Introduction
Humano do tipo 1 do vírus da imunodeficiência (HIV-1) de entrada, mediada pelas glicoproteínas do envelope viral triméricos (Env), é a primeira etapa do ciclo infeccioso. Sendo o único antigénio viral exposto apresentado na superfície de viriões, o trímero de Env elicia anticorpos neutralizantes e não neutralizantes. Como tal, ele representa um candidato interessante para o design imunogénio de vacina. No entanto, ensaios de vacinação com Env em formas solúveis ou recombinante induziu respostas com apenas uma eficácia mínima contra mais primário de HIV-1 isolados de 1-3. No entanto, a eficácia parcial observada no teste de vacina RV144 4 renovado interesse em HIV-1 Env como candidato imunógeno. Esse fato foi corroborado por um estudo recente descreve que os anticorpos anti-Env provocada por vacina foram suficientes para gerar um certo grau de proteção contra SIV e HIV desafia 5.
Depois de ser sintetizada no retículo endoplasmático, o glycoprote Envno precursor, a gp160, sofre várias modificações pós-traducionais que são críticos para a sua capacidade para alimentar o processo de fusão viral. O precursor Env deve dobrar corretamente e associado em trímeros antes de ser clivada em seus gp120 e gp41 transmembrana extra-citoplasmática subunidades 6-10, com interações não covalentes mantendo a ligação gp120-gp41. A maquinaria da célula infectada, também é fortemente responsável pela glicosilação de Env, compreendendo cerca de 50% da sua massa total de 11,12. A estrutura complexa resultante permite Env ser conformação flexível 13,14, enquanto fornece uma metaestabilidade que é pensado para permitir Env para se adaptar e se esconder certos epítopos altamente imunogênica que seriam expostos 15-19, destacando a importância de compreender melhor as diferentes conformações amostrados pelo trimer Env nativa.
Até à data, são conhecidos vários métodos têm sido desenvolvidos e utilizados com sucesso para estudar Env ch conformacionalanges. No entanto, eles variam em suas limitações, sendo, muitas vezes restrita a contextos específicos Env. Por exemplo, a ressonância de plasmon de superfície ou ensaios de imunoprecipitação, utilizando anticorpos monoclonais específicos de conformação (mAbs), dependem quer em moléculas solúveis ou solubilizadas monoméricos de Env que são conhecidos por serem imunogeneticamente diferente das suas formas triméricas 20,21. Estudos recentes também sugerem que a clivagem afecta as conformações de Env que resultam na exposição de epitopos reconhecidos, principalmente, pelos anticorpos não neutralizantes 14,22,23.
Aqui vamos descrever em detalhes um método que permite a determinação rápida e fácil de conformação de expressa-celularmente Env tr�eros 18,24-26. Após a transfecção transiente de Env numa linha celular humana aderente a ligação de anticorpos específicos de Env é detectado utilizando uma simples reacção de quimioluminescência. Esta técnica também pode ser usada para caracterizar a preferência conformacional de conformação-depenanticorpos Dent. Assim, este ensaio proporciona um método de detecção robusta e altamente flexível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Dia 1 - Cultura de Células
- Placa de 2 x 10 4 osteossarcoma humano (HOS) células por poço de uma, placa de 96 poços de cultura de células opaco adequado para leitura de luminescência. Use de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Incubar até ao dia seguinte a 37 ° C, 5% de CO 2.
2 Dia 2 - polietilenimina (PEI) transfecção
- Preparar a mistura de transfecção de acordo com os passos subsequentes. Ajustar reagentes e quantidades de DNA de acordo com o número de poços a serem transfectadas com o mesmo Env.
- O tubo A: Adiciona-se 10 ng de plasmídeo que codifica Tat (tais como PTAT III-27) e 150 ng de plasmídeo que codifica Env-5 ul de DMEM suplementado com HEPES 25 mM.
- O plasmídeo Tat-codificação só é necessária quando se utiliza plasmídeos Tat-dependente ENV-codificam como pSVIII.
