Summary
Her beskriver vi en protokol til generering af menneskeskabte pluripotente stamceller fra perifert blod ved hjælp af et episom baseret omprogrammering strategi og histondeacetylaseinhibitorer.
Abstract
Dette håndskrift illustrerer en protokol for effektivt at skabe integration uden menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs) fra perifert blod ved hjælp af episomale plasmider og histon deacetylase (HDAC) inhibitorer. Fordelene ved denne fremgangsmåde omfatter: (1) anvendelse af en minimal mængde af perifert blod som udgangsmateriale; (2) nonintegrating omprogrammering vektorer; (3) en omkostningseffektiv metode til at generere vektor gratis iPSCs; (4) en enkelt transfektion; og (5) anvendelse af små molekyler for at lette epigenetisk omprogrammering. Kort fortalt perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) isoleret fra rutinemæssige flebotomi prøver og derefter dyrket i definerede vækstfaktorer til opnåelse af en meget proliferativ erythrocyt progenitorcellepopulationen der er bemærkelsesværdigt modtagelig for omprogrammering. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmider, der udtrykker OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A og en p53 kort hårnål (sh) RNA er Introduced i de afledte erythroblaster via en enkelt nucleofection. Cotransfektion af et episom der udtrykker forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) giver mulighed for nem identifikation af transficerede celler. En separat replikationsdefekt plasmid, der udtrykker Epstein-Barr-nukleare antigen 1 (EBNA1) også sættes til reaktionsblandingen for forøget ekspression af episomale proteiner. Transficerede celler udplades derefter på et lag af bestrålet muse embryonale fibroblaster (iMEFs) for fortsat omprogrammering. Så snart iPSC-lignende kolonier vises omkring tolv dage efter nucleofection er HDAC-hæmmere til mediet for at lette epigenetisk remodeling. Vi har fundet, at inddragelsen af HDAC-hæmmere rutinemæssigt øger generation af fuldt omprogrammerede IPSC kolonier med 2 gange. Når IPSC kolonier udviser typisk humane embryonale stamceller (hESC) morfologi, er de forsigtigt overført til individuelle iMEF-coatede vævskulturplader for fortsat vækst og ekspansion.
Introduction
iPSCs stammer fra somatiske væv via ektopisk ekspression af et minimalt sæt af pluripotens gener. Denne teknik blev oprindeligt påvist ved retroviral transduktion af humane fibroblaster med OCT4, SOX2, KLF4 og cMYC, som er stærkt udtrykt i den pluripotente tilstand 1. Disse forbigående udtrykt "omprogrammering faktorer" ændre target cellens epigenetisk landskab og genekspressionsprofil analog med humane embryonale stamceller 2. Når den er oprettet, kan iPSCs potentielt differentieres i nogen vævstyper til yderligere undersøgelse. Således, at de er lovende til anvendelse i regenerativ medicin, sygdomsmodeller og genterapianvendelser. Imidlertid forstyrre genomet med integrere vira har potentialet til at ændre endogene genekspression indflydelse cellulære fænotype, og i sidste ende forspænde videnskabelige resultater. Derudover kan tilfældige virale integrationer føre til skadelig cellulær effekter, herunder muligheden for malign transformation 3 eller re-ekspression af onkogene transgener 4. Fremtidige kliniske anvendelser vil kræve ikke-integrerende iPSC generation.
Episomer, som er ekstra kromosomale cirkulære DNA-molekyler, tilbyder en strategi til at generere omkostningseffektive, integration-fri iPSCs 5. Kombinationen af episomale vektorer vist i tabel 1 udtrykke omprogrammering faktorer OCT4, SOX2, KLF4, MYCL og LIN28A. Den pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F plasmid indeholder også et p53 shRNA til midlertidig undertrykkelse af TP53 at forbedre cellulær omprogrammering 6. Den replikationsdeficient pCXWB-EBNA1 vektor fremmer opformering af omprogrammering faktorer og øget omprogrammering effektivitet ved at give en forbigående stigning i EBNA1 udtryk 7. Den pCXLE_EGFP plasmid kan tilsættes til nucleofection blandingen med henblik på determining transfektionseffektiviteten eller cellesortering applikationer. Med undtagelse af p CXWB-EBNA1 de episomale plasmider, der anvendes i denne protokol indeholder den Epstein-Barr virus af viral replikation og EBNA1-genet, som medierer replikation og deling af episom under deling af værtscellen 8. De episomer spontant tabt med successive iPSC ekspansion 7. Subkloning og karakterisering af iPSCs med episomalvektor tab, som kan udledes af tab af eGFP udtryk, kan føre til helt integration gratis iPSCs for fremtidige kliniske anvendelser.
