmiş olmaktır. Gelecek nesil inhibitörleri gelişmekte yardımcı olur, aynı zamanda kişiselleştirilmiş ilaç kullanarak klinik yönetimi ivme verir sadece dirençli varyantları tarafından istihdam mekanizmaların anlaşılması. Biz yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri gelişmekte yardımcı oldu BCR / ABL, mutasyonlar veren direnç spektrumunu belirlemek için bir retroviral vektör tabanlı tarama stratejisi bildirdi. Ruxoli kullanılmasıBir ilaç hedef çifti olarak tinib ve JAK2, burada JAK2 kinaz rastgele mutasyon kütüphane ifade fare BAF3 hücrelerini kullanan in vitro tarama yöntemleri açıklar.
Introduction
Protein kinazlar, görünüşte her hücre fonksiyonunu modüle eden hücre içi sinyal iletim yollarında önemli bir düzenleyici enzimdir. Kinaz aracılı sinyalizasyon düzgün bir denetim çoğunlukla UPS tarafından kinazlar, fosfatazların ve bozulması uygun yönetmelik (Ubikutin proteazom sistemi) dayanır homeostaz ve gelişim için çok önemlidir. Kuralsız kinazlar birçok kanser merkezi aşamasında olan ve insan hastalıklarının 1 ev sahibi sorumlu. İnsan genomu ile doğrudan ya da dolaylı olarak bağlantılı olmuştur 500'den protein kinazları için ~ 400 insan hastalıkları 2 kodlar. Bu gözlemler, küçük molekül inhibitörleri 3-5 kinaz terapötik hedefleme için düşüncesini desteklemiştir.
Kronik miyeloid lösemi (KML) tedavisinde gibi Imatinib gibi ABL kinaz inhibitörlerinin, gösteri, bu yaklaşımın 6,7 konseptinin kanıtı sağlanmıştır. Bu gözlem sadece karınca devrimi-kinaz tedavi değil, aynı zamanda Miyeloproliferatif neoplazmlar (EMS) ile polisitemi vera (PV) ve hastaların JAK2'nın onkojenik mutasyonlar keşfine yol terapötik hedefleme için diğer neoplastik hastalıklar, genetik lezyonların tespit etmek fikri zorlanan. Bu keşif, küçük molekül kinaz inhibitörleri ile JAK2 hedefleyerek MPNs tedavisinde büyük ilgi gördü. Şimdi, JAK2 inhibitörlerinin neredeyse bir düzine klinik çalışmalarda ve bunlardan bir tanesi myelofibrozis tedavisi için son onaylanmıştır. Kanserlerde küçük molekül inhibitörleri tarafından onkojenik kinaz spesifik hedefleme umut verici sonuçlar getirmek, aynı zamanda tedaviye direnç gelişmekte muzdarip. Aslında, bugüne kadar, hastalar çoğunlukla ilaç 8-10 hedefler için hangi kinaz etki mutasyonlar alarak böyle İmatinib, Gefitinib, Erlotinib ve Dasatinib gibi kinaz inhibitörleri, direnç mutasyonları geliştirdi tedavi. Gen mutasyonu sonucu direnç o sınırlamaları vurgulamaktadırf onkojenik kinazlara karşı monoterapi hedefli ve her zamankinden daha başarılı kanser kemoterapisi gelişiminde bir sonraki meydan temsil eder. Ilaç direncinin mekanik ve fonksiyonel sonuçları seçimi ve ilaç geliştirme için ücretsiz bileşiklerin tasarımı için bir gerekçe sunmalıdır. In vitro ekranlar ile tanımlanan mutasyonlar, hastalarda bulunanlar ile korelasyon yüksek derecede göstermiştir. Bu nedenle, klinik nüks neden muhtemeldir direnç kalıplarını belirlemede klinik veya preklinik kalkınma asist belirli bir ilaç hedef çiftleri için ilaç direnç kazandıran mutasyonlar in vitro tarama. Bu mutant formlarının tanımlanması sadece ilaç tepkisi ve nüksetme ama daha güçlü yeni nesil inhibitörlerinin tasarımı için de gereklidir için hastaların izlenmesinde yararlı olacaktır. Örneğin, yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri, nilotinib ve Ponatinib gelişmesi için, çünkü daha mec mümkün olmuşturhanistic anlayış mutagenez, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar elde.
