Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.
Nyere betydelige fremskritt i stamcelle forskning og bioteknologi teknikker har gjort store fremskritt i å utnytte biomaterialer til å fornye og reparere skader i enkle vev i ortopediske og perioden felt. Imidlertid har forsøk på å regenerere strukturene og funksjonene til mer komplekse tredimensjonale (3D) organer som lunger har ikke vært særlig vellykket fordi de biologiske prosesser av organ regenerering ikke er godt utforsket. Det er blitt klart at angiogenese, dannelsen av nye blodkar, spiller viktige roller i organ regenerering. Nydannede vasculatures ikke bare levere oksygen, næringsstoffer og forskjellige cellekomponenter som er nødvendige for regenerering organ, men også gi instruktive signaler til de lokale regenererende vev. Derfor, for å kunne regenerere lungene hos en voksen person, er det nødvendig å rekapitulere lunge-spesifikke microenvironments hvori angiogenese stasjoner regenerering av lokale lungevevet. Selv conventional in vivo angiogenese analyser, for eksempel subkutan implantasjon av ekstracellulære matrise (ECM) rik hydrogeler (f.eks fibrin eller kollagen gels eller Matrigel – ECM protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller), er mye brukt til å utforske generelle mekanismer for angiogenese, lunge-spesifikke angiogenese, hittil ikke blitt godt karakterisert, fordi fremgangsmåter for implantering av ortotopisk biomaterialer i lungen ikke har blitt godt etablert. Målet med denne protokollen er å innføre en unik metode for å implantere fibringel på lunge overflaten av levende voksen mus, noe som åpner for en vellykket gjentagelse av verts lunge-avledet angiogenese inne i gel. Denne tilnærmingen gjør forskere til å utforske de mekanismer som lunge-spesifikke mikromiljøet kontrollerer angiogenese og alveolar regenerering i både normale og patologiske tilstander. Siden implantert biomaterialer utgivelsen og levere fysiske og kjemiske signaler til tilstøtende lUng vev, kan implantering av disse biomaterialer for syke lungen potensielt normalisere de tilstøtende sykt vev, slik at forskere for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for ulike typer av lungesykdommer.
Det overordnede målet med denne protokollen er å innføre en metode for å implantere fibringel på lunge overflaten av voksen mus, som tillater forskere å karakterisere de molekylære mekanismene for lunge vaskulær og alveolar utvikling, og for å utnytte denne kunnskapen for å utvikle biomimetic materialer stand av rekapitulere fysiologiske lunge vaskulær og alveolar formasjon for å behandle ulike lungesykdommer.
Mer enn 35 millioner amerikanere lider av kroniske lungesykdommer, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom og lungefibrose. Disse pasientene har langvarige kroniske luftveissymptomer som kortpustethet, tetthet i brystet, griner hoste og tretthet, som i betydelig grad svekker deres hverdag 1-3. Til tross for en stor innsats for å utvikle effektive behandlingsformer for disse lungesykdommer, som for tiden er det ingen kur; derfor er livskvalitet for disse pasientene fattige og økonomisk og menneskelige kostnadene er high 4-7. Foreløpig er lungetransplantasjon den eneste måten å redde pasienter med terminal-trinns kroniske lungesykdommer. Men på grunn av mangel på transplantasjons givere, høye kostnader, alvorlige komplikasjoner, og lav overlevelse 8-11, er transplantasjon ikke en optimal tilnærming. Nyere rask fremgang i tissue engineering teknikker har gitt forskerne til bioingeniør implanterbare lunge ved repopulating decellularized hel lunge med ulike typer stamceller eller indusert pluripotent stilk (iPS-celler) 12,13. Men disse bioengineered lungene er funksjonell i vertsdyret kun i flere timer etter implantasjon 12,14,15. Utnytte biomaterialer å regenerere de komplekse strukturer og funksjoner av lungene har også vært ganske mislykket. Dette kan skyldes at viktige biologiske prosesser som styrer voksen lunge regenerering ikke har blitt godt utforsket. I lungene, er en av de tidligste og viktigste hendelser duri dannelse av det vaskulære systemetng utvikling og regenerering 16-21. Nydannede vasculatures i lungen ikke bare levere oksygen, næringsstoffer og ulike cellekomponenter som kreves for orgel formasjon, men også gi instruktive regulatoriske signaler til omkringliggende celler 22-25. Dermed angiogenese spiller nøkkelroller i regenerativ alveolarization hos voksne lungene 24,26,27. I tillegg bidrar deregulert angiogenese til kroniske lungesykdommer som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) 28, bronkopulmonal dysplasi (BPD) 21-23, og lungefibrose 29. Derfor, for å utvikle mer effektive strategier for å konstruere lungene eller behandle kroniske lungesykdommer, er det nødvendig å forstå de grunnleggende mekanismer for lunge-spesifikke angiogenese.
Hvert organ viser unike mekaniske og kjemiske egenskaper, som kan variere mellom fysiologiske og patologiske tilstander 30-33. Disse organspesifikk microenvironmenter regulere endotelcelle atferd og orkestrere vaskulær nettverk formasjon i en organspesifikk måte 24,34-36. Derfor, for å utvikle mer effektive strategier for lunge regenerering, må mekanismen bak lunge-spesifikke angiogenese skal forstås. Mens konvensjonelle in vivo angiogenese-assays slik som subkutan implantasjon hydrogel er blitt brukt i stor utstrekning for angiogenese forskning 37-39, har disse fremgangsmåter ikke rekapitulere organspesifikk angiogenese. Nylig har en ny metode for å implantere Matrigel i en elastisk mold på musen lunge blitt utviklet og vist å kunne rekruttere blodårer og lunge epitelceller i gels 22. Denne unike tilnærming vil tillate forskere å utforske mekanismen for lunge-spesifikke angiogenese, så vel som interaksjonene mellom blodårer og ikke-vaskulære lungeceller i fysiologiske og patologiske tilstander. Siden 1) Matrigel er ikke egnet for klinisk anvendelse; 2) eLastic formen som brukes til å kaste gelen kan påvirke interaksjonen mellom hydrogeler og verts lungevev og 3) den elastiske formen på lungen potensielt forårsaker forringelse av lungefunksjonen og smerter ved respirasjon, som en mer klinisk relevant tilnærming, en 3D-fibrin-matrise inneholdende angiogene faktorer (vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) / basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF)) har blitt implantert i mus lungen uten støping i den elastiske form, og har med hell rekapitulert vertslungeavledet angiogenese. Fibringel, polymere fibriller generert fra trombin-spaltede fibrinogen, er kjent for å fange en rekke av angiogene faktorer som bFGF og VEGF til å akselerere angiogenese in vivo 40,41. På grunn av sin evne til regenerativ og biologisk nedbrytbar natur 42, fibringel mye brukt innen vevsteknologi.
Denne artikkelen introduserer en ny og unik tilnærming til implantatet fibringel på lunge overflaten av levende adult mus og viser at verts lunge-avledet angiogenese er rekapitulert inne i gels in vivo. Denne metoden, som gjør det mulig for forskere å studere lunge-spesifikke angiogenese, vil sannsynligvis føre til utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for ulike typer av lungesykdommer og betydelig videre anstrengelser for å kunne regenerere voksen lunge.
Denne artikkelen introduserer en ny metode for å implantere biomaterialer på lunge overflaten av levende voksen mus. Med dette systemet blir vertslungeavledet angiogenese hell rekapitulert inne i materialet. Dette systemet gjør det mulig for forskere å utforske krysstale mellom endotelceller, andre celler (f.eks, epitelceller, mesenchymale celler, immunceller) og ulike ECM-komponenter som er nødvendige for lokal angiogenese 50-53 og alveolar regenerering 24,54. Selv om konvensjonell <…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), og Boston Children Hospital fakultet Karriereutvikling Fellowship (TM, AM). Forfatterne takker Amanda Jiang og Elisabeth Jiang for teknisk assistanse.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
20G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
Antibody against SP-B | Millipore | AB40876 | Immunohistochemistry |