Introduction
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的条目，以三聚体的病毒包膜糖蛋白（环境）介导的感染周期的第一步骤。是唯一外露的病毒抗原，在病毒粒子的表面呈现，将信封三聚体引发中和非中的抗体。因此，它表示用于疫苗的免疫原设计了一个有趣的候选者。然而，信封疫苗试验中的可溶性或重组的形式引起的反应，只有对最初级的HIV-1分离株1-3最小的有效性。尽管如此，部分疗效的HIV-1包膜的RV144疫苗试验4新的兴趣作为免疫原的候选观察。这是证实了最近的一项研究说明了疫苗引起的抗包膜抗体均足以产生一定程度的保护，防止SIV和HIV挑战5。
后所要合成的内质网中，包膜糖蛋白在前驱物的gp160，经历，这对于其对燃料的病毒融合过程能力的关键不同的翻译后修饰。被裂解成其特细胞质gp120和gp41的跨膜亚基6-10，与非共价相互作用维持的gp120-gp41的联系之前，信封前体必须正确和准倍三聚体。受感染的细胞机器还负责大量糖基化的包膜，其包含约50％的总质量为11,12。所得到的复合结构允许信封是构象柔性13,14，同时提供了被认为是允许信封，以适应和隐藏某些高度免疫原性表位，否则将暴露15-19亚稳态，突出的重要性，以更好地理解不同的构象由天然包膜三聚体取样。
迄今为止，一些技术已经开发并成功地用于研究包膜构象沟道安格斯。然而，他们在他们的局限性会发生变化，而通常被限制在特定的包膜上下文。例如，表面等离子体共振，或使用构象特异性单克隆抗体的免疫沉淀实验（单抗），依赖于任一的单体的水溶性或可溶的信封分子是已知的，从它们的三聚体形式的20,21 immunogenetically不同。最近的研究还表明，裂解影响导致主要抗原决定簇所认可非中抗体14,22,23曝光信封构象。
在这里，我们详细描述了一种方法，它允许快速和容易的决心cellularly表达信封三聚体18,24-26的构象。下列信封的人贴壁细胞系的瞬时转染包膜特异性抗体的结合使用了一个简单的化学发光反应进行检测。这种技术也可以用来表征的构象偏好构象依赖新生凹痕抗体。因此，这个实验提供了一个强大且高度灵活的检测方法。
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Protocol
1日1 - 细胞培养
- 板为2×10 4人骨肉瘤（HOS）在一个不透明的，96孔细胞培养适于发光读板，每孔的细胞。使用的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS）和100 U / ml的青霉素 - 链霉素。孵育直到第二天，在37℃，5％CO 2。
2，第2天 - 聚乙烯亚胺（PEI）转
- 根据后续步骤准备转染混合物。根据井是用相同的信封被转染的数量调节的试剂和DNA的量。
- 管答：加入10纳克达编码质粒（如PTAT-Ⅲ27）和150纳克ENV-质粒编码为5微升补充有25毫米肝素钠。
- 康达编码的质粒是用达依赖性包膜编码质粒如pSVIII时才是必需的。
- B管：加入450纳克PEI（从1微克/微升的溶液），以5微升DMEM中。
- 加入B管的内容到管A.充分混合，通过涡旋10秒，孵育转染混合物在室温（22℃）10分钟。
- 加10微升每96孔板的转染混合物中。孵育48小时，在37℃，5％CO 2。
3，第4天 - 酶联免疫吸附
- 执行所有的实验在室温下，以尽量减少包膜/抗体复合物可能的内吞作用。
- 制备250毫升每板清洗缓冲液被用于在同一时间。洗涤缓冲液为1x Tris缓冲盐水（TBS）pH为7.5（50毫摩尔Tris-CL，pH值7.5; 150mM的NaCl）中，补充有1毫米MgCl 2和1.8mM的氯化钙 。
- 通过加入1％脱脂奶粉和5mM的Tris pH值8.0至洗涤缓冲液制备125毫升每板封闭缓冲液。
- 从96孔板中除去细胞培养基和转染混合物（上清液）。
- 加入100μ，L封闭液，每孔孵育20分钟在室温中。
- 除去上清液，加入50微升每孔抗体（或血清）中，稀释至适当浓度的封闭液。通常情况下，使用1微克/毫升的浓度。孵育1小时，在室温下。
