Introduction
Humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) posten, förmedlad av de trimera virala höljesglykoproteiner (Miljö) är det första steget i infektionscykeln. Att vara den enda exponerade virala antigen som presenteras på ytan av virioner, Env trimer framkallar neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar. Som sådan utgör den en intressant kandidat för vaccinimmunogen design. Men vaccinationsförsök med Env i lösliga eller rekombinanta former framkallade svar med endast minimal effekt mot de flesta primära HIV-1-isolat 1-3. Ändå partiell effekt observeras i RV144 vaccin prov 4 förnyat intresse för HIV-1 Env som ett immunogen kandidat. Detta bekräftades av en färsk studie som beskriver att vaccin framkallade anti-Env antikroppar var tillräcklig för att generera ett visst skydd mot SIV och HIV utmanar 5.
Efter att syntetiseras i det endoplasmatiska retiklet, Env glycoprotei föregångaren, gp160, genomgår olika posttranslationella modifieringar som är kritiska för dess förmåga att underblåsa den virala fusionsprocessen. Den Env gångare måste lägga sig på rätt sätt och umgås i trimerer innan de klyvs i sina extra cytoplasmatiska gp120 och gp41 trans subenheter 6-10, med icke-kovalenta interaktioner upprätthålla förbindelse gp120-gp41. Den infekterade cellen maskiner är också ansvarig för tungt glykosylering Env, omfattar ca 50% av dess totala massa 11,12. Den resulterande komplexa struktur gör Env vara konforma flexibel 13,14, samtidigt som en metastabilitet som är tänkt att låta Env att anpassa och dölja vissa mycket immunogena epitoper som annars skulle utsättas 15-19, belyser vikten av att bättre förstå de olika konformationer samplas av den infödda Env trimer.
Hittills har flera tekniker utvecklats och med framgång använts för att studera Env konformationell lmAnges. Men de varierar i sina begränsningar, som ofta begränsas till specifika Env sammanhang. Exempelvis ytplasmonresonans eller immunfällningsanalyser med användning konforma specifika monoklonala antikroppar (mAbs), förlitar sig på antingen monomera lösliga eller solubiliserade Env-molekyler som är kända för att vara immunogenetically annorlunda än sina trimera former 20,21. Färska studier tyder också på att klyvning påverkar Env konformationer som leder till exponering av epitoper som främst uppkommit genom icke-neutraliserande antikroppar 14,22,23.
Här beskriver vi i detalj en metod som möjliggör snabb och enkel bestämning av konforma av cellulärt uttryckt Env trimerer 18,24-26. Efter övergående transfektion av Env i en human vidhäftande cellinje bindningen av Env-specifika antikroppar detekteras med hjälp av en enkel kemiluminiscens reaktion. Denna teknik kan också användas för att karakterisera den konforma preferens av konforma-DEPENdent antikroppar. Således tillhandahåller denna analys en robust och mycket flexibel detektionsmetod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Dag 1 - Cell Culture
- Plate 2 x 10 4 humana osteosarkoma (HOS)-celler per brunn i en opak, 96-brunnars cellkulturplatta lämplig för luminiscens läsning. Använd Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin-streptomycin. Inkubera till nästa dag vid 37 ° C, 5% CO2.
2 Dag 2 - Polyetylenimin (PEI) Transfektion
- Förbered transfektion mix enligt följande steg. Justera reagens och DNA-mängder som enligt det antal brunnar som skall transfekteras med samma Env.
- Rör A: Lägg till 10 ng Tat-kodande plasmid (såsom PTAT-III 27) och 150 ng Env-kodande plasmid till 5 pl DMEM kompletterat med 25 mM HEPES.
- Tat-kodande plasmid krävs endast vid användning av Tat-beroende Env-kodande plasmider såsom pSVIII.
- Rör B: Lägg 450 ng PEI (från 1pg / pl lösning) till 5 | j, l DMEM.
- Lägg till innehåll i rör B till röret A. Blanda noggrant genom att vortexa i 10 sekunder och inkubera transfektion mix 10 min vid rumstemperatur (22 ° C).
- Lägg 10 ul av transfektion blandning per brunn i 96-brunnars platta. Inkubera under 48 h vid 37 ° C, 5% CO2.
3 Dag 4 - ELISA
- Utför alla experiment i rumstemperatur för att minimera eventuella endocytos av ENV / antikroppar komplex.
- Bered 250 ml tvättbuffert per platta som används samtidigt. Tvättbuffert är 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 150 mM NaCl), kompletterat med 1 mM MgCl2 och 1,8 mM CaCl2.
- Förbered 125 ml blockerande buffert per platta genom att lägga till 1% fettfri torrmjölk och 5 mM Tris pH 8,0 till tvättbuffert.
- Avlägsna cellodlingsmedia och transfektion mix (supernatant) från 96-brunnar.
- Lägg 100 μ; Ll blockeringsbuffert per brunn och inkubera 20 minuter vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 50 | il av antikropp (eller serum) per brunn, utspätt till lämplig koncentration i blockeringsbuffert. Typiskt använder en koncentration av 1 pg / ml. Inkubera 1 h vid RT.
