Introduction
三量体ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Envの）によって媒介されるヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のエントリは、感染サイクルの第一段階である。ビリオンの表面に提示のみさらさウイルス抗原なので、Envの三量体は、中和および非中和抗体を誘発する。このように、ワクチンの免疫原の設計のための興味深い候補を表わす。しかし、可溶性または組換え形態におけるのEnvを用いたワクチン接種試験は最も主要なHIV-1に対する最小限の有効性応答を誘発し1-3を分離します。それにもかかわらず、RV144ワクチン臨床試験4で観察された部分的な有効性は、免疫原候補として、HIV-1のEnvに興味をリニューアルしました。これは、ワクチン誘発抗-ENV抗体はSIVとHIV 5挑戦に対する保護のある程度を生成するのに十分であったことを記述した最近の研究によって確証された。
小胞体内で合成された後、Envのglycoprote前駆体のgp160に、ウィルス融合プロセスを燃料する能力にとって重要なさまざまな翻訳後修飾を受ける。のEnv前駆体は、gp120-gp41の リエゾンを維持し非共有相互作用で、その細胞質外gp120およびgp41の 膜貫通サブユニット6-10に切断される前に、三量体で適切に関連付ける倍なければなりません。感染した細胞の機構も大きく、その総質量11,12の約50％を占めたEnvをグリコシル化する責任があります。良い異なるコンホメーションを理解することの重要性を強調し、Envのが適応し、それ以外の場合は15〜19を暴露される特定の高度に免疫原性エピトープを非表示にすることを可能にすると考えられている準安定性を提供しながら、得られた複合体構造は、Envのは13,14立体構造的に柔軟であることを可能にするネイティブのEnv三量体によってサンプリング。
今日までに、いくつかの技術が開発され、首尾よくEnvのコンホメーションchのを研究するために使用されているアンジェス。しかし、それらは多くの場合、特定のEnvコンテキストに限定されるものでは、その限界が異なります。例えば、表面プラズモン共鳴またはコンフォメーション特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降アッセイ（mAb）は、どちらかは、それらの三量体形態20,21からの免疫遺伝学的に異なることが知られている単量体の可溶性または可溶化のEnv分子に依存している。最近の研究ではまた、切断は主に抗体14,22,23を非中和により認識されるエピトープの露出をもたらしたEnvのコンフォメーションに影響を与えることを示唆している。
ここでは詳細にcellularly発現さのEnv三量体18,24-26のコンフォメーションの迅速かつ容易な決定を可能にする方法が記載されている。ヒトの付着性細胞株におけるのEnvの一過性トランスフェクション後のEnv特異的抗体の結合は、単純な化学発光反応を用いて検出される。この技術は、コンフォメーションdepenの立体配座優先性を特徴付けるために使用することができる凹み抗体。したがって、このアッセイは、堅牢で柔軟性の高い検出方法を提供する。
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Protocol
1 1日目 - 細胞培養
- プレート2×10 4ヒト骨肉腫（HOS）発光読み取りに適した不透明な96ウェル細胞培養プレート中のウェルあたりの細胞。 10％ウシ胎児血清（FBS）および100 U / mlペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用する。 37°C、5％CO 2で翌日までインキュベートする。
2 2日目 - ポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクション
- 以降の手順に従って、トランスフェクションミックスを調製する。同じのEnvでトランスフェクトされるべきである井戸の数に応じて試薬とDNAの量を調整します。
- チューブA：25mMのHEPESを補充したDMEMμlの5に10ngのTatのコード（例えばPTAT-III 27など）は、プラスミドと150ngのEnvのコードプラスミドを追加します。
- などpSVIIIなどのTat依存のEnvをコードするプラスミドを使用した場合のTat-コードプラスミドにのみ必要です。
- チューブB：1から（450 ngのPEIを追加5μlのDMEM中にμgの/μlの溶液）。
- 徹底的に10秒間ボルテックスチューブA.ミックスにチューブBの内容を追加し、トランスフェクション混合物を室温（22℃）で10分間インキュベートする。
- 96ウェルプレートのウェルあたりトランスフェクション混合物10μlを追加します。 37°C、5％CO 2で48時間インキュベートする。
3。4日目 - ELISA
- のEnv /抗体複合体の可能性エンドサイトーシスを最小限にするために、室温ですべての実験を行います。
- 同時に使用されているプレートあたりの洗浄バッファー250ミリリットルを用意してください。洗浄緩衝液は、1×トリス緩衝食塩水（TBS）pH7.5である（50 mMトリス-Clを、pH7.5の、150mMのNaCl）、1mMのMgCl 2および1.8mMのCaCl 2を補充した。
- 1％脱脂粉乳および洗浄緩衝液に5 mMトリスpH8.0のを追加することによって、プレートあたりブロッキングバッファー125ミリリットルを用意します。
- 96ウェルプレートから細胞培養培地およびトランスフェクション混合物（上清）を除去する。
- 100μの追加;ウェルあたりブロッキングバッファーし、室温で20分間インキュベートリットル。
- 上清を除去し、ブロッキング緩衝液で適当な濃度に希釈ウェル当たり抗体（または血清）を50μlを追加。一般的に、11μg/ mlの濃度を使用しています。室温で1時間インキュベートする。
- 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。
- 上清を除去し、ブロッキング緩衝液を100μlを追加し、室温で5分間インキュベートする。
- 上清を除去し、ブロッキング緩衝液中で1/3000に希釈した二次抗体を50μlを追加。メーカーの違いに応じた最適な抗体希釈を変更します。 RTで40分インキュベートします。
- 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。
4。データ収集
- プレートから上清を除去し、ウェル当たり30μlの1×高感度化学発光（ECL）基板を追加します。
- CHEMを取得1秒間iluminescence信号/ウェル上の製造者の指示に従って、適切なプレートリーダー。時間を読むことは、ハードウェアの違いにより異なる場合があります。
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Representative Results
上記した一般的手順を用いて、野生型（wt）又は変異EnvのいずれかでたCD4iエピトープの露出に対する可溶性CD4（sCD4を）と共発現細胞のCD4の影響をアッセイするためのプロトコルを適合18,24前述したように、 25,28。 図1は、一般的な手順とsCD4を持つまたは携帯CD4 18の共発現による治療後のたCD4iエピトープの露出を表しています。 図2では、私たちは18,24期待どおり外ドメインを認識するモノクローナル抗体2G12は、この処理によって影響を受けないのに対し、たCD4iモノクローナル抗体17b及びコレセプター結合部位24,29と重なる 48dがエピトープを露出させたEnv立体構造変化を誘導するためのsCD4を使用していました。
図3に示すように、Envのコンホメーションにおける点変異の影響もまた、このアッセイを用いて評価することができる。ここでは減少を有することが知られている層1のEnv突然変異H66A、のいずれかを使用自然発生的に、CD4に結合したコンホメーション18,24,30,31またはCD4結合状態32へのEnvを素因と一致した結果（ 図3A）を得られた変異（S375W）をサンプリングするためのd傾向。異なるのEnv発現体が使用される場合では、発現レベルに応じた相対光単位（RLU）として表した生データを正規化することがしばしば必要である。このケースでは、正規化抗体（ 図3B）のように、Envのグリカンシールド33〜35の一部を認識するモノクローナル抗体をPGT121を使用した。
私たちは、最近18に記載のように、同一セル内のEnvとCD4の相互作用たCD4iエピトープを露出させる立体構造変化をENVにつながる。 図4には、細胞ベースのELISAアッセイでのEnvと共にCD4を発現体の量を増加同時トランスフェクトし、GP12の内部ドメイン内の不連続なエピトープを認識したCD4iモノクローナル抗体A32及びC11 18,36-38、ための信号を増大得0、コンホメーションに依存しない2G12抗体によるEnvの認識は、（ 図4A）影響を受けなかったのに対し。条件間のトランスフェクション効率を制御するために、生データは、2G12（ 図4B）に対して正規化した。 EnvのはEnvの39と相互作用する能力の低下で、CD4変異体（F43H）で同時トランスフェクションされたときにA32の欠如とC11変調によって示されるように増加したA32のために得られる信号とC11抗体のEnv-CD4との相互作用に依存していた。
HOS細胞は、細胞表面で三量体のEnv発現するようにトランスフェクトされた手順の抗Envの細胞ベースのELISA。（A）一般的なスキームを図1に略図 。 Envのコンホメーションは、特定認識する異なる抗体を用いてサンプリングすることができる（そのようなモノクローナル抗体たCD4iなど）の立体配座。シグナルは、HRP結合抗ヒトmAbで染色した後、化学発光によって検出される。 sCD4の（B）または細胞性CD4（C）の共発現は、たCD4iエピトープの露出をもたらすEnvのコンホメーション変化を誘導することができる。
図2のsCD4はたCD4iエピトープの露出につながるのEnv立体構造変化を誘導する。HIV-1 CO-JRFLΔCTのEnvとのsCD4の相互作用がたCD4iエピトープ（17B、48D）を標的とする抗体による認識を向上しますが、ではないのgp120外ドメインを認識する抗体により2G12。 HIV-1 CO-JRFLΔCTのEnvをコードするプラスミドを各ウェルにトランスフェクトし、48時間後、細胞をつづき前にRTで30分間、4 / mlのsCD4の存在下または非存在下で洗浄し、インキュベートした。標準プロトコルでinuing（4日目 - ELISA）。 Envのコンホメーションは、その後、室温で1時間0.25 / mlの2G12、1μg/ mlの17bのまたは48dは抗-ENV mAbでインキュベートすることによりプローブした。信号は、RTで45分間HRP結合抗ヒト抗体とのインキュベーション後、化学発光により検出した。示さ無関係のプラスミド（なしのEnv）でトランスウェルから得られた信号との6回の反復の平均±SD RLU値が減算される。有意性は、二方向ANOVAによって試験して、データが、3つの独立した実験で得られた結果の代表である（ナノ秒、有意ではない; ***はp <0.0001）。
Envのコンホメーションの図3の変調。HIV-1 YU2ΔCTレイヤ1のEnv突然変異体（H66A）はS375W変異を呈するのに対したCD4i 17bの認識を減少させるsは17bの信号を増加し、層1変異体の表現型を回復するのに十分である。（A）抗EnvのPGT121、17bのmAbを使用して得られる信号のRLU値。 （B）またはsCD4をせずに処理した後のたCD4iのmAb 17bのPGT121正規化シグナル。も示されている無関係なプラスミド（なしのEnv）でトランスウェルから得られた信号との三連の平均±SD値が減算される。 （**はp <0.01、***はp <0.001; ***はp <0.0001）のデータは、双方向ANOVAによって試験した意義と、3つの独立した実験で得られた結果の代表である。
携帯CD4の図4。同時発現たCD4i抗体による認識を向上させます。CD4をコードするプラスミドを有利にするために、HIV1 YU2ΔCTのEnvで同時トランスフェクションしたCD4結合コンフォメーション18。 （A）抗Envの2G12、A32またはC11 mAbおよび抗CD4モノクローナルOKT4を使用して得られる信号のRLU値。 （B）たCD4iモノクローナル抗体A32とC11の2G12正規化シグナル。も示されている無関係なプラスミド（なしのEnv）でトランスウェルから得られた信号との三連の平均±SD値が減算される。データは3回の独立した実験で得られた結果の代表である。増加青いバーは、CD4の量の段階的な増加を示す発現体（1.7 ngの、3.5 ngの、そして7 NG）にトランスフェクトされていると赤いバーが（F43HをCD4変異体のトランスフェクションを示しているのに対し、グレーバーは、CD4のない状態で示しているのgp120と対話する能力の低下と、7 NG）。
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Discussion
このアッセイは、HIV-1 Envの三量体が細胞表面で発現を特異的mAbの相互作用を検出するために最適化される。プロトコルが確立されると、それは全体的に低い材料コストおよび抗体の少ない量で高いスループットを培地で使用することができる。このアッセイは、トランスフェクションに基づいているので、容易にEnvのコンホメーションに及ぼす影響を研究するために、CD4のような細胞タンパク質の同時発現に適合させることができる。
しかしながら、このプロトコルのトランスフェクションベースはまた、最も重要な落とし穴の一つであることを意味する。最初に、この技術を用いて研究されるべき抗原は、独立した発現ベクターで利用可能であることが要求される。このように、さまざまな臨床ソースまたはプロウイルス構築物からのEnv遺伝子は、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングされる必要がある。完全長のプロウイルス構築物（Veillette ら 18を参照）、この技術においても使用することができるが、これはまた、行為を意味アイブウイルス粒子の産生は、このように適切な生物学的封じ込め施設での作業が必要となる。
また、この技術の成功は、密接にトランスフェクション効率とリンクされる。得られた低信号は、多くの場合、トランスフェクトされた抗原の貧しい表現によるものである。問題の典型的な供給源は、プラスミドDNAの品質、トランスフェクション試薬である。そして細胞生存率。必要に応じて、トランスフェクション条件の最適化はまた、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロット法などの他の技術を用いて実施することができる。注目すべきは、それはいくつかのEnv構築物の発現は、次善の可能性があり、したがって、技術の結果に影響を与える可能性があることに注意しておくことも重要です。
ここでは、先に説明したCD4i mAbを使用して、HIV-1 Envのコンホメーションをプロービングに焦点を当てた。この設定は、Envポリ点突然変異または同時発現タンパク質のコンフォメーションの結果の効果をプローブとして分析の広い範囲を可能にする。さらに、技術が彼を記載再さまざまなEnvのコンホメーションのための異なるmAbの特異性を調べるために、異なるコンホメーションの傾向とよく特徴付けられたEnv突然変異体も使用することができる。これは高度に特化した設備やノウハウを必要としないながら、新たに単離されたmAbの簡単かつ迅速な特性評価を可能にします。
私たちが唯一の多様なHIV-1クレードおよびその他の近親系統（HIV-2、SIV / Mac用）18からのEnvに対してこのメソッドを使用しましたが、私たちは、このアッセイは、他のウイルスファミリーからのもののような追加の表面抗原のために適合させることができると信じています。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは彼の寛大なA32の贈り物、17bと、48D、およびC11 mAbの博士ジェームズ·ロビンソンに感謝します。 PGT 121は、NIH AIDS試薬プログラム、エイズ、NIAID、NIH（カタログ番号12343）の事業を通じて得られた。この作品は、科学者が、AFにしてCRCHUM連続グラントによってだけでなく、CIHR触媒グラント＃126630によって＃24639を付与ヤングのFRQS設立により、CIHRオペレーティング＃257792により、イノベーション拠点リーダーの＃29866のためのカナダ財団によってサポートされていましたAFとMRへ。 AFはFRSQ Chercheur Boursierジュニア1フェローシップ＃の24639の受信者である。 MVはCIHR博士研究賞の＃291485によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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