- Tubo B: Adicionar 450 ng PEI (a partir de um 1ug / solução ul) a 5 mL de DMEM.
- Adicionar o conteúdo do tubo B do tubo A. Misturar completamente em vortex durante 10 seg e incubar mistura de transfecção de 10 min à temperatura ambiente (22 ° C).
- Adicionar 10 ml da mistura de transfecção por poço da placa de 96 poços. Incubar durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
3 Dia 4 - ELISA
- Realizar todos os experimentos à temperatura ambiente para minimizar possível endocitose de env / anticorpos complexos.
- Preparar 250 ml de tampão de lavagem por cada placa ser utilizados ao mesmo tempo. Tampão de Lavagem é solução salina 1x com Tris (TBS) pH 7.5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; NaCl 150 mM), suplementado com 1 mM de MgCl 2 e 1,8 mM de CaCl 2.
- Prepare 125 ml de tampão de bloqueio por placa, adicionando leite em pó desnatado 1% e 5 mM Tris pH 8,0 e tampão de lavagem.
- Remover o meio de cultura de células e mistura de transfecção (sobrenadante) a partir de placa de 96 poços.
- Adicionam-se 100 μ; L de tampão de bloqueio por po e incubar 20 min a RT.
- Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo (ou soro) por poço, diluiu-se a concentração apropriada em tampão de bloqueio. Tipicamente, utilizar uma concentração de 1 ug / ml. Incubar 1 hora à temperatura ambiente.
- Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem.
- Remover o sobrenadante, adiciona-se 100 ul tampão de bloqueio, e incuba-se 5 minutos à TA.
- Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo secundário, diluídos 1/3000 em tampão de bloqueio. Varie diluição do anticorpo ideal de acordo com as diferenças fabricante. Incubar 40 min a RT.
- Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem.
4 Aquisição de Dados
- Remover o sobrenadante a partir da placa e adicionar 30 ul de 1x quimioluminescência aumentada (ECL) de substrato por poço.
- Adquirir chemiluminescence sinal por 1 segundo / po num leitor de placas apropriado de acordo com as instruções do fabricante. O tempo de leitura pode variar de acordo com as diferenças de hardware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando o procedimento geral descrito acima, nós adaptamos o protocolo para ensaiar os efeitos de CD4 solúvel (sCD4) e CD4 celular co-expresso na exposição de epitopos de cada CD4i de tipo selvagem (wt) ou mutadas Env, como descrito anteriormente, 18,24, 25,28. Figura 1 representa esquematicamente o procedimento geral e a exposição de epítopos CD4i após o tratamento com sCD4 ou por co-expressão de CD4 celular 18. Na Figura 2, o sCD4 foi utilizado para induzir mudanças conformacionais de Env que expõem CD4i Acm 17b e 48d epitopos que se sobrepõem ao local de ligação co-receptor 24,29, enquanto que o exterior do domínio que reconhece o Acm 2G12 não é afectado por este tratamento, como esperado, 18,24.
O impacto das mutações pontuais no Env conformação também podem ser avaliados por este ensaio, tal como apresentado na Figura 3. Aqui utilizou-se uma camada de Env mutante H66A, conhecido por ter uma diminuiçãod propensão para provar espontaneamente a conformação ligado a CD4 ou um mutante 18,24,30,31 (S375W) que predispõe Env para o estado ligado a CD4 e 32 obtiveram resultados concordantes (Figura 3A). Nos casos em que são utilizadas diferentes expressores env, muitas vezes é necessário para normalizar os dados brutos, expressos em unidades relativas de luz (RLU), de acordo com os níveis de expressão. Neste caso, utilizou-se PGT121, um mAb que reconhece parte do escudo de glicano Env 33-35, como o anticorpo de normalização (Figura 3B).