- Tvätta 3x med 100 | il blockerande buffert och sedan upprepa tvättningsprocessen 3x med 100 ul tvättbuffert.
- Avlägsna supernatanten, tillsätt 100 pl blockeringsbuffert och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 50 | il sekundär antikropp, utspädd 1/3000 i blockeringsbuffert. Variera optimal antikroppsspädning enligt tillverkarens skillnader. Inkubera 40 min vid RT.
- Tvätta 3x med 100 | il blockerande buffert och sedan upprepa tvättningsprocessen 3x med 100 ul tvättbuffert.
4 Datainsamling
- Avlägsna supernatanten från plattan och tillsätt 30 l 1x förstärkt kemiluminescens substrat (ECL) per brunn.
- Skaffa chemiluminescence signal för en sek / brunn på en lämplig plattläsare i enlighet med tillverkarens instruktioner. Läsa tiden kan variera beroende på hårdvaruskillnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av det allmänna förfarande som beskrivs ovan, anpassade vi protokollet för att analysera effekterna av lösligt CD4 (sCD4) och samuttryckt cellulära CD4 på exponeringen av CD4i epitoper antingen vildtyp (wt) eller muterad Env, som beskrivits tidigare 18,24, 25,28. Figur 1 visar schematiskt det allmänna förfarandet och exponeringen av CD4i epitoper efter behandling med sCD4 eller genom samuttryck av cellulära CD4 18. I figur 2 använde vi sCD4 att inducera Env konformationsförändringar som utsätter CD4i mAbs 17b och 48d epitoper som överlappar den coreceptor bindningsstället 24,29, medan den yttre-domänen erkänner mAb 2G12 inte påverkas av denna behandling som väntat 18,24.
Effekterna av punktmutationer i Env konforma kan också utföras med denna analys, enligt figur 3. Här har vi använt antingen skiktet 1 Env mutant H66A, kända för att ha en minskningd benägenhet att spontant ta prov på CD4 bundna konforma 18,24,30,31 eller en mutant (S375W) som predisponerar Env till CD4-bundet tillstånd 32 och fått samstämmiga resultat (Figur 3A). I de fall där olika Env expressorer används, är det ofta nödvändigt att normalisera de rådata som uttrycks som relativa ljusenheter (RLU) enligt expressionsnivåer. I detta fall använde vi PGT121, en mAb känner igen en del av Env glykan sköld 33-35, eftersom normaliserings antikropp (Figur 3B).
Som vi beskrev nyligen 18, interaktion av Env och CD4 i samma cell leder till env konformationsförändringar som exponerar CD4i epitoper. I fig 4, vi samtransfekterades ökande mängder av en CD4 expressor tillsammans med Env i den cellbaserade ELISA-analys och erhållna ökande signaler för CD4i mAbs A32 och C11 18,36-38, vilka känner igen diskontinuerliga epitoper i den inre domänen av GP120, medan Env erkännande av konformationsoberoende 2G12 kroppen inte påverkades (Figur 4A). För att kontrollera för transfektionseffektivitet mellan villkor, var rådata normaliseras till 2G12 (Figur 4B). Ökade signaler erhölls för A32 och C11-antikroppar beroende Env-CD4 interaktion som indikeras av frånvaron av A32 och C11 modulation när Env samtransfekterades med ett CD4 mutant (F43H) med minskad förmåga att interagera med Env 39.
Figur 1 Schematisk bild av den anti-Env cellbaserad ELISA. (A) Allmänt system av förfarandet där HOS celler transfekteras för att uttrycka trimer Env vid cellytan. Env konforma kan sedan samplas med hjälp av olika antikroppar som känner igen specifikakonformationer (t.ex. CD4i mAbs). Signaler detekteras genom kemiluminescens efter färgning med HRP-konjugerad anti-human-mAbs. sCD4 (B) eller samuttryck av cellulär CD4 (C) kan användas för att inducera Env konformationsförändringar som leder till exponering av CD4i epitoper.
Figur 2 sCD4 inducerar Env konformationsförändringar som leder till exponering av CD4i epitoper. Interaktion av sCD4 med HIV-1 CO-JRFL ΔCT Env förbättrar igenkänning av antikroppar riktade mot CD4i epitoper (17b, 48d), men inte av gp120 yttre-domän erkänna antikropp 2G12. En plasmid som kodar för HIV-1 CO-JRFLΔCT Env transfekterades i varje brunn och 48 h senare tvättades cellerna och inkuberades i närvaro eller frånvaro av 4 | ig / ml sCD4 för 30 min vid RT före fortsinuing med standardprotokollet (Dag 4 - ELISA). Env konformaades sedan sonderades genom inkubering med 0,25 | ig / ml 2G12, 1 | ig / ml 17b eller 48d anti-env-mAb under 1 h vid RT. Signaler detekterades genom kemiluminescens efter inkubation med en HRP-konjugerad anti-human-antikropp under 45 min vid RT. Här visas de genomsnittliga RLU-värden ± SD av sex replikat med signalen som erhålls från brunnarna transfekterade med en irrelevant plasmid (ingen Env) subtraheras. Data är representativt resultat från de tre oberoende försök, med signifikans testades med två-vägs ANOVA (ns, inte signifikant; ****, p <0,0001).
