Introduction
Umana di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza (HIV-1) ingresso, mediato dalle trimeriche glicoproteine dell'involucro virale (ENV) è il primo passo del ciclo infettivo. Essendo l'unico antigene virale esposto presentato alla superficie di virioni, la Env trimero suscita anticorpi neutralizzanti e nonneutralizing. Come tale, esso rappresenta un candidato interessante per la progettazione del vaccino immunogeno. Tuttavia, le prove di vaccinazione con Env in forme solubili o ricombinanti hanno suscitato risposte solo con efficacia minima contro la maggior parte primaria da HIV-1 isolati 1-3. Tuttavia, l'efficacia parziale osservato nel trial vaccino RV144 4 rinnovato interesse per HIV-1 Env come candidato immunogeno. Questo è stato confermato da un recente studio che descrive che gli anticorpi vaccino-suscitato anti-Env sono stati sufficienti a generare un certo grado di protezione contro SIV e HIV sfide 5.
Dopo essere sintetizzati nel reticolo endoplasmatico, il glycoprote Envin precursori, gp160, subisce varie modificazioni post-traduzionali che sono fondamentali per la sua capacità di alimentare il processo di fusione virale. Il precursore Env deve piegare correttamente e associato in trimeri prima di essere spaccati nelle sue extra-citoplasmatici gp120 e gp41 subunità transmembrana 6-10, con interazioni non covalenti mantenendo il collegamento gp120-gp41. La macchina cellula infetta è anche responsabile pesantemente glicosilazione Env, che comprende circa il 50% della sua massa totale 11,12. La struttura complessa risultante permette Env di essere conformazione flessibile 13,14, mentre fornisce un metastabilità che è pensato per consentire Env di adattarsi e nascondere alcuni epitopi altamente immunogenico che altrimenti sarebbero esposti 15-19, sottolineando l'importanza di comprendere meglio le diverse conformazioni campionata dal Env trimero nativo.
Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche e con successo utilizzati per studiare Env ch conformazionaleanges. Tuttavia, essi variano nelle loro limitazioni, essendo spesso limitato a specifici contesti Env. Ad esempio, risonanza plasmonica di superficie o immunoprecipitazione con anticorpi monoclonali specifici di conformazione (MAK, MAB), si basano sia su monomeriche molecole solubili o solubilizzati Env che sono noti per essere immunogenetically diverso dal loro forme trimeriche 20,21. Recenti studi suggeriscono anche che la scissione colpisce conformazioni Env conseguente l'esposizione di epitopi principalmente riconosciuti da anticorpi nonneutralizing 14,22,23.
Qui si descrive in dettaglio un metodo che permette di determinare facile e veloce della conformazione del-cellularmente espresso Env trimeri 18,24-26. A seguito di trasfezione transiente di Env in una linea di cellule aderenti umano il legame di anticorpi specifici Env-viene rilevato utilizzando una semplice reazione di chemiluminescenza. Questa tecnica può anche essere utilizzato per caratterizzare la preferenza conformazionale di conformazione Depenanticorpi dent. Così, questo saggio fornisce un metodo di rilevazione robusta e altamente flessibile.
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Protocol
1 Giorno 1 - Colture Cellulari
- Piastra 2 x 10 4 osteosarcoma umano (HOS) cellule per pozzetto in una, 96 pozzetti coltura cellulare opaco adatto per la lettura luminescenza. Utilizzare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U / ml di penicillina-streptomicina. Incubare fino al giorno successivo a 37 ° C, 5% di CO 2.
2 Giorno 2 - polietilenimmina (PEI) Transfezione
- Preparare mix trasfezione in base alle fasi successive. Regolare reagenti e le quantità di DNA secondo il numero di pozzi che devono essere trasfettate con la stessa Env.
- Tubo A: Aggiungi 10 ng plasmide Tat-codifica (ad esempio PTAT-III, 27) e 150 ng Env-plasmide codificante per 5 microlitri DMEM supplementato con 25 HEPES mM.
- Il plasmide Tat-codifica è necessaria solo se si utilizza Tat-dipendente Env-plasmidi codificanti, come pSVIII.