Iboende i processen iPSC generation er undertrykkelse af linjespecifikke gener og genaktivering af pluripotens-associerede gener. Regulering af genekspression forekommer på flere niveauer i kernen, herunder ændringer af DNA og chromatin at tillade transkriptionsfaktorer, regulatoriske DNA-elementer, og RNA-polymerase adgang til målrettetgener. Ombygning af epigenetiske landskab via globale kromatin modifikationer er en nøglekomponent til at re-ekspression af pluripotens genetiske program. En specifik chromatin modifikation, der er vigtig i regulering af genekspression er acetylering af histoner på bestemte lysinrester, som giver adgang til målgener gennem nedsat spænding af histon-DNA spole. HDAC-hæmmere er små molekyler, der har vist sig at forbedre iPSC omprogrammering og embryonale selvfornyelse 9,10, sandsynligvis på grund af støtte acetyleret tilstand 11. Den nedenfor beskrevne protokol, tilpasset fra en forudgående offentliggørelse hjælp integrere lentivira 12, giver en trin-for-trin metode til optimeret iPSC generation fra perifert blod ved hjælp episomer og HDAC-hæmmere. De HDAC inhibitorkoncentrationer anvendt her, er halvdelen af dem, der er beskrevet af Ware et al. 9 og har rutinemæssigt ført til en 2 gange stigning i fuldt omprogrammerede IPSC kolonier end standardepisomale omprogrammeringsbeslutninger protokoller uden HDAC-hæmmere. Dette niveau af omprogrammering er på niveau med den effektivitet, vi observerer med lentivirale metoder. Ved anvendelse af denne protokol, har vi effektivt genereret iPSC fra enkeltpersoner så gammel som 87 år gammel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informeret samtykke, som er godkendt af de Institutional Review Boards af Fred Hutchinson Cancer Research Center og Children "s Hospital i Philadelphia, blev opnået fra patienter før indsamlingen perifere blodprøver. Alle institutionelle retningslinier blev observeret. Alle dyreforsøg, herunder MEF generation og teratom dannelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Ficoll Adskillelse af PBMC'er og Udvidelse af erytroblaster - Dag 0
- Fortynd perifert blod 1: 1 med Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS). I en 15 ml rundbundet polystyrenrør omhyggeligt lag 7 ml fortyndet blod på 3 ml stuetemperatur Ficoll-Hypaque.
- Centrifugeres prøven ved 400 x g i 30 min.
- PBMC'erne vil have afgjort til grænsefladen mellem plasmaet og Ficoll-Hypaque, ses som en uklar hvid lag. Ved hjælp af en steril overførsel pipette, indsamle PBMC'er i en 15 ml konisk rør. Bring volumen til 10 ml med DPBS.
- Ved hjælp af en hemacytometer, tælle PBMC'erne.
- Afpipetteres 2 × 10 6 PBMC'er til en separat 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Spin ned de resterende celler og frysning ved en koncentration på 2 × 10 6 PBMC'er / ml i 90% føtalt bovint serum (FBS) / 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Forbered Expansion Medium: QBSF-60 serumfrit medium (beskyttet mod lys) + penicillin / streptomycin (1%) + ascorbinsyre (50 ng / ml) + stamcelle faktor (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (IL 3, 10 ng / ml) + erythropoietin (EPO, 2 U / ml) + insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexamethason (1 uM; beskytte mod lys tø en frisk portion hvert medie ændres).
- Resuspender 2 × 10 6 PBMC'er i 2 ml frisk fremstillet Expansion Medium og anbringes i en brønd i en 12-brønds vævskulturplade og inkuberes i en 37 ° C befugtet inkubator med en atmosfære af 5% O 2, 5% CO 2, og 90% N2.
- På dag 3 og dag 6, udskifte medier.
- Opsamle cellerne og vaskes godt med 2 ml QBSF-60 at opsamle de resterende celler.
- Centrifugeres cellesuspensionen ved 300 xg i 5 minutter og supernatanten aspireres.
- Opblande cellerne i 2 ml nye Expansion Medium og returnere dem til den samme 12 brønds plade.
2. Omprogrammering Celler af nucleofection - dag 9
- Pipettere omprogrammering plasmider i en steril 1,5 ml Eppendorf-rør (tabel 1).
- Bland nucleofection løsning med tillæg (leveret af producenten) og pipette i en steril 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Pipetter 2 ml Expansion Medium i en brønd af en 12 brønds plade og sted i en befugtet 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2 og 90% N2) for ækvilibrering før tilsætning af celler.
- Samldyrkede celler og vaskes godt med 2 ml QBSF-60 til at indsamle de resterende celler.
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter og supernatanten aspireres.
