Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

Published: September 14, 2014 doi: 10.3791/51995
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1, 1, 1
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Introduction

فيروس نقص المناعة البشري نوع 1 (HIV-1) الدخول، بوساطة بروتينات سكرية مثلوثي المغلف الفيروسية (بيئية) هو الخطوة الأولى للدورة المعدية. كونها مستضد الفيروسية تتعرض الوحيد المقدم على سطح virions وبيئية مثلوث يتسبب تحييد الأجسام المضادة وnonneutralizing. على هذا النحو، فإنه يمثل المرشح المثير للتصميم مستمنع اللقاح. ومع ذلك، مع تجارب التطعيم بيئية في أشكال قابلة للذوبان أو المؤتلف أثارت ردود فعالية مع الحد الأدنى فقط مقابل معظم الأساسي HIV-1 يعزل 1-3. ومع ذلك، لاحظ فعالية جزئية في تجدد الاهتمام RV144 محاكمة لقاح 4 في HIV-1 بيئية كمرشح مستمنع. وقد أيد ذلك عن طريق دراسة حديثة أن تصف-أثار اللقاح الأجسام المضادة المناهضة للبيئية كافية لتوليد درجة معينة من الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية والتحديات SIV 5.

بعد أن تم توليفها في الشبكة الإندوبلازمية، وglycoprote بيئيةفي السلائف، gp160، يخضع لمختلف التعديلات بعد متعدية التي تعتبر بالغة الأهمية لقدرته على تغذية عملية الانصهار الفيروسية. مقدمة بيئية يجب طيها بشكل صحيح والزميلة في أرتب قبل المشقوق إلى خارج هيولي gp120 و gp41 عبر الغشاء مفارز لها 6-10، مع التفاعلات noncovalent الحفاظ على اتصال gp120 gp41-. آلية الخلية المصابة مسؤولة أيضا عن glycosylating بيئية مشددة، تضم نحو 50٪ من إجمالي كتلتها 11،12. بنية معقدة الناتجة يسمح بيئية ليكون مرنا conformationally 13،14، مع توفير metastability التي يعتقد بيئية للسماح للتكيف وإخفاء بعض الحواتم المناعية للغاية التي لولاها أن تتعرض 15-19، وتسليط الضوء على أهمية فهم أفضل للالتشكل مختلفة عينات بيئية من قبل مثلوث الأصلي.

حتى الآن، وقد تم تطوير العديد من التقنيات وبنجاح تستخدم لدراسة بيئية الفصل بتكوينفي نفس الفئة. ومع ذلك، فإنها تختلف في حدودها، التي غالبا ما تقتصر على سياقات بيئية محددة. على سبيل المثال، الرنين مأكل السطح أو فحوصات مناعي التشكل باستخدام الاجسام المضادة المحددة (MABS)، تعتمد إما على جزيئات أحادى بيئية قابلة للذوبان أو تذوب التي هي معروفة لتكون مختلفة immunogenetically من أشكال مثلوثي على 20،21. تشير الدراسات الحديثة أيضا أن الانقسام يؤثر على التشكل بيئية مما أدى إلى تعرض الحواتم معترف بها أساسا nonneutralizing الأجسام المضادة 14،22،23.

نحن هنا تصف بالتفصيل طريقة تسمح لتحديد سريع وسهل من التشكل من-أعرب cellularly بيئية أرتب 18،24-26. بعد ترنسفكأيشن عابر بيئية في خط خلية ملتصقة البشري الربط الأجسام المضادة بيئية محددة يتم الكشف باستخدام رد فعل لمعان كيميائي بسيط. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لوصف تفضيل متعلق بتكوين جزئي من التشكل depen-الأجسام المضادة دنت. وهكذا، وهذا الفحص يوفر طريقة قوية ومرنة للغاية الكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. يوم 1 - خلية ثقافة

  1. لوحة 2 × 10 4 عظمية البشري (ملتحقا) خلايا لكل بئر في مبهمة، 96-جيدا لوحة خلية ثقافة مناسبة للقراءة التلألؤ. استخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلين، الستربتومايسين. احتضان حتى اليوم التالي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