- Tubo B: Aggiungere 450 ng PEI (da un 1mg / ml soluzione) a 5 microlitri DMEM.
- Aggiungere il contenuto di tubo B a tubo A. Mescolare accuratamente con il vortex per 10 secondi e incubare mix trasfezione 10 minuti a temperatura ambiente (22 ° C).
- Aggiungere 10 ml di miscela di trasfezione per pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 48 ore a 37 ° C, 5% di CO 2.
3 Giorno 4 - ELISA
- Eseguire tutti gli esperimenti a temperatura ambiente per ridurre al minimo possibile l'endocitosi di ENV / anticorpi complessi.
- Preparare 250 ml di tampone di lavaggio per piastra in uso allo stesso tempo. Lavaggio Buffer è 1x salina tamponata con Tris (TBS) pH 7.5 (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl), supplementato con 1 mM MgCl 2 e CaCl 1,8 mm 2.
- Preparare 125 ml di tampone di bloccaggio per piastra con l'aggiunta di latte in polvere scremato 1% e 5 mM Tris pH 8.0 a Washing Buffer.
- Rimuovere i supporti di coltura cellulare e mix trasfezione (surnatante) dalla piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 100 μ; L di tampone di bloccaggio per pozzetto e incubare 20 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 50 ml di anticorpi (o siero) per bene, diluito alla concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Tipicamente, utilizzare una concentrazione di 1 mg / ml. Incubare 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare 3x con 100 microlitri tampone di bloccaggio e quindi ripetere il lavaggio 3x processo con 100 microlitri di lavaggio tampone.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 100 microlitri tampone di bloccaggio, e incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 50 ml di anticorpo secondario, diluito 1/3000 in tampone di bloccaggio. Variare diluizione anticorpo ottimale in base alle differenze produttore. Incubare 40 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare 3x con 100 microlitri tampone di bloccaggio e quindi ripetere il lavaggio 3x processo con 100 microlitri di lavaggio tampone.
4 Acquisizione Dati
- Rimuovere il surnatante dal piatto e aggiungere 30 microlitri 1x chemiluminescenza (ECL) substrato per pozzetto.
- Acquisire chemsegnale iluminescence per 1 sec / bene su un piatto adatto-reader secondo le istruzioni del produttore. Tempo di lettura può variare in base alle differenze di hardware.
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Representative Results
Utilizzando la procedura generale di cui sopra, abbiamo adattato il protocollo per saggiare l'impatto dei CD4 solubile (sCD4) e CD4 cellulare coexpressed sull'esposizione di epitopi CD4i su entrambi wild-type (WT) o mutato Env, come descritto in precedenza 18,24, 25,28. figura 1 rappresenta schematicamente la procedura generale e l'esposizione di epitopi CD4i seguito di trattamento con sCD4 o da coexpression di CD4 cellulare 18. Nella figura 2, abbiamo usato sCD4 di indurre Env cambiamenti conformazionali che espongono CD4i anticorpi monoclonali 17b e 48 quinquies epitopi che si sovrappongono il sito di legame corecettore 24,29, mentre l'esterno-dominio riconoscere mAb 2G12 non è influenzata da questo trattamento come previsto 18,24.
L'impatto di mutazioni puntiformi in Env conformazione può essere valutata utilizzando questo test, come illustrato nella figura 3. Qui abbiamo utilizzato sia il layer 1 Env H66A mutante, conosciuto per avere una diminuzioned propensione per assaggiare spontaneamente il CD4-bound conformazione 18,24,30,31 o un mutante (S375W) che predispone Env allo stato CD4-bound 32 e ha ottenuto risultati concordanti (Figura 3a). Nei casi in cui vengono utilizzati diversi expressors Env, è spesso necessario per normalizzare i dati grezzi espressi come unità di luce relativa (RLU) secondo livelli di espressione. In questo caso, abbiamo utilizzato PGT121, una parte mAb riconoscimento dello scudo glicani Env 33-35, come l'anticorpo normalizzante (Figura 3B).