- Vask cellerne ved resuspendering i 5 ml DPBS og centrifugering ved 300 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 100 pi nucleofection løsning + Supplement, idet man undgå at skabe bobler.
- Pipettere cellesuspensionen i rør indeholdende omprogrammering plasmider, pipette op og ned en gang, og pipette prøven i bunden af nucleofection kuvette.
- Placer kuvetten i nucleofection maskinen og køre Program T-019.
- Overfør 100 ul af forvarmet Expansion Medium (fra Den udlignende pladen i trin 2.3) i nucleofection kuvette.
- Umiddelbart samle hele prøven og indbetaler til godt forvarmet Expansion Medium. Undgå at indsamle de hvide, svævende døde cellerester. Pladen anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2 og 90% N2) for vækst.
3. Plating feederceller - Day 10 eller 11
- På dag 10, plade fødeceller.
- Coat en 6-brønds vævskulturplade med gelatine.
- Pipette 1 m 0,1% gelatine i Hanks Buffered Saline Solution (HBSS) i hver brønd i pladen.
- Pladen anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator i mindst 5 min.
- Umiddelbart før brug sug gelatineopløsning fra pladen.
- Optø et hætteglas med 2 × 10 6 muse embryonale fibroblaster bestrålet ved 3000 cGy i 10 ml forvarmet MEF Media (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicillin / streptomycin (1%)).
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter og supernatanten aspireres. Opblande cellerne i 12 ml MEF Medier og pipette 2 ml into hver brønd i gelatine-coatede 6 brønd plade. Pladen anbringes i en fugtig 37 ° C inkubator (5% O 2, 5% CO 2, og 90% N 2), indtil Dag 12.
- Coat en 6-brønds vævskulturplade med gelatine.
4. Plating celler på feeder-celler og Ændring af Medium - Dag 12
- Indsamle nucleofected celler i en 15 ml konisk rør og indsamle de resterende celler ved at vaske godt med 2 ml QBSF-60. Centrifugeres prøven ved 300 xg i 5 minutter.
- Forbered Reprogramming Medium: Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium (IMDM) + FBS (10%) + ikke-animalsk L-glutamin (1 mM) + ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, 1%) + penicillin / streptomycin (1%) + β mercaptoethanol (0,1 mM) + basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF, tilsættes frisk på fodring, 10 ng / ml) + ascorbinsyre (tilsat frisk på fodring, 50 ug / ml).
- Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 12 ml Reprogramming Medium. Pipetter 2 ml per brønd af cellesuspensionen i6 godt plade af feeder-celler (som fremstillet i afsnit 3). Centrifugeres pladen ved 50 x g i 30 min ved stuetemperatur.
- Pladen anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2 og 90% N2) for vækst. Skift Omprogrammering Medium hver anden dag, indtil IPSC kolonier begynde at blive vist (1-2 uger).
- Forbered embryonale Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum udskiftning (20%) + penicillin / streptomycin (1%) + NEAA (1%) + ikke-animalsk L-glutamin (1 mM) + natriumpyruvat (1%) + natriumhydrogencarbonat (0,12%) + β-mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (tilsat frisk på fodring, 10 ng / ml)
- Forbered HDAC-hæmmere: natriumbutyrat (tilsat frisk på fodring, 100 uM), suberanilohydroxamic syre (SAHA, tilføjede frisk på fodring, 200 Nm). Når IPSC kolonier vises, begynder at fodre cellerne med embryonale Medium + HDAC-hæmmere, skiftende medium hver dag.
BEMÆRK: Natriumbutyrat er et lille molekyle, der er adsorberet til plastrør, therefore gemme det i en borosilikatglas rør ved 4 ° C.
5. Isolering IPSC Clones
- Når IPSC kolonier er store nok til at blive isoleret (20-25 celler), samle dem med en P20 pipette.
- Forbered HDAC-hæmmere: natriumbutyrat (tilsat frisk på fodring, 100 uM), SAHA (tilsat frisk på fodring, 200 nM)
- Placer isolerede kolonier på iMEFs i individuelle 35 mm skåle indeholdende embryonale Medium + HDAC-hæmmere + Kloning & Recovery supplement.
- Dagen efter plukningen kolonierne, ændre mediet til embryonale Medium + HDAC-hæmmere.
- Skift medium hver dag indtil IPSC kolonier er klar til passage.
- Fjern HDAC-hæmmere fra mediet, når kolonier stabilisere sig på passage 2-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre dage efter nucleofection og før udpladning af celler på nucleofected iMEFs bør effektiviteten af vellykket nucleofection estimeres ved fluorescensmikroskopi for eGFP. Figur 1 viser en typisk nucleofection eksperiment med ca. 5-10% af den totale cellepopulation, der udtrykker eGFP.