Daha önce, biz böyle Imatinib 11,12, PD166326 12, ve AP24163 13 gibi inhibitörleri direnç kazandıran mutasyonlar spektrumunu ortaya çıkarmak için BCR / ABL rastgele mutajenezini kullanarak ekranın sonuçlarını bildirmişlerdir. Sonuçlar sadece klinik direnç ve hastalık nüksü veren mutasyonları tespit değil, aynı zamanda ilaç direnci ve kinaz fonksiyonunu 11,14 yöneten ilkeler mekanik anlayış sağladı. İşte bu tarama stratejisinin daha geniş bir uygulama sağlamak için, bir ilaç hedef çifti olarak Ruxolitinib ve JAK2 kullanarak, ek metodolojik ayrıntı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol tüm işlemler hayvanların etik tedavisi ve bakımı için kurallar Ulusal Enstitüsü göre yapılan ve onaylı IACUC hayvan kullanımı protokolüne göre edildi.
1. Hücre Hat Bakım
- RPMI-1640 ortamı içinde kültür BAF3 hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin (100 ünite / ml ve 100 ug / ml) ile WEHI Hücrelerinin geçirilerek kültür ortamı desteklenmiştir. % 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücrelerin büyümesine (100 birim / ml ve 100 ug / ml). % 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C'de hücreler muhafaza edin.
2. Plasmid Yapı
- Fareyi JAK2 ve LR tarafından pMSCV-puro-GW onun onkojenik izoformu JAK2-V617F standart rekombinasyon klonlama prosedürü kullanılarak klonaz Clone.
- Lusiferaz ekspresyon vektörü (pMSCV-Luc-Kiraz-GH) oluşturulması için in vi kullanılanvo görüntüleme kullanılır pENTR-Luc oluşturmak için pENTR SD-TOPO klonlama ile takip primerler (AP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC LUC SD / PR TTACAATTTGGACTTTCCG ve LUC SD /) kullanılarak PCR ile pLVX-Tet-ON vektöründen lusiferaz yükseltmek LR klonaz kullanılarak yeniden birleştirme aracılı klonlaması ile bir retroviral vektör, pMSCV Cherry-GW Lusiferaz geninin aktarmak için kullanılır.
Rastgele Mutasyon Kütüphanesi 3. hazırlanması, Mutasyonlar Eleme ve belirlenmesi
3.1), rasgele mutajeniz
- JAK2 yabani tip ve ticari rekombinasyon klonlama teknolojisini kullanarak pMSCV-puro-GW retroviral vektörü içine V617F mutasyon Klon tam uzunlukta.
- , Dönüştürmek için JAK2-V617F plazmid DNA 1 mikrogram kullanın XL-1 Kırmızı, E. böylece onları çoğaltma sırasında rastgele mutasyonlar dahil etmek izin DNA tamir mekanizmaları kusurlu coli hücreleri,. Daha özel olarak ise, 50 karıştırın - DNA, 100 ng, 10 ile (daha fazla DNA 100 ng transformasyon etkinliğini azaltır)0 önceden soğutulmuş polipropilen tüp içinde yetkin hücre ul ve yavaşça her 5 dakikada dönen, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Iyi bir kütüphane içerisinde için yetkin hücrelerin 4-6 tüpler kullanmaktadır.
NOT: DNA 100'den fazla ng dönüşüm verimliliği azaltır - 45 saniyelik bir ısı şoku 42 ° C 'de bir su banyosunda tüp daldırın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Daha sonra, SOC ortamında 1 ml (% 2.0 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.05 NaCl, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4 ve% 0.4, D-glukoz) ekleyin. 90 dakika boyunca 225-250 rpm'de çalkalanırken 37 ° C'de tüp inkübe edin.
- 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden dört adet 10 cm LB-agar plakaları üzerinde her tüp Plaka hücreleri. 37 ° C'de 24 saat - 16 inkübe edin.
- Görünür koloniler ardından, steril bir plaka kazıyıcı ile plakaları kazınarak onları toplamak. Ticari bir plazmid ekstre etme kiti kullanılarak her plaka ve izole plazmid DNA Havuz hücreleri.
Genellikle koloniler küçük ve olmaya 18-24 saat sürebilir: NOTGörünür bu yavaş büyüyen bakteri suşları çünkü. Bu aşamada, örneğin Sau3A1 veya Taq1 ya da sekanslama Bir sık kesici ile sınırlama sindirimi ile kütüphanede mutasyonlarının heterojen değerlendirmek.