Come abbiamo recentemente descritto 18, interazione tra Env e CD4 nella stessa cella porta a ENV cambiamenti conformazionali che espongono epitopi CD4i. Nella Figura 4, si cotransfected quantità crescenti di un expressor CD4 insieme con Env in ELISA saggio basato su cellule e ottenuto aumentando i segnali per CD4i mAbs A32 e C11 18,36-38, che riconoscono epitopi discontinui nel dominio interiore della GP120, mentre Env riconoscimento da parte di anticorpi conformazionale indipendente 2G12 non è stata influenzata (Figura 4A). Al fine di controllare l'efficienza di trasfezione tra le condizioni, i dati grezzi è stata normalizzata a 2G12 (Figura 4B). Aumento segnali ottenuti per A32 e C11 anticorpi dipendevano interazione Env-CD4 come indicato dall'assenza di A32 e modulazione C11 quando Env è stato co-trasfettate con un mutante CD4 (F43H) con diminuzione della capacità di interagire con Env 39.
Figura 1 Rappresentazione schematica del anti-Env a base di cellule-ELISA. (A) Schema generale della procedura in cui le cellule HOS sono trasfettate per esprimere trimeric Env sulla superficie cellulare. Env conformazione può essere prelevata utilizzando diversi anticorpi che riconoscono specificheconformazioni (come CD4i mAb). I segnali vengono rilevati da chemiluminescenza dopo colorazione con anticorpi monoclonali anti-umani HRP-coniugato. sCD4 (B) o coexpression di cellulare CD4 (C) può essere utilizzato per indurre Env cambiamenti conformazionali che portano l'esposizione di epitopi CD4i.
Figura 2 sCD4 Env induce cambiamenti conformazionali che portano all'esposizione di CD4i epitopi. Interazione di sCD4 con HIV-1 CO-JRFL ΔCT Env migliora il riconoscimento da parte di anticorpi rivolti epitopi CD4i (17b, 48d), ma non con l'anticorpo che riconosce esterno-dominio gp120 2G12. Un plasmide codificante HIV-1 CO-JRFLΔCT Env è stato transfettato in ciascun pozzetto e 48 ore dopo le cellule sono state lavate e incubate in presenza o assenza di 4 mg / ml sCD4 per 30 minuti a temperatura ambiente prima di continuing con il protocollo standard (Giorno 4 - ELISA). Env conformazione è stata poi sondato incubando con 0,25 mg / ml 2G12, 1 mg / ml o 17b 48d anti-Env anticorpi monoclonali per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali sono stati rilevati da chemiluminescenza dopo incubazione con un anticorpo anti-umano HRP-coniugato per 45 minuti a temperatura ambiente. Vengono mostrati i valori medi RLU ± SD di sei repliche con segnale ottenuti da pozzi trasfettate con un plasmide irrilevante (senza Env) sottratto. Dati rappresentativa risultati ottenuti in tre esperimenti indipendenti, con significato testato da ANOVA a due vie (ns, non significativo, ****, p <0,0001).
Figura 3 Modulazione di Env conformazione. HIV-1 yu2 ΔCT strato 1 Env mutante (H66A) diminuisce CD4i riconoscimento 17b, mentre la variante mostra S375Ws aumentato 17b segnale ed è sufficiente a ripristinare il fenotipo del mutante strato 1. (A) valori RLU dei segnali ottenuti utilizzando anticorpi anti-Env PGT121 e 17b mAb. (B) segnali PGT121-normalizzati di CD4i mAb 17b a seguito di trattamento con o senza sCD4. Vengono mostrati i valori medi ± SD di triplicato con segnale ottenuti da pozzi trasfettate con un plasmide irrilevante (senza Env) sottratto. Dati rappresentativa dei risultati ottenuti in tre esperimenti indipendenti, con significatività testato da ANOVA a due vie (** p <0.01; ***, p <0.001; ****, p <0,0001).