2. يوم 2 - Polyethylenimine (PEI) ترنسفكأيشن

  1. إعداد مزيج ترنسفكأيشن وفقا لخطوات لاحقة. ضبط كميات الكواشف والحمض النووي وفقا لعدد من الآبار التي سيتم transfected مع نفس بيئية.
  2. أنبوب A: إضافة 10 نانوغرام تات ترميز البلازميد (مثل PTAT-III 27) و 150 نانوغرام بيئية ترميز البلازميد إلى 5 ميكرولتر DMEM تستكمل مع 25 ملي HEPES.
  3. مطلوب البلازميد تات ترميز فقط عند استخدام تات التي تعتمد بيئية ترميز البلازميدات مثل pSVIII.
  4. أنبوب B: إضافة 450 نانوغرام PEI (من 1ميكروغرام / حل ميكرولتر) إلى 5 ميكرولتر DMEM.
  5. إضافة محتوى أنبوب إلى أنبوب A. B ميكس بدقة قبل vortexing لمدة 10 ثانية واحتضان مزيج ترنسفكأيشن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
  6. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن لكل بئر من 96 لوحة جيدا. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. يوم 4 - ELISA

  1. أداء جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة لتقليل الإلتقام ممكن من المجمعات بيئية / الأجسام المضادة.
  2. إعداد 250 مل من غسل العازلة في لوحة تستخدم في نفس الوقت. غسل العازلة غير المالحة 1X تريس مخزنة (TBS) ودرجة الحموضة 7.5 (50 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم)، على أن تستكمل مع 1 ملم MgCl 2 و 1.8 مم CaCl 2.
  3. إعداد 125 مل من حجب العازلة في لوحة بإضافة 1٪ غير دهن الحليب الجاف و 5 ملي تريس 8.0 درجة الحموضة لغسل العازلة.
  4. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية ومزيج ترنسفكأيشن (طاف) من لوحة 96 جيدا.
  5. إضافة 100 μ؛ ل من حجب العازلة لكل بئر واحتضان 20 دقيقة في RT.
  6. إزالة طاف وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة (أو مصل) لكل بئر، المخفف إلى التركيز المناسب في عرقلة العازلة. عادة، استخدام تركيز 1 ميكروغرام / مل. احتضان 1 ساعة على RT.
  7. غسل 3X مع 100 ميكرولتر عرقلة العازلة ومن ثم تكرار عملية غسل 3X مع 100 ميكرولتر غسل العازلة.
  8. إزالة طاف، إضافة 100 ميكرولتر حجب العازلة، واحتضان 5 دقائق على RT.
  9. إزالة طاف وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية، المخفف 1/3000 في عرقلة العازلة. تختلف الأجسام المضادة الأمثل وفقا لتخفيف الخلافات المصنعة. احتضان 40 دقيقة في RT.
  10. غسل 3X مع 100 ميكرولتر عرقلة العازلة ومن ثم تكرار عملية غسل 3X مع 100 ميكرولتر غسل العازلة.

4. الحصول على البيانات

  1. إزالة طاف من لوحة وإضافة 30 ميكرولتر 1X تعزيز لمعان كيميائي (ECL) الركيزة لكل بئر.
  2. اكتساب الكيميائيإشارة iluminescence ل1 ثانية / جيد على لوحة مناسبة للقارئ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وقت القراءة قد تختلف وفقا للاختلافات الأجهزة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام الإجراء العام المذكورة أعلاه، فإننا تكييفها بروتوكول لفحص تأثير ذوبان CD4 (sCD4) وcoexpressed CD4 الخلوي على تعرض الحواتم CD4i على أي البرية من نوع (WT) تحور أو بيئية، كما هو موضح سابقا 18،24، 25،28 الشكل 1 يمثل تخطيطي الإجراء العام وتعرض الحواتم CD4i بعد العلاج مع sCD4 أو coexpression من CD4 الخلوي 18. في الشكل 2، كنا sCD4 للحث بيئية التغييرات متعلق بتكوين التي تعرض CD4i MABS 17B 48d الحواتم والتي تتداخل في موقع ملزم coreceptor 24،29، في حين لا يتأثر المجال الخارجي الاعتراف ماب 2G12 بواسطة هذا العلاج كما هو متوقع 18،24.