- 洗3次用100微升封闭液，然后重复洗涤过程3次用100微升洗涤缓冲液。
- 取出上清液，加入100μl封闭液，孵育5分钟在室温。
- 除去上清液，加入50微升二抗，在封闭缓冲液稀释1/3000。根据制造商的不同而变化的最佳抗体稀释。孵育40分钟，在室温。
- 洗3次用100微升封闭液，然后重复洗涤过程3次用100微升洗涤缓冲液。
4，数据采集
- 从板除去上清液，每孔加入30μl的1个增强的化学发光（ECL）的衬底。
- 获得化学1秒iluminescence信号/孔上，根据制造商的说明合适的平板阅读器。读取时间可根据硬件上的差异不同。
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Representative Results
使用上述的一般方法中，我们适应的协议，以测定在野生型（WT）或突变env可溶性CD4（SCD4）和共表达细胞的CD4上CD4i表位的暴露的影响，如前所述18,24， 25,28：图1示意性地表示的一般方法和CD4i表位的下列与SCD4或通过蜂窝CD4 18的共表达治疗的曝光。在图2中，我们使用SCD4诱导的暴露CD4i单抗17B和48D的表位重叠的共受体的结合位点24,29信封的构象变化，而 所述外结构域识别的mAb 2G12不会受到这种治疗预期18,24。
在信封的构象点突变的影响，也可以用此试验评估，如在图3中给出，在这里我们使用，也可以将第1层包膜突变H66A，已知具有降低ð倾向自发采样的CD4结合的构象18,24,30,31或突变（S375W），该预先处理信封的CD4结合状态32，并获得一致的结果（ 图3A）。在不同的包膜表达者使用的情况下，它通常是必要的，以归一化表示为根据表达水平的相对光单位（RLU）的原始数据。在这种情况下，我们使用PGT121的包膜糖屏蔽33-35的单克隆抗体识别的部分，作为归一化的抗体（ 图3B）。
正如我们最近描述18，信封和CD4在同一细胞相互作用导致ENV，揭露CD4i表位的构象变化。在图4中 ，我们共转染增加CD4细胞膨的量连同信封中的基于细胞的ELISA测定法和获得CD4i的mAb A32和C11 18,36-38，其识别不连续的表位中GP12的内域增加信号0，而信封识别的构象独立的2G12抗体并没有受到影响（ 图4A）。为了控制为条件之间的转染效率，原始数据进行归一化，以2G12（ 图4B）。获得A32增加了信号和C11抗体依赖ENV-CD4相互作用所没有的A32和C11调制所示，当信封被转染与CD4细胞突变（F43H）有能力的下降与信封39交互。
其中HOS细胞被转染以表达三聚体包膜在细胞表面的过程的抗ENV基于细胞的ELISA（A）的总方案的图1的示意图 。被膜构象可以然后通过使用识别特定的不同抗体进行采样构（如CD4i单抗）。信号是通过化学发光与HRP偶联的抗人单克隆抗体染色后进行检测。 SCD4（B）或细胞的CD4（C）的共表达可用于诱导导致CD4i表位的暴露包膜构象变化。
图2 SCD4诱导信封导致CD4i表位 SCD4用。相互作用的暴露构象改变的HIV-1的CO-JRFLΔCT信封增强识别通过靶向CD4i表位（图17B，48D）的抗体，而不是由gp120的外结构域识别抗体2G12。一种质粒编码HIV-1的CO-JRFLΔCT信封转染在各孔中，48小时后，将细胞在室温下洗涤和孵育在存在或不存在的4微克/毫升SCD4 30分钟续前与标准协议inuing（第4天 - ELISA）。被膜构象，然后通过用0.25微克/毫升2G12，1微克/毫升17B或48D抗ENV单克隆抗体孵育1小时，在室温下探测到。孵化与HRP偶联的抗人抗体在室温下45分钟后，通过化学发光法检测信号。显示的是平均RLU值的±从水井转不相关质粒获得了6个重复，信号SD（无信封）中减去。数据是代表在三个独立的实验得到的结果的，具有显着性通过两因素方差分析测试（纳秒，不显著; **** P <0.0001）。