Figura 4 Coexpression di CD4 cellulare migliora il riconoscimento da parte di anticorpi CD4i. Un plasmide CD4-codifica è stato co-trasfettate con HIV1 yu2 ΔCT Env per favorirela conformazione CD4-bound 18. (A) i valori RLU dei segnali ottenuti utilizzando anticorpi anti-Env 2G12, A32 e C11 anticorpi monoclonali e l'anti-CD4 OkT4 mAb. (B) segnali 2G12-normalizzati di CD4i mAbs A32 e C11. Vengono mostrati i valori medi ± SD di triplicato con segnale ottenuti da pozzi trasfettate con un plasmide irrilevante (senza Env) sottratto. Dati rappresentativa dei risultati ottenuti in tre esperimenti indipendenti. Barra grigia indica in assenza di CD4, considerando che la crescente barra blu indica un aumento graduale della quantità di CD4 expressor essere trasfettate (1,7 ng, 3,5 ng, e 7 ng) e barra rossa indica la trasfezione di un mutante CD4 (F43H , 7 ng) con ridotta capacità di interagire con gp120.
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Discussion
Questo test è ottimizzato per rilevare l'interazione di anticorpi monoclonali specifici da HIV-1 trimeric Env espresso sulla superficie cellulare. Una volta che il protocollo è stato stabilito, può essere utilizzato a medio-elevate produzioni con bassi costi di materiale complessivi e piccole quantità di anticorpi. Dal momento che questo saggio è basato trasfezione-, può essere facilmente adattato per coexpression delle proteine cellulari, come CD4 al fine di studiare i loro effetti sulla Env conformazione.
Tuttavia, la base trasfezione di questo protocollo implica anche che si tratta di uno dei suoi più importanti insidie. Prima di tutto, gli antigeni da studiare con questa tecnica sono tenuti a essere disponibile in un vettore di espressione indipendente. Come tale, i geni env ottenuti da varie fonti clinici o costrutti provirali dovrebbero essere subclonato in vettori di espressione di mammifero. Mentre integrali costrutti provirale possono anche essere utilizzati in questa tecnica (vedi Veillette et al. 18), questo implica anche attoive produzione di particelle virali richiedendo così il lavoro in adeguate strutture di biocontenimento.
Inoltre, il successo di questa tecnica è intimamente connessa con l'efficienza di trasfezione. Low segnali ottenuti sono spesso dovuti alla scarsa espressione di antigeni trasfettate. Tipiche fonti di problemi sono la qualità del DNA plasmidico, Reagenti di transfezione. e le cellule della redditività. Se necessario, l'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione potrebbe anche essere eseguita utilizzando altre tecniche, come la citometria a flusso o western blotting. Di nota, è anche importante essere consapevoli che espressione di alcuni costrutti Env potrebbe essere ottimale e potrebbe quindi influenzare il risultato della tecnica.
Qui ci siamo concentrati al sondaggio HIV-1 Env conformazione utilizzando descritto in precedenza CD4i anticorpi monoclonali. Questa impostazione consente una vasta gamma di analisi come sondare l'effetto di mutazioni puntiformi Env o le conseguenze conformazionali di proteine coespressi. Inoltre, la tecnica descritta hare può essere utilizzato anche con ben caratterizzati mutanti Env con diversa propensione conformazionale, al fine di sondare la specificità dei diversi anticorpi monoclonali per varie conformazioni Env. Questo permette una caratterizzazione semplice e rapida di anticorpi monoclonali recentemente isolati pur non richiedendo attrezzature altamente specializzati o di know-how.
Anche se abbiamo usato questo metodo solo contro Env da vari gruppi HIV-1 e di altri stretti lignaggi relativi (HIV-2, SIV / Mac) 18, riteniamo che questo test potrebbe essere adattato per gli antigeni di superficie aggiuntivi, come ad esempio quelli di altre famiglie di virus.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. James Robinson per il suo generoso dono della A32, 17b, 48d, e C11 anticorpi monoclonali. PGT 121 è stato ottenuto attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Questo lavoro è stato sostenuto da una Fondazione canadese per l'innovazione programma Leader # 29866, da un esercizio CIHR # 257792, da un FRQS Istituzione di Young Scientist concede # 24639 di AF e da un finanziamento continuo CRCHUM nonché da un CIHR sovvenzione catalizzatore # 126630 AF e MR. AF è il destinatario di un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 borsa di studio # 24639. MV è stato sostenuto da un CIHR Dottorato Research Award # 291485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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