Omprogrammeres IPSC kolonier vil begynde at dukke cirka to uger efter nucleofection. Kolonierne er generelt cirkulær med veldefinerede grænser og kan identificeres ved karakteristiske embryonale morfologi, herunder (1) små, tætpakkede celler med et højt nukleart-cytoplasma ratio og (2) synlig nucleoli (Figur 2, Bright felt). Ufuldstændigt omprogrammerede celler vil enten forringes eller danner heterogene cellemasser som er let skelnes fra ægte IPSC kolonier.
Af de repræsentative linjer, som vi har valgt at karakterisere fuldstændigt, udtrykker alle de standard pluripotens markører (figur 2), aktivere endogene pluripotens gener (figur 2), og danne teratomer, når de injiceres i NOD-SCID-mus.
Figur 1: Nucleofected celler stimuleret PBMC'er tre dage efter nucleofection med plasmider indeholdende OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA og eGFP (Scale bar er 100 um)..
Figur 2:. IPSC Karakterisering IPSC genereres ved hjælp af denne metode udviser embryonale-lignende morfologi når de dyrkes på iMEF (Bright field), testes positive for alkalisk phosphatase aktivitet (AP), og er positiveved immunhistokemi for pluripotens markører TRA-1-60, TRA-1-81, og SSEA4. Derudover endogen ekspression af gener pluripotens Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K), og cMyc (M) kan påvises ved hjælp af RT-PCR. (Alle skala barer er 100 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Episom | Masse pr reaktion (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-HSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tabel 1:. Optimale forhold mellem Reprogramming plasmider 6 Disse plasmider er tilgængelige at bestille gennem Addgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For vellykkede iPSC generation, når du bruger denne protokol, der er flere vigtige forbehold, der bør overvejes. Under erythroblast ekspansionsfasen, bør medierne ændre tidsplanen følges nøje, da afvigelser kan føre til ineffektiv stimulering af målet progenitorcellepopulation og en lavere effektivitet iPSC generation. Det er vigtigt at gøre ny ekspansion medium med frisk dexamethason med hver medier forandringer; og QBSF-60 basismedium og dexamethason bør beskyttes mod lys under opbevaring. Under nucleofection, den DPBS vask er afgørende for at fjerne overskydende opløste stoffer fra cellesuspensionen, der kan forårsage den elektriske strøm fra nucleofector til arc, hvilket resulterer i udbredt celledød. Ca. 10 dage efter nucleofection bør pladen undersøges dagligt for iPSC koloni udseende. Når flere små kolonier er til stede, bør Reprogramming Medium ændres til embryonale Medium (med HDAC-hæmmere) som prolonged eksponering for serum kan inducere spontan differentiering.
Afhængig af laboratorie set-up og tilgængelige ressourcer, kan ændringer af protokollen tages i betragtning. Vi foretrækker en lav O 2 inkubator fordi hypoxiske betingelser har vist sig at øge effektiviteten af iPSC generation 13; Dog har vi haft succes genererer iPSCs fra perifert blod ved hjælp normoxiske betingelser med 5% CO 2. Derfor er en standard befugtet CO2-inkubator, kan også anvendes. De MEF'er anvendes i denne protokol kan købes fra en life science leverandør. På grund af kommerciel variabilitet parti, foretrækker vi dog at generere iMEFs fra CF-1 mus efter en offentliggjort protokol for MEF isolation, kultur og bestråling 14. Inddragelsen af HDAC-hæmmere er en gunstig aspekt af denne protokol som epigenetisk remodeling er et afgørende aspekt af cellulær omprogrammering 9,15. HDAC-inhibitorer kan udelades, men antallet af fully omprogrammeret IPSC kolonier vil blive reduceret. Endelig har vi genereret iPSCs anvendelse af denne fremgangsmåde med en knoglemarv prøve uden yderligere modifikationer nødvendige.
Sammenfattende denne protokol anvender et plasmid baseret omprogrammering system, der undgår nogle af ulemperne ved iPSC generation med integrerende vektorer, herunder tilfældige indsættelser i værtsgenomet og sikkerhedsmæssige bekymringer vedrørende håndtering af rekombinant virus. Derudover små virus produktion og karakterisering er relativt arbejdskrævende sammenlignet med plasmid generation. Omprogrammering effektivitet kan også variere betydeligt som følge af batch variation iboende virus produktion, mens en stor produktion af kvalitets plasmider skala kan føre til konsekvent iPSC generation over tid. Kombineret med HDAC-hæmmere, denne protokol tilbyder en effektiv metode til at generere integration fri og fodaftryk gratis iPSCs for stamcelleforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende følgende tilskud fra NIH til at støtte denne forskning: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), og K12HL0806406 (SKS); og JP McCarthy Foundation (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
