Introduction
Human immundefekt virus type 1 (HIV-1) indrejse, medieret af de trimere virale kappeglycoproteiner (ENV) er det første skridt i den infektiøse cyklus. Som den eneste udsatte viralt antigen, der præsenteres på overfladen af virioner Env trimeren fremkalder neutraliserende og ikke-neutraliserende antistoffer. Som sådan, det repræsenterer en interessant kandidat til vaccine immunogen design. Men vaccination forsøg med Env i opløselige eller rekombinante former fremkaldte reaktioner med kun minimal effektivitet mod de fleste primært HIV-1-isolater 1-3. Ikke desto mindre, delvis effekt observeret i RV144 vaccineforsøg 4 fornyet interesse for HIV-1 Env som et immunogen kandidat. Dette blev bekræftet af en nylig undersøgelse, der beskriver, at vaccine-fremkaldte anti-Env antistoffer var tilstrækkelig til at frembringe en vis grad af beskyttelse mod SIV og hiv udfordringer 5.
Efter at være blevet syntetiseret i det endoplasmatiske reticulum, Env glycoprotei forstadiet, gp160, gennemgår forskellige post-translationelle modifikationer, der er kritiske for sin evne til at sætte gang virale fusionsprocessen. Env-forstadium skal folde korrekt og associeret i trimerer før blive spaltet i sine ekstra cytoplasmiske gp120 og transmembrane gp41 underenheder 6-10, med ikke-kovalente interaktioner opretholde gp120-gp41-kontakt. Den inficerede celle maskiner er også ansvarlig for kraftigt glycosylere Env, der omfatter omkring 50% af dens samlede masse 11,12. Det resulterende kompleks struktur giver mulighed Env at være konformationelt fleksible 13,14, men samtidig give en metastability, som menes at tillade Env at tilpasse og skjule bestemte højimmunogene epitoper, som ellers ville blive udsat 15-19, fremhæve betydningen for bedre at forstå de forskellige konformationer samplet af den indfødte Env trimeren.
Til dato har adskillige teknikker blevet udviklet og med succes anvendt til at undersøge Env konformationel lmanges. Men de varierer i deres begrænsninger, idet der ofte er begrænset til bestemte Env sammenhænge. For eksempel overfladeplasmonresonans eller immunopræcipitationsanalyser hjælp kropsbygning specifikke monoklonale antistoffer (mAb'er), er afhængige enten monomere opløselige eller solubiliserede Env molekyler, som vides at være immunogenetically forskellige fra deres trimere former 20,21. Nylige undersøgelser tyder også på, at spaltning påvirker Env konformationer resulterer i eksponering af epitoper primært genkendes af neutraliserende antistoffer 14,22,23.
Her beskriver vi i detaljer en metode, der giver mulighed for hurtig og let bestemmelse af konformationen af cellulært udtrykt Env trimerer 18,24-26. Efter transient transfektion Env i en human adhærerende cellelinje bindingen af Env-specifikke antistoffer påvises ved anvendelse af en simpel kemiluminescens reaktion. Denne teknik kan også anvendes til at karakterisere den konformationelle præference konformationsbegrænsende DEPENdent antistoffer. Således dette assay giver en robust og meget fleksibel påvisningsmetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dag 1 - Cellekultur
- Plade 2 x 10 4 humane osteosarkom (HOS) celler per brønd i en uigennemsigtig 96-brønds cellekultur plade egnet til luminescens læsning. Brug Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin-streptomycin. Inkuber indtil næste dag ved 37 ° C, 5% CO2.
2. Dag 2 - Polyethylenimine (PEI) Transfection
- Forbered Transfektionsblandingen ifølge efterfølgende trin. Juster reagenser og DNA-mængder i forhold til antallet af brønde, der skal transficeres med samme konvolut.
- Rør A: Tilsæt 10 ng Tat-kodning plasmid (såsom PTAT-III 27) og 150 ng Env-kodning plasmid til 5 pi DMEM suppleret med 25 mM HEPES.