Figur 3 Modulering av Env konforma. HIV-1 YU2 ΔCT skiktet 1 Env mutant (H66A) minskar CD4i 17b erkännande medan S375W varianten utställnings ökade 17b signalen och är tillräcklig för att återställa den fenotyp av skiktet 1 mutanten. (A) RLU-värden av de signaler som erhölls med användning av anti-ENV PGT121 och 17b mAbs. (B) PGT121-normaliserade signaler om CD4i mAb 17b efter behandling med eller utan sCD4. Här visas medelvärden ± SD av tre exemplar med signalen som erhålls från brunnarna transfekterade med en irrelevant plasmid (ingen Env) subtraheras. Data är representativt för resultat som erhållits i tre oberoende experiment, med signifikans testades genom två-vägs ANOVA (**, p <0,01, *** p <0,001; ****, p <0,0001).
Figur 4 Samuttryck av cellulära CD4 ökar erkänna CD4i antikroppar. En CD4-kodande plasmid samtransfekterades med HIV1 YU2 ΔCT Env för att gynnaCD4-bundna konformation 18. (A) RLU-värden av de signaler som erhölls med användning av anti-ENV 2G12, A32 eller K11 mAb och anti-CD4-OKT4 mAb. (B) 2G12-normaliserade signaler om CD4i mAbs A32 och C11. Här visas medelvärden ± SD av tre exemplar med signalen som erhålls från brunnarna transfekterade med en irrelevant plasmid (ingen Env) subtraheras. Data är representativt för resultat som erhållits i tre oberoende experiment. Grå indikator visar på frånvaro av CD4, medan den ökande blå fältet indikerar en stegvis ökning av mängden CD4 expressor som transfekteras (1,7 ng, 3,5 ng och 7 ng) och röd stapel visar transfektion av en CD4 mutant (F43H , 7 ng) med minskad förmåga att interagera med gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna analys är optimerad att detektera interaktion av specifika mAbs med HIV-1 trimera Env uttrycktes vid cellytan. När protokollet har fastställts, kan den användas vid medelhöga till höga genomflöden med låga totalkostnader material och små mängder av antikroppar. Eftersom denna analys är transfektion baserad, kan den lätt anpassas för samuttryck av cellulära proteiner såsom CD4 för att studera deras effekter på Env konformation.
Men transfektion basen av detta protokoll innebär också att det är en av dess viktigaste fallgropar. Först och främst, till antigener studeras med denna teknik måste vara tillgänglig på ett oberoende expressionsvektor. Som sådan skulle Env-gener från olika kliniska källor eller provirala konstrukt behöver subklonas in i däggdjursexpressionsvektorerna. Medan fullängds provirala konstrukt kan också användas i denna teknik (se Veillette et al. 18), detta innebär också ageraive viruspartiklar produktion vilket kräver arbete i lämpliga biologisk inneslutning anläggningar.
Dessutom är framgången för denna teknik intimt förknippat med transfektionseffektivitet. Low signaler som erhålls beror ofta på dålig expression av transfekterade antigener. Typiska källor till problem är plasmid-DNA kvalitet, transfektionsreagens. och celler bärkraft. Om så krävs, kan optimering av transfektion villkor också utföras med användning av andra tekniker, såsom flödescytometri eller western blotting. Notera, är det också viktigt att vara medveten om att uttrycket av vissa Env konstruktioner kan vara suboptimal och kunde därför påverka tekniken utfall.
Här har vi fokuserat på att sondera HIV-1 Env konforma använder tidigare beskrivna CD4i mAbs. Denna inställning gör det möjligt för ett brett spektrum av analyser som sondering effekten av Env punktmutationer eller konforma konsekvenser samuttryckt proteiner. Vidare beskrev tekniken som hanre kan också användas med väl karakteriserade Env mutanter med olika konforma benägenhet för att sondera specificitet olika mAbs för olika Env konformationer. Detta möjliggör en enkel och snabb karaktärisering av nyligen isolerade mAbs samtidigt inte kräver högt specialiserad utrustning eller kunnande.
Även om vi endast denna metod mot Env från olika HIV-1-subtyper och andra nära relativa härstamningar (HIV-2, SIV / Mac) 18, anser vi denna analys skulle kunna anpassas för ytterligare ytantigener, såsom de från andra familjer virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr James Robinson för hans generösa gåva av A32, 17b, 48d, och C11 mAbs. PGT 121 erhölls genom NIH aids Reagens Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH (katalognummer 12343). Detta arbete stöddes av en Canada Foundation for Innovation Program Leader # 29866, med en CIHR drifts # 257.792, med ett FRQS Etablering av Young Scientist bevilja # 24639 till AF och en CRCHUM kontinuum bidrag samt av en CIHR katalysatorbidrags # 126.630 till AF och MR. AF är mottagare av ett FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 gemenskap # 24639. MV stöddes av en CIHR Doctoral Research Award # 291.485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