图3调制信封构象。HIV-1的YU2ΔCT1层包膜突变体（H66A）减少CD4i 17B的认可，而S375W变种展览s提高17b的信号，并且是足以恢复的层1突变体的表型：（A）使用抗-ENV PGT121和17b的单克隆抗体获得的信号的RLU值。 （ 二）CD4i单抗17B以下的有或无SCD4治疗PGT121归一化的信号。显示的是平均值±从水井转不相关质粒获得了一式三份的信号标清（无信封）中减去。数据是代表在三个独立的实验得到的结果的，具有显着性通过两因素方差分析测试（**，P <0.01; ***，P <0.001; **** P <0.0001）。
图4的共表达细胞的CD4由CD4i抗体增强识别。甲CD4编码的质粒共转染HIV1 YU2ΔCT信封以便有利于的CD4结合构象18。 （A）使用抗-ENV 2G12，A32或C11单克隆抗体和抗CD4 OKT4单克隆抗体获得的信号的RLU值。 （B）CD4i的mAb A32和C11的2G12标准化信号。显示的是平均值±从水井转不相关质粒获得了一式三份的信号标清（无信封）中减去。数据代表三个独立实验中获得的结果。灰色条表示在没有的CD4，而越来越多的蓝色条表示的CD4数量的逐步增加膨转染（1.7毫微克，3.5毫微克，而7毫微克）和红条表示CD4细胞突变体转染（F43H 7 NG）与降低产能与gp120的互动。
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Discussion
该测定被优化以检测特异性单克隆抗体的相互作用与HIV-1三聚体包膜表达在细胞表面。一旦该协议已经建立，它可用于在中到高吞吐量和低的总材料成本和抗体的小的量。由于该测定是染为基础，它可以很容易地以研究它们对包膜构象效应适于胞内蛋白如CD4的共表达。
然而，该协议的转基也意味着，这是其最重要的缺陷之一。首先，抗原被研究这种技术是必需的，以提供在一个独立的表达载体中。因此，从各种临床来源的或原病毒构建体env基因需要被亚克隆到哺乳动物表达载体中。而全长前病毒构建体也可在此技术中使用（参见维耶特等人 18），这也意味着作为香港专业教育学院的病毒颗粒的生产，因此需要在适当的生物防护设施的工作。
此外，该技术的成功是密切与转染效率联系在一起的。得到的低信号往往是由于转染抗原的表达差。典型的问题来源是质粒DNA的质量，转染试剂。和细胞活力。如果需要的话，也可以使用其它技术，如流式细胞术或免疫印迹中进行的转染条件的优化。值得注意的是，它也是重要的是要注意，一些包膜构建体的表达可能是不理想的，因此，可能会影响到该技术的结果。
在这里，我们着重于探讨利用前面所述的CD4i单克隆抗体的HIV-1包膜构象。此设置允许各种分析，如探测的信封点突变或共表达的蛋白质的构象后果的影响。此外，该技术描述了他重也可与充分表征的信封的突变体具有不同的构象的倾向，为了探讨不同的mAbs用于各种包膜构象的特异性使用。这使得新分离的单克隆抗体，而不是需要高度专业化的设备或技术诀窍一种简单，快速的特性。
虽然我们只用这种方法对信封从不同的HIV-1的分支及其他近亲属谱系（HIV-2，SIV /苹果机）18，我们认为此法可以适用于更多表面抗原，如其他病毒家族的人。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢詹姆斯·罗宾逊博士的慷慨的A32，17B，48D的礼物，和C11单克隆抗体。 PGT 121通过美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目，艾滋病，NIAID，美国国立卫生研究院（目录号12343）中科获得。这项工作是由加拿大创新基金会项目负责人＃29866的支持，由CIHR的操作＃257792，由FRQS设立的青年科学家给予＃24639到自动对焦，并通过CRCHUM连续补助金以及由CIHR资助的催化剂＃126630房颤和MR。房颤是一种FRSQ Chercheur布西尔少年团契1＃24639的收件人。 MV由CIHR博士后研究奖＃291485支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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