كما يمكن تقييم أثر الطفرات نقطة في التشكل بيئية باستخدام هذا الاختبار، كما وردت في الشكل 3. هنا كنا إما طبقة 1 بيئية H66A متحولة، والمعروف أن انخفاضد الميل إلى عينة عفويا محددة CD4 التشكل 18،24،30،31 أو متحولة (S375W) الذي يهيئ لبيئية محددة CD4 الدولة 32 والحصول على نتائج متطابقة (الشكل 3A). في الحالات التي تستخدم expressors بيئية مختلفة، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتطبيع البيانات الخام أعرب وحدات الخفيفة النسبية (RLU) وفقا لمستويات التعبير. في هذه الحالة، كنا PGT121، وهو ماب الاعتراف جزء من الدرع بيئية غليكان 33-35، حيث أن الأجسام المضادة تطبيع (الشكل 3B).

ونحن مؤخرا وصفت 18، تفاعل بيئية وCD4 في نفس الخلية يؤدي إلى تغييرات متعلق بتكوين الحياة الفطرية التي تعرض الحواتم CD4i. في الشكل 4، ونحن cotransfected كميات متزايدة من expressor CD4 مع بيئية في خلية القاعدة ELISA مقايسة وحصلت زيادة إشارات لCD4i MABS A32 و C11 18،36-38، التي تعترف الحواتم المتقطعة في المجال الداخلي للgp120، في حين الاعتراف بيئية من قبل الأجسام المضادة 2G12 بتكوين مستقل لم يتأثر (الشكل 4A). من أجل السيطرة على كفاءة ترنسفكأيشن بين الظروف، وتطبيع البيانات الخام إلى 2G12 (الشكل 4B). زيادة الإشارات التي تم الحصول عليها لA32 والأجسام المضادة C11 تعتمد على التفاعل بيئية-CD4 كما يدل على ذلك عدم وجود وA32 C11 تعديل عندما cotransfected بيئية مع متحولة CD4 (F43H) مع انخفاض القدرة على التفاعل مع بيئية 39.

الشكل 1
الرقم 1. تمثيل تخطيطي لمكافحة بيئية خلية القاعدة ELISA. (A) مخطط عام للإجراءات التي و transfected الخلايا ملتحقا للتعبير عن مثلوثي بيئية على سطح الخلية. ويمكن بعد ذلك الحياة الفطرية التشكل أخذ عينات باستخدام الأجسام المضادة المختلفة الاعتراف محددةالتشكل (مثل CD4i MABS). تم الكشف عن إشارات من معان كيميائي بعد تلطيخ مع MABS مكافحة الإنسان HRP مترافق. sCD4 (B) أو coexpression الخلوية CD4 (C) يمكن أن تستخدم للحث على التغييرات متعلق بتكوين بيئية تؤدي إلى تعرض الحواتم CD4i.