Como já descrito recentemente 18, a interação de Env e CD4 na mesma célula leva a ENV mudanças conformacionais que expõem epítopos CD4i. Na Figura 4, que co-transfectado quantidades crescentes de um expressor de CD4 em conjunto com Env no ensaio ELISA baseado em células e obtido aumentando os sinais para CD4i mAbs A32 e C11 18,36-38, que reconhecem epítopos descontínuos no interior do domínio de GP120, enquanto que o reconhecimento pelo anticorpo de Env conformacional independente 2G12 não foi afectada (Figura 4A). De modo a controlar a eficiência da transfecção de entre as condições, os dados em bruto foram normalizados para 2G12 (Figura 4B). Aumento dos sinais obtidos por A32 e C11 anticorpos dependiam interacção Env-CD4, como indicado pela ausência de A32 e C11 modulação Env quando foi co-transfectadas com um mutante de CD4 (F43H) com a diminuição da capacidade de interagir com Env 39.
Figura 1 Representação esquemática do anti-Env ELISA baseado em células. (A) Esquema geral do procedimento em que as células são transf HOS para expressar trimeric Env na superfície da célula. Env conformação podem ser recolhidos por meio de diferentes anticorpos que reconhecem específicaconformações (tais como CD4i mAbs). Os sinais são detectados por quimioluminescência, após coloração com mAbs anti-humano conjugado com HRP. sCD4 (B) ou a co-expressão de CD4 celular (C) pode ser usada para induzir mudanças conformacionais de Env que levam a exposição de epítopos CD4i.
Figura 2. sCD4 Env induz alterações conformacionais que conduzem a exposição de epítopos CD4i. Interaction de sCD4 com HIV-1 CO-JRFL ΔCT Env aumenta o reconhecimento por anticorpos dirigidos contra epitopos CD4i (17b, 48d), mas não pelo anticorpo que reconhece o domínio externo gp120 2G12. Um plasmídeo que codifica para o HIV-1 CO-JRFLΔCT Env foi transfectada em cada poço e 48 horas mais tarde, as células foram lavadas e incubadas na presença ou na ausência de 4 ug / ml de sCD4 durante 30 min à temperatura ambiente antes continuing com o protocolo padrão (Dia 4 - ELISA). Env conformação foi então sondada por incubação com 0,25 ug / ml de 2G12, 1 ug / ml ou 17b 48d anti-Env mAbs durante 1 hora à temperatura ambiente. Os sinais foram detectados por quimioluminescência, após incubação com um anticorpo anti-humano conjugado com HRP durante 45 minutos à temperatura ambiente. São mostrados os valores médios ± DP RLU de seis repetições de sinal obtidas a partir de poços transfectadas com um plasmídeo irrelevante (não Env) subtraído. Os dados são representativos dos resultados obtidos em três experimentos independentes, com significância testado por ANOVA de duas vias (ns, não significativo; ****, p <0,0001).
Figura 3 Modulação da Env conformação. HIV-1 yu2 ΔCT camada de um mutante Env (H66A) diminui reconhecimento 17b CD4i enquanto a variante exposição S375Ws aumento do sinal 17b e é suficiente para restabelecer o fenótipo da camada 1 mutante. (A) os valores dos sinais de RLU obtidos utilizando anti-Env PGT121 e 17b mAbs. (B) sinais PGT121 normalizada de CD4i mAb 17b após o tratamento, com ou sem sGD4. São mostrados os valores médios ± desvio padrão de triplicados com sinais obtidos a partir dos poços transfectadas com um plasmídeo irrelevante (não Env) subtraído. Os dados são representativos dos resultados obtidos em três experiências independentes, com significância testado por ANOVA de duas vias (**, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001).
Figura 4 A co-expressão de CD4 celular aumenta o reconhecimento por anticorpos CD4i. Se um plasmídeo que codifica CD4 foi co-transfectado com HIV1 yu2 ΔCT Env de forma a favorecera conformação ligada a CD4 18. (A) os valores de RLU dos sinais obtidos com anti-Env 2G12, A32 ou C11 mAbs e anti-CD4 OKT4 mAb. (B) Os sinais de 2G12-normalizadas de CD4i mAbs A32 e C11. São mostrados os valores médios ± desvio padrão de triplicados com sinais obtidos a partir dos poços transfectadas com um plasmídeo irrelevante (não Env) subtraído. Os dados são representativos dos resultados obtidos em três experiências independentes. Barra a cinzento indica na ausência de células T CD4, ao passo que o aumento da barra azul indica um aumento passo a passo na quantidade de CD4 expressor ser transfectadas (1,7 ng, 3,5 ng, e 7 ng) e barra vermelha indica a transfecção de um mutante CD4 (F43H , 7 ng) com a diminuição da capacidade de interagir com gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este ensaio foi optimizado para detectar a interacção de mAbs específicos com HIV-1 trimérico Env expressa na superfície da célula. Uma vez que o protocolo foi estabelecida, ela pode ser utilizada na forma de altas taxas de transferência, com baixos custos materiais globais e pequenas quantidades de anticorpos. Uma vez que este ensaio é à base de transfecção, que pode facilmente ser adaptada para a co-expressão de proteínas celulares, tais como CD4, a fim de estudar os seus efeitos na conformação Env.
No entanto, a base do presente protocolo de transfecção também implica que é uma das suas mais importantes armadilhas. Primeiro, os antígenos a serem estudados com esta técnica são necessários para estar disponível em um vetor de expressão independente. Como tal, os genes Env a partir de várias fontes clínicas ou construções provirais teriam de ser subclonados em vectores de expressão de mamíferos. Enquanto todo o comprimento construções provirais também pode ser utilizado nesta técnica (ver Veillette et ai. 18), o que implica também atoprodução de partículas virais ive exigindo, portanto, o trabalho em instalações biocontainment apropriadas.
Além disso, o sucesso desta técnica está intimamente ligada com a eficiência de transfecção. Baixa sinais obtidos são muitas vezes devido à falta de expressão de antígenos transfectadas. As fontes típicas de problemas são de qualidade do ADN do plasmídeo, os reagentes de transfecção. e viabilidade das células. Se necessário, a optimização das condições de transfecção também pode ser realizado utilizando outras técnicas, tais como citometria de fluxo ou mancha Western. De notar, também é importante estar ciente de que a expressão de algumas construções Env poderia ser abaixo do ideal e, portanto, pode afetar o resultado da técnica.
Aqui nós nos concentramos em sondagem HIV-1 Env conformação usando descrito anteriormente CD4i mAbs. Esta configuração permite uma ampla gama de análises, como investigar o efeito de mutações pontuais Env ou as conseqüências de conformação das proteínas co-expressas. Além disso, a técnica descrita eleRe também pode ser utilizado com os mutantes de Env bem caracterizadas com propensão conformacional diferente, a fim de investigar a especificidade dos diferentes mAbs para várias conformações de Env. Isto permite uma caracterização fácil e rápida de mAbs recentemente isoladas sem exigir equipamentos altamente especializados ou know-how.
Embora nós só usamos este método contra Env de vários subtipos de HIV-1 e outras linhagens parente próximo (HIV-2, SIV / Mac) 18, acreditamos que este ensaio pode ser adaptado para antígenos de superfície adicionais, como os de outras famílias de vírus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. James Robinson, pelo seu dom generoso da A32, 17b, 48d, e C11 mAbs. PGT 121 foi obtido por meio do Programa de reagentes NIH AIDS, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabalho foi financiado pela Fundação Canadense para a Inovação Líder de Programa # 29866, por uma operação CIHR # 257792, por um FRQS Estabelecimento de Jovem Cientista conceder # 24639 para AF e por um subsídio contínuo CRCHUM, bem como por um CIHR concessão catalisador # 126630 a AF e MR. AF é o destinatário de uma FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 comunhão # 24639. MV foi apoiado por um Prêmio de Pesquisa de Doutorado CIHR # 291485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