Retroviral süpernatanlarından ve İletim 3.2) üretimi
- Transfeksiyondan bir gün, levha% 10 FCS, penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin içeren DMEM içinde 100 cm'lik kaplar üzerine 4 x 10 6 HEK 293T hücreleri önce.
- Ertesi gün, orta yerine ve Mutagenezli pMSCV-JAK2-V617F kütüphanesi ile hücreleri transfect. Her biri 10 cm plaka için, serumsuz DMEM ortamı kullanılarak 400 ul toplam hacmine FuGENE 40 ul DNA 10 ug (plazmid kütüphanesi 5 ug ve retroviral paketleme plazmid 5 ug, pCLEco) karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika için DNA ve lipit karışımı inkübe edin. 20 dakika sonra HEK293T hücrelerin üzerine damla DNA lipit kompleksi damla ekleyin.
- Altı saat sonra, transfeksiyon ortamı ağırlık değiştirmeki taze ortam virüs üretimi, 37 ° C 'de 48 saat süre ile plakalar inkübasyon ve. Inkübasyondan 48 saat sonra, bir 0.45 um Acrodisc filtreden filtre viral süpernatanların toplanması.
In Vitro dirençli klonlar, 3.3) Seçim
- Ilaca dirençli JAK2 V617F-mutantlar için, 0.5-1 x10 6 arasında bir viral titreye sahip bir virüs yüzer 100 ml 100,000,000 BAF3 hücrenin transduse edilmesi. Daha özel olarak ise,% 10 serum içeren RPMI ortamı kullanılarak, 300 ml lik bir toplam hacme kadar virüs yüzer, 100 ml ve polyberene 24 ug / ml (ployberene nihai konsantrasyon 8 mg / ml) ile 10 8 hücreleri karıştırın. Birden altı kuyu plakaları (4-5 ml başına iyi) Bu hücre mikserler dağıtın.
- 25 ° C'de 90 dakika boyunca 1250 x g'de plakaları santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, 24 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücreleri birlikte havuz ve Ruxolitinib ve orta yumuşak agar içeren karıştırın ve si kaplamax kuyu plakalar. Her bir ilaç konsantrasyonu için, bir 50 ml tüp içinde Ruxolitinib uygun miktarı ile transduse BAF3 hücreleri (10-20.000.000 hücre) 10 ml karıştırın. RPMI% 20 serum içeren kullanarak 40 ml sesini olun. Altı yuvalı plakalar içinde mixcarefully, hücrelere% 1.2 agar ve 10 ml ilave edilir ve plaka.
- Iki hafta boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 0.2 ml pipet uçları ve alt-kültür onlara 3-4 gün için ayrı ayrı 24 kuyu plakalar kullanılarak dirençli koloniler seçin.
- Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile dirençli BAF3 hücreleri hasat edilir. Ticari bir genomik DNA izolasyon kiti kullanılarak genomik DNA izole edin. PCR genomik DNA kullanılarak primerler (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG ve mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) ve yüksek sadakat PCR sistemleri genişletmek uzun şablonun 100 ng tam uzunlukta JAK2 cDNA yükseltmek.
- Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın. JAK2 kodlama çerçeveyi temsil eden DNA bandı 3.4 kb tüketim ve DNA izoleticari bir jel ekstre etme kiti kullanılarak. Sıra 8 iç astar (P1 - P8) kullanılarak cDNA tam uzunlukta ticari yazılımı kullanarak kodlama dizisini kapsayan ve analiz dizileri.
Dayanıklı Mutasyonların 4. İn Vitro Doğrulama
Birçok hücre klonları, direnç fenotipinin her mutasyonun katkısını test etmek şablon olarak pMSCV-JAK2V-617F plasmidi kullanılarak yer yönelimli mutagenezle seçilen türevlerini oluşturmak için birden fazla mutasyonu taşır.
- Ticari bir mutajenez kiti ve nokta mutasyonları oluşturmak için tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak pMSCV-JAK2 V617F-plazmid üzerinde yer yönelimli mutagenez yapın. Dizileme ile mutant klonların kimliklerini teyit edin.
- Retrovirüsler ile BAF3 hücreleri nakletmek seçeneklerini 1 ug / ml puromisin ile takip mutant plazmitleri kullanılarak yapılan.
- Levha 10 4 BAF3-JAK2 V617F-hücreleri, 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna (% 10 FCS ile RPMI 50 ul). Ayrı37 ° C'de 60 saat boyunca plakaları (0, 1, 3, 5, 10 ve 20 uM son konsantrasyon) ve inkübe ly plaka üzerinde çukurlara ruxolitinib içeren ortamda 50 ul ekle.
- 2-4 saat boyunca 37 ° C'de her bir oyuğa inkübasyon ile takip için, WST-1 reaktifi 10 ul eklenmesi ile hücre canlılığı değerlendirmek. Bir plaka okuyucu kullanarak A450 Tutanak emme. Üç nüsha ve arsa tüm tahlilleri gerçekleştirin INCB018424 konsantrasyonları karşı absorbans ortalama. Bir doğrusal olmayan eğri uydurma algoritması kullanarak en uygun sigmoid eğri gerçekleştirin. Hücresel IC50 olarak% 50 hücre canlılığı ile sonuçlanan ilaç konsantrasyonunu puan.
- Daha sonra, ruxolitinib artan konsantrasyonlarda ve 37 ° C'de 4-6 saat süreyle inkübe edildi,% 10 serum ihtiva eden RPMI ortamı içinde altı yuvalı plakalar JAK2 varyantlarını eksprese eden plaka altı milyon BAF3 hücreleri.
- 4 ° C'de beş dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır. 20 mM Tris-CI içinde hücreler, bir kez PBS ile zaman ve lize yıkayın (pH 7,5), 50mM NaCI,% 1 NP-40,% 0.1 SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM sodyum florit, 2 mM sodyum vanadat ve% 5 Gliserol proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörleri ile takviye edilmiştir. 5x jel yükleme tamponu (bunu takiben 1 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon 350 mM Tris-HCI [pH 6.8], 500 mM DTT,% 15 SDS, 10 mM benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM sodyum vanadat Protease kokteyl, 50% gliserol, ve 5-10 dakika boyunca 70 ° C 'de% 0.001 Bromofenol Mavi) ve denatürasyon.
- Denatüre edici koşullar altında,% 8 SDS poliakrilamid jeli üzerinde proteinleri çözmek. Fare monoklonal anti-phopsho STAT5 ile immün yapın. Lekeleri Şerit ve tavşan poliklonal anti-SATA5 antikoru ile yeniden sondaj. Tedarikçinin tavsiyelerine göre ECL reaktifler kullanılarak bantları görselleştirmek.
Vivo Doğrulama 5.
- Lusiferazı ve kiraz ifade BAF3 hücreleri nakletmek (pMSCV-Luc-cher yapılan retrovirüslere ile transdükJAK2 V617F-dirençli varyantları ifade virüs Ry GH). JAK2 ve direnci varyantlarının sentezlenmesi için puromisin seçimi hayatta hücreleri seçin.
- Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla 6 Balb / C farelerine 200 ul PBS JAK2 V617F-ve dirençli varyantları taşıyan iki milyondan aktif olarak büyüyen BAF3-Luc / kiraz hücreleri enjekte edilir.
- Hücre nakli üç gün sonra, iki hafta boyunca, günde iki kez Ruxolitinib (100 mg / kg) ile farelere enjekte edilir.
- Bir görüntüleme sistemi ile lusiferaz tabanlı biyoışıldama görüntüleme yapın. .
- Kısaca, steril iyondan arındırılmış su, 300 mg 25 ml, daha küçük hacimlerde ve mağaza kısım çözülmesiyle lusiferin solüsyon hazırlanır.
Not: -80 ° C'de saklayın lusiferin ve kullanılana kadar ışıktan koruyunuz. - Her bir fare, 125 mg / kg, elde etmek için IP ve her bir farenin 250 ul enjekte edilir. Birlikte bir kapalı kutu inhale izofluran (% 1.5 -2.0%) kullanarak aynı gruptan fareler anestezi. Inci veteriner merhem sürüne göz kuruluğu önlemek için.
NOT: fareler için alınan zaman uyku (10-15 dk) zirveye luciferin aktivitesini izin. Varyasyonu önlemek için gruplar arasında tutarlı bir süre tutun.
- Kısaca, steril iyondan arındırılmış su, 300 mg 25 ml, daha küçük hacimlerde ve mağaza kısım çözülmesiyle lusiferin solüsyon hazırlanır.