الشكل 2
الشكل 2. sCD4 يدفع بيئية التغييرات متعلق بتكوين مما يؤدي إلى تعرض الحواتم CD4i. sCD4 تفاعل مع HIV-1-CO JRFL ΔCT بيئية يعزز الاعتراف من قبل الأجسام المضادة التي تستهدف الحواتم CD4i (17B، 48d)، ولكن ليس من قبل gp120 الأجسام المضادة الاعتراف المجال الخارجي 2G12. تم transfected البلازميد ترميز HIV-1-CO JRFLΔCT بيئية في كل بئر و 48 ساعة في وقت لاحق تم غسلها الخلايا وحضنت في وجود أو غياب 4 ميكروغرام / مل sCD4 لمدة 30 دقيقة في RT قبل تابعinuing مع بروتوكول قياسي (اليوم 4 - ELISA). ثم تم بحثها الحياة الفطرية التشكل التي يحتضنها مع 0.25 ميكروغرام / مل 2G12، 1 ميكروغرام / مل أو 17B 48d مكافحة بيئية MABS لمدة 1 ساعة على RT. تم الكشف عن إشارات من معان كيميائي بعد الحضانة مع الأضداد المضادة للبشرية HRP-مترافق لمدة 45 دقيقة في RT. أظهرت هي القيم RLU يعني ± SD من ستة مكررات مع إشارة تم الحصول عليها من الآبار transfected مع البلازميد غير ذي صلة (أي بيئية) تطرح. البيانات هو ممثل النتائج التي تم الحصول عليها في ثلاث تجارب مستقلة، مع أهمية اختبارها من قبل في اتجاهين ANOVA (نانوثانية، وليس كبيرا، ****، ف <0.0001).

الرقم 3
الرقم 3. تعديل بيئية من التشكل. HIV-1 طبقة 1 YU2 ΔCT بيئية متحولة (H66A) يقلل CD4i الاعتراف 17B في حين أن البديل المعرض S375Wق زيادة 17B إشارة وغير كافية لاستعادة النمط الظاهري متحولة من طبقة 1. (A) القيم RLU من الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام مضادات بيئية PGT121 و17B MABS. (B) إشارات PGT121 تطبيع من CD4i ماب 17B بعد العلاج مع أو بدون sCD4. أظهرت هي القيم يعني ± SD من يثلث مع إشارة تم الحصول عليها من الآبار transfected مع البلازميد غير ذي صلة (أي بيئية) تطرح. البيانات هو ممثل النتائج التي تم الحصول عليها في ثلاث تجارب مستقلة، مع أهمية اختبارها من قبل اتجاهين ANOVA (**، ف <0.01. ***، ع <0.001، ****، ف <0.0001).

الرقم 4
الرقم 4. Coexpression من CD4 الخلوي يعزز الاعتراف من قبل الأجسام المضادة CD4i. تم cotransfected البلازميد CD4 ترميز مع HIV1 YU2 ΔCT بيئية من أجل صالحومحددة CD4 التشكل 18. (A) القيم RLU من الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام مضادات بيئية 2G12، أو A32 C11 MABS ومكافحة CD4 OkT4 ماب. (B) إشارات 2G12-تطبيع من CD4i MABS A32 و C11. أظهرت هي القيم يعني ± SD من يثلث مع إشارة تم الحصول عليها من الآبار transfected مع البلازميد غير ذي صلة (أي بيئية) تطرح. البيانات هو ممثل النتائج التي تم الحصول عليها في ثلاث تجارب مستقلة. يشير شريط رمادي في غياب CD4، في حين يشير الشريط الأزرق زيادة زيادة تدريجية في كمية CD4 expressor يجري transfected (1.7 نانوغرام، 3.5 نانوغرام، و 7 نانوغرام) ويشير شريط أحمر ترنسفكأيشن من المسخ CD4 (F43H 7 نانوغرام) مع تناقص قدرة على التفاعل مع gp120.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تحسين هذا الاختبار للكشف عن تفاعل MABS محددة مع HIV-1 أعرب مثلوثي بيئية على سطح الخلية. مرة واحدة تم تأسيس البروتوكول، فإنه يمكن استخدامها في المديين المتوسط ​​والانتاجية العالية مع انخفاض تكاليف المواد العامة وكميات صغيرة من الأجسام المضادة. لأن هذا الاختبار هو القائم على ترنسفكأيشن، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف لcoexpression من البروتينات الخلوية مثل CD4 لدراسة آثارها على التشكل بيئية.