- Tat-kodning plasmid kræves kun, når du bruger Tat-afhængige Env plasmider såsom pSVIII.
- Rør B: Læg 450 ng PEI (fra en 1pg / pl opløsning) til 5 pi DMEM.
- Tilføj indhold af rør B til rør A. Bland grundigt ved hvirvelbehandling i 10 sek og inkuberes Transfektionsblandingen 10 minutter ved stuetemperatur (22 ° C).
- Der tilsættes 10 ul af transfektion blanding pr brønd i 96-brønds plade. Der inkuberes i 48 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
3. Dag 4 - ELISA
- Udfør alle eksperimenter ved stuetemperatur for at minimere eventuel endocytose af Env / antistoffer komplekser.
- Forbered 250 ml vaskepuffer pr plade der anvendes samtidig. Vaskepuffer er 1x Tris-bufret saltvand (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCI) suppleret med 1 mM MgCl2 og 1,8 mM CaCl2.
- Forbered 125 ml blokerende buffer pr plade ved at tilsætte 1% fedtfri tørmælk og 5 mM Tris pH 8,0 til vaskepuffer.
- Fjern celledyrkningsmedier og transfektion mix (supernatant) fra 96-brønds plade.
- Tilsæt 100 μ; L blokeringsbuffer per brønd og inkuberes 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 50 ul antistof (eller serum) pr godt fortyndet til passende koncentration i blokeringsbuffer. Typisk anvendes en koncentration på 1 mg / ml. Inkuber 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 3x med 100 ul blokerende buffer, og derefter gentage vaskeprocessen 3x med 100 ul vaskebuffer.
- Fjern supernatanten, tilsættes 100 ul Blokeringsbuffer, og der inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsættes 50 ul sekundært antistof, fortyndet 1/3000 i blokerende buffer. Vary optimale fortynding af antistof i henhold til producentens forskelle. Inkuber 40 min ved stuetemperatur.
- Vask 3x med 100 ul blokerende buffer, og derefter gentage vaskeprocessen 3x med 100 ul vaskebuffer.
4. Data Acquisition
- Fjern supernatanten fra pladen, og der tilsættes 30 pi 1x forøget kemiluminescens (ECL) substrat per brønd.
- Anskaf chemiluminescence signal til 1 sek / brønd på en egnet pladelæser overensstemmelse med producentens anvisninger. Læsning tid kan variere alt efter hardware forskelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af den generelle fremgangsmåde beskrevet ovenfor, vi tilpasset protokol til at analysere virkningen af opløseligt CD4 (sCD4) og co-udtrykkes cellulære CD4 på eksponering CD4i epitoper på enten vildtype (wt) eller muteret Env, som beskrevet tidligere 18,24, Figur 25,28. 1 skematisk viser den generelle procedure, og eksponeringen af CD4i epitoper efter behandling med sCD4 eller ved coekspression af cellulær CD4 18. I figur 2, brugte vi sCD4 at fremkalde Env konformationsændringer der udsætter CD4i mAbs 17b og 48d epitoper, som overlapper coreceptor bindingssted 24,29, mens den ydre-domænet anerkende mAb 2G12 ikke berøres af denne behandling som forventet 18,24.
Virkningen af punktmutationer i Env konformation kan også vurderes ved hjælp af dette assay, som beskrevet i figur 3. Her anvendes enten laget 1 Env mutanten H66A, kendt for at have en nedgangd tilbøjelighed til spontant prøve CD4-bundne konformation 18,24,30,31 eller en mutant (S375W), der disponerer Env til CD4-bundne tilstand 32 og opnåede overensstemmende resultater (figur 3A). I tilfælde, hvor der anvendes forskellige Env ekspressorer, er det ofte nødvendigt at normalisere de rå data udtrykt som relative lysenheder (RLU) i henhold til ekspressionsniveauer. I dette tilfælde har vi brugt PGT121, et mAb anerkender del af Env glycan skjold 33-35, som normaliserende antistof (figur 3B).
Som vi beskrev for nyligt 18, interaktion mellem Env og CD4 i den samme celle fører til ENV konformationsændringer der udsætter CD4i epitoper. I figur 4 vi cotransficeret stigende mængder af en CD4 ekspressor sammen med Env i den celle-baserede ELISA-assay og opnået stigende signaler CD4i mAbs A32 og C11 18,36-38, som genkender diskontinuerlige epitoper i den indre domæne af GP120, mens Env anerkendelse i konformationelle uafhængige 2G12 antistof ikke blev påvirket (figur 4A). For at styre for transfektionseffektivitet mellem betingelser blev rådata normaliseret til 2G12 (figur 4B). Øgede signaler opnået for A32 og C11-antistoffer afhang Env-CD4-interaktion som indikeret ved fravær af A32 og C11 graduering når Env blev cotransficeret med en CD4-mutant (F43H) med nedsat evne til at interagere med Env 39.
Figur 1. Skematisk fremstilling af anti-Env celle-baserede ELISA. (A) opbygningen af den procedure, hvor Hos celler transficeret til at udtrykke trimeriske Env på celleoverfladen. Env kropsbygning kan derefter tages prøver ved hjælp af forskellige antistoffer, der genkender specifikkekonformationer (såsom CD4i mAb'er). Signaler detekteres ved kemiluminescens efter farvning med HRP-konjugeret anti-humane mAb'er. sCD4 (B) eller coekspression af cellulær CD4 (C) kan anvendes til at inducere Env konformationelle ændringer, der fører til eksponering af CD4i epitoper.
Figur 2. sCD4 inducerer Env konformationsændringer fører til eksponering af CD4i epitoper. Interaktion af sCD4 med HIV-1 CO-JRFL ACt Env forbedrer genkendelse af antistoffer rettet CD4i epitoper (17b, 48d), men ikke af gp120 ydre domæne anerkende antistof 2G12. Et plasmid, der koder for HIV-1-CO-JRFLΔCT Env blev transficeret i hver brønd, og 48 timer senere blev cellerne vasket og inkuberet i nærvær eller fravær af 4 ug / ml sCD4 i 30 minutter ved stuetemperatur før fortsatrådgivning, demonstrationsprojekter med standardprotokollen (Dag 4 - ELISA). Env konformation blev derefter probet ved inkubering med 0,25 ug / ml 2G12, 1 ug / ml 17b eller 48d anti-Env-mAbs i 1 time ved stuetemperatur. Signaler blev detekteret ved kemiluminescens efter inkubation med et HRP-konjugeret anti-humant antistof i 45 minutter ved stuetemperatur. Vist er de gennemsnitlige RLU-værdier ± SD af seks gentagelser med signal opnået fra brønde transficeret med et irrelevant plasmid (ingen ENV) fratrækkes. Data er repræsentativ for resultater opnået i tre uafhængige forsøg, med signifikans testet af to-vejs ANOVA (ns, ikke signifikant; ****, p <0,0001).
Figur 3. Modulering af Env kropsbygning. HIV-1 YU2 ACt lag 1 Env mutant (H66A) mindskes CD4i 17b anerkendelse mens S375W varianten udstillings steg 17b signal og er tilstrækkelig til at genoprette fænotype lag 1 mutanten. (A) RLU-værdier af de signaler, der er opnået under anvendelse af anti-Env PGT121 og 17b mAb'er. (B) PGT121-normaliseret signaler CD4i mAb 17b efter behandling med eller uden sCD4. Vist er de middelværdier ± SD af tre eksemplarer med signalet opnået fra brønde transficeret med et irrelevant plasmid (ingen ENV) fratrækkes. Data er repræsentativ for resultater opnået i tre uafhængige forsøg, med signifikans testet ved to-vejs ANOVA (** p <0,01, *** p <0,001; ****, p <0,0001).
Figur 4. Coekspression af cellulær CD4 forbedrer anerkendelse af CD4i antistoffer. Et CD4-kodning plasmid blev cotransficeret med HIV1 YU2 ACt Env for at favorisereCD4-bundne konformation 18. (A) RLU værdier af de signaler, der er opnået ved hjælp af anti-Env 2G12, A32 eller C11 mAb'erne og anti-CD4 OKT4 mAb. (B) 2G12-normaliserede signaler CD4i mAbs A32 og C11. Vist er de middelværdier ± SD af tre eksemplarer med signalet opnået fra brønde transficeret med et irrelevant plasmid (ingen ENV) fratrækkes. Data repræsenterer resultater opnået i tre uafhængige forsøg. Grå bjælke angiver i fravær af CD4, mens den voksende blå bjælke angiver en trinvis stigning i mængden af CD4 ekspressor transficeres (1,7 ng, 3,5 ng, og 7 ng) og rød bjælke angiver transfektion af en CD4 mutant (F43H 7 ng) med nedsat evne til at interagere med gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette assay er optimeret til at detektere interaktionen af specifikke mAb'er med HIV-1 trimer Env udtrykt på celleoverfladen. Når protokollen er blevet etableret, kan den bruges ved medium til høj produktivitet med lave samlede materielle omkostninger og små mængder af antistoffer. Eftersom dette assay er transfektion-baseret, kan det let tilpasses til coekspression af cellulære proteiner, såsom CD4 for at undersøge deres virkninger på Env konformation.
Men transfektion base af denne protokol indebærer også, at det er en af de vigtigste faldgruber. First off, at antigener blive undersøgt med denne teknik er forpligtet til at være til rådighed i et selvstændigt udtryk vektor. Som sådan ville Env-generne fra forskellige kliniske kilder eller provirale konstruktioner skal subklonet ind i mammale ekspressionsvektorer. Mens fuld længde provirale konstruktioner også kan anvendes i denne teknik (se Veillette et al. 18), indebærer dette også handlingive viruspartikler produktion kræver således arbejde i passende biologisk indeslutning faciliteter.
Desuden er succesen af denne teknik tæt forbundet med transfektionseffektivitet. Lave opnåede signaler er ofte på grund af dårlig ekspression af transficerede antigener. Typiske kilder til problemer er plasmid-DNA kvalitet, transfektionsreagenser. og celler levedygtighed. Hvis det er nødvendigt, kan optimering af transfektion betingelser også udføres ved hjælp af andre teknikker, såsom flowcytometri eller western blotting. Notatet, er det også vigtigt at være opmærksom på, at udtryk for nogle Env-konstruktioner kan være suboptimal, og kan derfor påvirke teknik udfald.
Her fokuserede vi på sondering HIV-1 Env konformation under anvendelse af tidligere beskrevet CD4i mAb'er. Denne indstilling giver mulighed for en bred vifte af analyse som sondering effekten af env punktmutationer eller konformationelle konsekvenser af co-udtrykte proteiner. Desuden teknikken beskrevet hanre kan også anvendes med godt karakteriserede Env mutanter med forskellige konformationelle tilbøjelighed for at undersøge specificiteten af forskellige mAb'er til forskellige Env konformationer. Dette giver en nem og hurtig karakterisering af nyligt isolerede mAb'er mens den ikke kræver højt specialiseret udstyr eller knowhow.
Selv om vi kun brugt denne metode mod Env fra forskellige HIV-1 grupperne og andre nære relative slægter (HIV-2, SIV / Mac) 18, mener vi denne analyse kunne tilpasses til ekstra overflade antigener, såsom dem fra andre virus familier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Dr. James Robinson for hans generøse gave af A32, 17b, 48d, og C11-mAb'er. PGT 121 blev opnået gennem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Kat # 12343). Dette arbejde blev støttet af en Canada Foundation for Innovation Program Leader # 29866, ved en CIHR operativsystem # 257792 ved en FRQS Etablering af unge videnskabsmand indrømme # 24639 til AF og ved en CRCHUM kontinuum tilskud samt ved en CIHR katalysator tilskud # 126630 til AF og MR. AF er modtageren af en FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 fællesskab # 24639. MV blev understøttet af en CIHR ph.d.-forskning Award # 291485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