- Görüntüleme odası aşamasına derhal fareler aktarın ve görüntüleme işlemleri sırasında 1.5-2% isofluorane de anestezi korumak. Sıralı 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60 ve 300 saniye maruz görüntü fareler. Görüntü yakalamak ve görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanılarak biyoışıldama yoğunluğunu ölçmek. Görüntüleme kendi kafesine geri dönmek fareler ardından.
- In vivo şimerizm hasat toplam Kemik iligi hücreleri için. Servikal dislokasyon ile takip 5 dakika için CO 2 ile fareler Euthanize. Kemikleri Hasat ve kemik iliği toplamak için soğuk PBS 4 ml ezmek. Floresan mikroskop altında yüzde kiraz pozitif hücreleri analiz ve FACS kullanarak ölçmek. Her örnekten yirmi bin olayları toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genetik mutasyonların ortaya çıkması hedeflenen anti-kinaz tedavisi için büyük sorun teşkil etmektedir. Mutasyon çalışmaları, seçimi ve yeni nesil ilaç geliştirme tasarım vesile olan mekanik ve fonksiyonel anlayışlar sağlamanın yanı sıra, aynı zamanda daha iyi klinik yönetimi sağlar ve gelecekte kişiselleştirilmiş tedavi için daha yararlı olabilir. Bu deneyde, JAK2 V617F-kinaz ruxolitinib direnç mutasyonları (Şekil 1) için tarama göstermektedir. Biz pMSCV-Kiraz-GW içine tam uzunlukta fare JAK2-V617FcDNA getirerek pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vektörü inşa. Bu nedeniyle dizisi eğilim ve daha büyük gen fragmanları ile ilgili sınırlamalar yükseltmek zor için PCR olan yöntemin en popüler seçenek üzerinde rastgele mutasyonların geliştirmek için bakteriyel host (E. coli XL-1 kırmızı suş) kullanılması önerilir . Rasgele mutajenize DNA kütüphanesi retrovirüs üretimi için HEK293T hücrelerine transfekte edildi. Bu mutant virkullanımları, 1 ya da 5 Ruxolitinib uM ya da IL-3 yokluğunda yumuşak agar içinde koloni büyüme için seçildi BAF3 hücreleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu koşullar altında, koloniler kinazın fonksiyonel ve dirençli bir varyantını ifade JAK2V-617F cDNA'ları taşıyan hücrelerin sadece ortaya çıkar. 10 Sonra - 14 gün, iyi ayrılmış tek tek koloniler boyutu değişiyordu ve sıvı kültüründe onları genişletilmiş, hangi aldı. Genomik DNA bu hücrelerden izole edilmiştir. Provirüs doğrudan kurtarma ile ya da PCR ile elde edilmiştir. geri kazanılan proviruses mutasyonlar (Şekil 1) belirlemek amacıyla diziye sokulmuştur. Sekans analizleri Lasergene ve DNASTAR paketi kullanılarak yapıldı.
Birçok hücre klonları birden fazla mutasyon gerçekleştirilir, çünkü kuvvetle, in vitro ve in vivo tahliller hem tek başına, bu mutasyonlar doğrulanması önerilir (Şekil 2 ve Şekil 3). Izolasyon varyantların aktivitesi doğrulamak için,site tarafından oluşturulan seçilen varyasyonları JAK2V-617F sekansının mutajenezini ilgilidir. Bu varyantlar, BaF3 hücreleri içine yeniden ve IC50 (IC50 değerleri, Şekil 2A) değerlendirmek için Ruxolitinib farklı dozajda hücre proliferasyonu kabiliyeti ölçülmüştür. Biyokimyasal deneyler, bir hedef dışı aracılı direnç (Şekil 2B) ekarte etmek Ruxolitinib artan dozları ile kuluçkalanmıştır BAF3 hücreleri, protein lizatlannda bağışıklık beneklenme analizi ile fosfotirosin veya fosfo-STAT5 için gerçekleştirilir. Yüksek Ruxolitinib konsantrasyonlarında geliştirilmiş IC50 değerlerini ve kalıcı otofosforilasyonunu sergileyen mutantlar, böylece ilaca dirençli varyantları olduğu teyit edilmiştir. Birçok dirençli mutasyonlar değişken doz tepki gösterir, çünkü bu nedenle bu mutasyonların yanı sıra in vivo direnç kazandıracaktır olup olmadığını test etmek zorunludur. Bunlar pahalıdır ve benzeri gibi Genellikle,, in vivo deneyler için sadece 2 -3 farklı değişkenleri test tavsiyezahmetli. In vivo direnç doğrulamak için, BAF3 hücreleri in vivo izlemeyi etkinleştirmek için JAK2-V617F varyantlarını ve Lusiferaz / kiraz ifade etmek geliştirilmişti. Fareler, iki hafta içinde Ruxolitinib enjeksiyonu takiben 1-2000000 kiraz pozitif hücreler (JAK2 varyantları ve lusiferaz sentezleyen) ile enjekte edilmiştir. İki hafta sonra, fareler, kiraz pozitif hücrelerin floresans (Şekil 3) ölçülerek kemik iligi ve periferik kanda BAF3 kimerizmin ayrıca lusiferaz katalizli biyolüminesans (Şekil 3) için görüntülenmiş ve edildi. Dirençli varyantları, böylece, JAK2 V617F-varyantını ifade eden BaF3 hücreleri, in vivo olarak Ruxolitinib tedaviye dirençli olduğunu düşündürmektedir, tedavi süresi boyunca biyolüminesans progresif artış gösterirken, JAK2 V617F-sentezleyen Fareler, Ruxolitinib duyarlıdır.
Şekil 2:. Bir şema doza bağımlı hücre çoğalma tahlilleri (A) ve batı lekeleme (B) kullanılarak in vitro doğrulama gösteren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. 
Şekil 3: in vivo doğrulama kullanarak lusiferaz şematik gösterimi biyoışıldama ölçümü katalize. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinik nüks ve hedef gen ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması: KML tedavisinde Imatinib klinik başarısı küçük molekül inhibitörleri ile rouge kinazlar hedef potansiyelini, ancak hedeflenen tedavinin de ortaya sınırlamaları sadece gösterdi. Direnç mutasyonlarının tanımlanması daha iyi klinik yönetimi ve gelecek nesil inhibitörlerinin gelişimine yardımcı olur. Bu protokol, hedeflenmiş genin ilaca dirençli mutasyonları tespit etmek için bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem E. inşa rastgele mutasyona uğratılmış plazmid kitaplığını kullanır E. coli, mutant proteinleri ifade etmek için. Kütüphane daha sonra BAF3 hücreleri (onkogen ile dönüşüme maruz) sokulur, kemoterapötik maddelerin varlığında hücre klonların seçilmesi ile izledi. Dayanıklı koloni hedeflenmiş genin dizilenmesi direnç kazandıran mutasyonlar tanımlar. Son olarak, site tarafından yeniden oluşturulur belirlenen mutasyonlar için onları doğrulamak için mutagenezini yönettiİlaç direnci.
Bu stratejiyi kullanarak sırasıyla, Ruxolitinib ve Imatinib direnç kazandıran JAK2'nın ve BCR / ABL mutasyon spektrumunu tanımlanır. Biz BCR / ABL fazla yüz mutasyon tespit. Ayrıca, hastaların algılanan tüm önemli mutasyonlar belirlenmesi, bizim tarama yöntemi bize içinde ve kinaz etki ötesinde, her iki kalıntılarının yeni değiştirmelerin belirlenmesi için izin verdi. İlginçtir, bizim ekran tüm mutasyonlar hasta örneklerinde tespit edilmiştir, ancak bu süreç böylece klinik sorunlu ilaç direnci teşkil edecektir mutasyonları tahmin Bu ekranın yeteneğini gösteren, neredeyse 10 yıldan fazla 15 aldı. Rastgele mutagenez kullanarak dirençli tarama diğer yöntemlere göre birçok avantaj sağlarken, potansiyel tuzaklar bir tarama prosedürü takip ederken farkında olmak vardır. Herhangi bir tarama için, kuvvetle hedef tamamen bağımlı olmak BAF3 hücreleri için tavsiye edilir, hangi resi karşıduruş aranır. Hedef gen üzerinde bir hata veya kısmi bağımlılık gerçek dirençli klonlar geliştirmek ve büyük olasılıkla yanlış pozitif geliştirmek olmayabilir. Örneğin, dört farklı çalışma JAK2 V617F-bağımlılığını 16-19 kolaylaştırmak için EPO veya MPL alıcıları ya ile transduse BAF3 hücreleri kullanılarak JAK2 inhibitörlerinin dayanıklı tarama gerçekleştirdik. Çok sayıda dirençli klonlar nedeniyle sitokin reseptörleri ile JAK1 ve JAK3'ün heterodimerizasyonu atfedilen yanlış pozitiflerin, ortaya çıkması muhtemelen, mutasyonlar yoksun olduğu gelişmiş olmasına rağmen etki kinaz sınırlı Sadece sekiz dirençli mutasyonlar, bu ekranlardan tespit edilmiştir. Bu nedenle, JAK2 bağımlılığı kaybını önlemek için direniflin mutasyonların varlığını gösterdi Ruxolitinib ve bu klonların her dayanıklı klonların sağlam noktası gösterdi düz BaF3 dirençli tarama gerçekleştirilmiştir. Bu gözlemlere dayanarak, dirençli mutasyonların tam spektrum koşum için, öneririz BaF3 hücreJAK2 inhibitörlerinin 16,17 karşı yapılan önceki dirençli gösterimleri bir norm olduğu gibi s, yanlış pozitif çıkmasını önlemek için hedeflenen kinaz tamamen bağımlı olmalıdır. Bu son derece birkaç ilaç dirençli varyantların klonal hakimiyeti yol açabileceği Ayrıca, farklı mutasyonlar barındıran hücreler bir araya toplanmış ve sıvı kültürde genişletmek için izin verilen dökme kültür koşulları bilmek önemlidir. Örneğin, dökme sıvı kültüründe mutagenezlenir BCR-ABL imatinib direnci için ilk seçim sırasında, ilk 100 biz dizilir izolatlarının içinde birden çok kez temsil edildi sadece 4 mutant formları bulundu. Bu nedenle, yumuşak agar kullanarak tarama toplu kültürü kullanılarak tespit olmaz tahsil edilecek ilaç direnci daha mütevazı derece yavaş büyüyen klonları izin verir. Bu nedenle, önceden sadece 14 saat 16 için seçime kütle kültürünün yetiştirilmesi için tavsiye edilir, yumuşak agar içinde IL3 olmayan ilaç seçimi takip etti. Bizim exViral iletimi yavaş büyüyen klonları kaybetmek riski (zayıf dönüştürücü) pozlar çok proliferatif klonlar, hakim olma eğilimindedir sonra Perience, 36 saat ötesinde kültürlerin büyüyor. Benzer şekilde, daha önceki zaman noktalarında hücreler kullanılarak viral transdüksiyon sonra 6-8 saat bu sayede direnç klonlarının kimlik ve sıklığı bir önyargı ve temsil neden yüksek dönüştürücü ya da aşın ifade eden klonların seçilmesi için eğilimli gibi. Bu nedenle, bireysel klonların sıkı seçim sağlar ve genellikle dökme sıvı kültürlerde gözlemlenen klonal hakimiyetini engelleyen tarama için 14-16 saat sonrası, viral transdüksiyon için yetiştirilen hücreler kullanmanızı öneririz.
Bazı klonlar çoklu mutasyonlar tespit edilmiştir, çünkü tek başına karşı direnç sağlamak için, bir aday mutasyon yeteneğini doğrulamak için gereklidir. JAK2 V617F-ekran için, yer yönelimli mutage kullanarak rastgele mutagenez kütüphanesinden tanımlanan mutasyonların bir kısmını yenidenNesis. Taze hücreler izole edilmiş mutantlar sokulması sonra, o zaman, her mutant için IC50 değerlerine belirlemek için, muhtelif ilâçların mevcudiyetinde büyütülmüştür. Biz ayrıca in vivo ilaç direncine neden bu tek mutasyon yeteneğini onaylamak için ışıldaması izleyerek in vivo direnç için iki farklı dirençli varyantları test.
Kliniklerde kinaz inhibitörlerinin bir dalgalanma galvanizli kanserlerin tedavisinde anti-kinaz tedavinin başarısını göz önüne alındığında, daha iyi hasta yönetimi ve onları hedef olabilir gelişmekte ilaçların mutasyonlar kazandıran klinik sorunlu direncini belirlemek için çok önemlidir. Bu tarama stratejisi başarılı BCR / ABL, JAK2 ve FLT3 20 içinde mutasyonları tespit etmek için kullanılmıştır; Ancak, anti-neoplastik maddeler, geniş bir aralık, genel olarak uygulanabilir olması inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