ومع ذلك، فإن قاعدة ترنسفكأيشن هذا البروتوكول يعني أيضا أنه هو واحد من أهم المزالق لها. أولا، مستضدات لدراستها مع هذه التقنية المطلوبة لتكون متاحة في ناقلات التعبير مستقل. على هذا النحو، سوف تحتاج الجينات بيئية من مختلف المصادر السريرية أو يبني proviral أن subcloned في ناقلات التعبير الثدييات. في حين كامل طول يبني proviral يمكن أيضا أن تستخدم في هذه التقنية (انظر Veillette آخرون 18)، وهذا يعني أيضا الفعلوبالتالي إيف إنتاج جزيئات فيروسية تتطلب العمل في مرافق الاحتواء البيولوجي المناسبة.

وعلاوة على ذلك، نجاح هذه التقنية يرتبط ارتباطا وثيقا مع كفاءة ترنسفكأيشن. إشارات المنخفضة التي تم الحصول عليها وغالبا ما تكون نتيجة لسوء التعبير عن مستضدات transfected. مصادر نموذجية من المشاكل جودة DNA البلازميد والكواشف ترنسفكأيشن. والخلايا الحيوية. إذا لزم الأمر، وتحسين ظروف ترنسفكأيشن ويمكن أيضا أن يؤديها باستخدام تقنيات أخرى، مثل التدفق الخلوي أو النشاف الغربي. من المذكرة، من المهم أيضا أن ندرك أن التعبير عن بعض ثوابت بيئية يمكن أن تكون دون المستوى الأمثل، وبالتالي يمكن أن تؤثر نتائج هذه التقنية ل.

نحن هنا تركز على التحقيق HIV-1 بيئية التشكل باستخدام الموصوفة سابقا CD4i MABS. يسمح هذا الإعداد لمجموعة واسعة من التحليل مثل سبر تأثير بيئية الطفرات نقطة أو العواقب بتكوين جزئي للبروتينات coexpressed. وعلاوة على ذلك، وصفت هذه التقنية أنهإعادة يمكن أن تستخدم أيضا مع المسوخ بيئية، تتميز كذلك مع مختلف الميل متعلق بتكوين جزئي من أجل تحقيق خصوصية MABS مختلفة لمختلف التشكل بيئية. هذا يسمح للتوصيف سهل وسريع من MABS معزولة حديثا بينما لا تتطلب معدات متخصصة للغاية أو الدراية.

على الرغم من أننا تستخدم هذه الطريقة فقط ضد بيئية من مختلف HIV-1 بالمنظومة والأنساب النسبية وثيقة أخرى (HIV-2، SIV / ماك) 18، نعتقد يمكن تكييف هذا الاختبار لمستضدات سطح إضافية، مثل تلك التي من الأسر الفيروس أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور جيمس روبنسون لله هدية سخية من A32، 17B، 48d، و C11 MABS. تم الحصول على 121 PGT من خلال برنامج الكاشف NIH الإيدز، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة (القط # 12343). وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كندا للإبداع الزعيم برنامج # 29866، من قبل التشغيل CIHR # 257792، من قبل مؤسسة FRQS من شباب العلماء منح # 24639 لAF وبمنحة متصلة CRCHUM وكذلك من قبل CIHR المنحة حافزا # 126630 لAF وMR. AF هو المستفيد من FRSQ Chercheur Boursier جديد 1 الزمالة # 24639. وأيد MV من قبل جائزة بحوث الدكتوراه CIHR # 291485.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HOS cells ATCC CRL-1543
White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom BD 353296
Polyethylenimine, linear, 25,000 MW Polysciences 23966 Prepared in 1 mg/ml solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11995
Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated Pierce 31413
Enhanced Chemiluminescence Substrate PerkinElmer NEL105001EA
TriStar LB 941, Plate Reader Berthold Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Tags

الأمراض المعدية، العدد 91، HIV-1، بروتينات سكرية المغلف، gp120، gp41، تحييد الأجسام المضادة، والأجسام المضادة غير تحييد، ELISA CD4، استنادا الخلية
تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veillette, M., Coutu, M., Richard,… More

Veillette, M., Coutu, M., Richard, J., Batraville, L. A., Désormeaux, A., Roger, M., Finzi, A. Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay. J. Vis. Exp. (91), e51995, doi:10.3791/51995 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter