Summary
الدماغ هو موقع فريد من نوعه مع الصفات التي ليست ممثلة تمثيلا جيدا من قبل في المختبر أو التحليلات خارج الرحم. نماذج الماوس مثلي مع الموقع ونمو الخصائص استنساخه يمكن إنشاء موثوق مع الحقن داخل الجمجمة باستخدام أداة تثبيت التجسيمي وانخفاض ضغط ضخ حقنة.
Abstract
نماذج ورم مثلي حاليا أفضل طريقة لدراسة خصائص نوع الورم، مع وبدون تدخل، في سياق الحيوانات الحية - وخاصة في المواقع ذات الصفات الفسيولوجية ومعمارية فريدة مثل الدماغ في المختبر ونماذج خارج الرحم لا يمكن. تشكل ميزات مثل الأوعية الدموية، حاجز الدم في الدماغ، والتمثيل الغذائي، والتسليم المخدرات وسمية، ومجموعة من العوامل الأخرى ذات الصلة. نماذج مثلي لها حدودها أيضا، ولكن مع الخلايا السرطانية الأسلوب السليم من الفائدة يمكن المغروسة بدقة في الأنسجة أن معظم كثب الأوضاع في يحاكي الدماغ البشري. من خلال توظيف الأساليب التي توفر كميات قياسها بدقة للتعرف بدقة المواقع بمعدل ثابت والضغط، ونماذج الماوس من أورام الدماغ مع معدلات نمو متوقعة يمكن إنشاء بتكاثر ومناسبة لتحليل موثوق التدخلات المختلفة. بروتوكول الموصوفة هنا يركز على الشركة المصرية للاتصالاتالتفاصيل chnical تصميم والتحضير لحقنة داخل الجمجمة، وإجراء عملية جراحية، وضمان نمو الورم ناجحة وقابلة للتكرار ويوفر نقطة الانطلاق لمجموعة متنوعة من الظروف التي يمكن تخصيصها لمجموعة من نماذج مختلفة ورم في المخ.
Introduction
دراسات في المختبر من خلايا ورم في المخ لا تقدر بثمن للتشريح الآليات الجزيئية دفع عجلة النمو والبقاء، والهجرة، وغزو الخلايا السرطانية. يمكن التجارب خلايا مستنبتة تحديد مسارات إشارات توحي الأهداف العلاجية المحتملة، وتميز استجابة الخلايا للعلاج بالعقاقير. ولكن في المختبر أنظمة بعيدة مبسطة جدا التنبؤ تجاوب عضوي إلى المستحضرات الصيدلانية؛ أنها تفتقر إلى التفاعلات الفسيولوجية، والاستجابات المناعية، المكروية الخلية، وعدم التجانس الكلي للأنظمة الحية الحيوانية. المهندسة وراثيا نماذج لا تقدر بثمن، عندما متاحة، ولكن توجد اختلافات بين الأنواع الجزيئية والخلايا الفئران قد لا ألخص الأحداث في العمليات الإنسانية، مما أدى إلى اختلافات كبيرة عند مقارنة النماذج الحيوانية إلى الملاحظات السريرية 1. نماذج طعم أجنبي الماوس تنطوي تحت الجلد (SQ) حقن خطوط الخلايا ورم الدماغ تحت الجلد من الجهة سهلة لأداءوالتدبير؛ أنها يمكن أن تستخدم لمعالجة آثار التعديل الجيني وإدارة المخدرات / تسليم، والتمثيل الغذائي وسمية. عيوب كبيرة، ومع ذلك، يحد من فائدة نماذج SQ. المكروية لا ألخص ذلك من ورم في المخ التي تحدث بشكل طبيعي: التفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا والأنسجة. الأوعية الدموية المحلية، وعوامل أخرى لا تعد ولا تحصى فريد إلى الدماغ لا يمكن تكرارها. لإعادة إنتاج أكثر دقة الوسط فريد من ورم في المخ التي تحدث بشكل طبيعي واختبار تأثير التدخلات الصيدلانية، ينبغي أن تستخدم نموذجا مثلي الماوس. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقنيات مثلي كجزء من نهج المعدلة وراثيا التي الخلايا غير السرطانية الأولية الإنسان (التفريق أو السلف) والمعدلة وراثيا وتحقن في الموقع المناسب من الماوس، مع أو بدون خلايا الإنسان سدى، مما أدى إلى تكون الأورام شبيهة بتلك التي شوهدت في البشر 1.
توضح هذه المقالةمنهجية لبدقة وبتكاثر خلق أورام المخ في الفئران. باستخدام هذه التقنية، يمكن للمستخدم حقن بدقة قسامة صغيرة من الخلايا علقت في مكان محدد من المنطقة الجبهي الصدغي الجداري من الماوس القشرة الدماغية. وفيات الماوس منخفضة للغاية. في أيدينا، وقتل أي الفئران من المضاعفات الجراحية بعد 185 إجراءات. يمكن مقارنة خصائص الورم الناتج مع أن الأورام السريرية البشرية نموذجية. على سبيل المثال: سرعة النمو، ودرجة نخر ومدى الغزو، عدم تجانس نوع من الخلايا، ووجود خلايا الإنقسامية، علامات الانتشار وموت الخلايا المبرمج، الخ خطوط الخلايا أو الأنسجة أو ورم العينات البشرية مصنفة ومن ثم يمكن تقييمها على أساس قدرتهم لمحاكاة السريرية الفعلي. المستحضرات الصيدلانية، واختيارهم بناء على أدائهم في زراعة الخلايا، يمكن اختبارها في سياق عملية التمثيل الغذائي سير، ونظام الدورة الدموية، وحاجز الدم في الدماغ لأنها موجودة في خفة دم الحيوان مثقلةهكتار الورم، وكلها في سياق المعمارية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المختارة للحقن يمكن تعديلها وراثيا لتحقيق تأثير الطرح أرضا معينة، والحذف، ضرب الإضافية، والطفرات، وما إلى ذلك على نمو الورم والبقاء على قيد الحياة.
وهناك عدد من المنشورات توثيق الأورام الدراسات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات داخل الجمجمة. يامادا وآخرون قاموا بدراسة مفصلة للحقن صبغة والخلايا U87، ووجدت أن التقليل من حجم وحقن معدل إنتاج أفضل الورم 2. . بروكس وآخرون جدت استنساخ متفوقة والكفاءة باستخدام محقن المعالجات الدقيقة التي تسيطر عليها بدلا من الطريقة اليدوية لتسليم ناقلات فيروسية. استنتاجاتهم بشأن المعلمات حقن المثلى هي التي تنطبق على تسليم خلية 3. Shankavaram آخرون أظهرت أن ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) خطوط الخلايا حقن orthotopically (باستخدام الطريقة اليدوية) في الدماغ لخص الشخصى التعبير الجيني للCLالأورام inical بشكل أوثق من أي في المختبر أو SQ xenografts، ودعم استخدام نماذج داخل الجمجمة عن الدراسات قبل السريرية 4. جيانيني وآخرون. حقن الخلايا من العينات الجراحية الإنسان التي كانت قد لحقت في جنباته من الفئران عارية من الركض التسلسلي في أدمغة الفئران إضافية، وأظهر أن هذا النهج الحفاظ على المريض تغيرات الجينات السرطانية في النموذج 5. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة من قبل يي وآخرون 6. باستخدام الإعداد التجسيمي، موقع الحقن محددة بعناية، ومعدل الحقن بطيئا ومطردا، التي حصلوا عليها أورام الدماغ استنساخه مع معدلات نمو ثابتة وعالية (100٪) نسبة engraftment. ولذلك فقد تم راسخة في صحة هذه التقنية. ويشير البحث إلى أن الأدب تطبيقات هذه التقنية واسعة النطاق. كارتي وآخرون. تستخدم الحقن داخل الجمجمة لتسليم بنجاح ناقلات فيروسية التعبير عن الجينات العلاجية إلى القشرة الأمامية من transgeniج نموذج من مرض الزهايمر 7. تقي وآخرون وصفت استخدام الحقن داخل الجمجمة لتقديم اتش العلاجي في حال الورم العصبي الخلايا الجذعية الناقل مقرها في الفئران عارية تحمل بالفعل أورام GBM حقن orthotopically 8. بوضوح، والحقن داخل الجمجمة هي أداة مرنة وفعالة للأبحاث ما قبل السريرية. تصف منشورات سابقة في مجلة التجارب تصور النهج الأساسية 9-11، ولكن نأخذ مفهوم حقن الورم داخل القحف والنمذجة مثلي إلى مستوى أعلى من الدقة باستخدام سهلة لإتقان التكنولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض جميع الإجراءات الموضحة وافقت لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية لدينا.
1. خطة التجربة
- اختيار الخلايا ليتم حقنه. الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر المرشحين للحقن: ملتصقة خطوط ثقافة الخلية، استنساخ المعدلة وراثيا، وخلايا neurosphere والثقافات الأولية، أو الأورام مفصلة. ونوع النموذج المطلوب تحديد الموقع الأنسب للحقن.
- تحديد عدد الخلايا للحقن. يختلف عدد الخلايا المطلوبة لتشكيل الأورام مع خط الخلية ويجب أن تحدد تجريبيا. معدل نمو الورم يعتمد بشكل كبير على نوع من الخلايا، وعدد الخلايا زراعة الأنسجة عدد مرور. أعداد الخلايا تتراوح بين 1 × 04-2 أكتوبر × 10 5 أو أكثر في حقن أنتجت الأورام متفاوتة معدلات النمو.
- الحد من حجم للحقن. ينبغي وقف الخلايا في حجم أصغر من وسائل الإعلام الحرة المصل أو الفوسفات مخزنة قألين (PBS) التي تسمح لسلسة، المقطع من السهل من خلال إبرة 26 G. أصغر حجم تسليمها فعلا في الدماغ، تعريف أكثر دقة وورم الناتجة عن ذلك؛ ويتم الحصول على أفضل النتائج من خلال ضخ كميات تتراوح من 3 إلى 6 ميكرولتر. تخطط لإعداد الحجم الكلي النهائي لا يقل عن 50 ميكرولتر من الخلايا مع وقف التنفيذ، بغض النظر عن عدد الحقن المخطط لها، للسماح القياس الدقيق والخلط وأخذ العينات.
- اختيار الفئران المناسب للنموذج. نماذج الفئران من الأورام البشرية تستخدم عادة للخطر الفئران الشابة المناعة لتفادي الرفض المناعي بوساطة الكسب غير المشروع. ليس من الضروري لعمل لتأخذ مكان في خزانة السلامة البيولوجية إذا اتخذت الاحتياطات المناسبة، بما في ذلك التطهير، التطهير، والتعقيم للمواد والمعدات. تم إنجاز العمل هو موضح هنا في الفئران عارية athymic، من الذكور والإناث، وبين 6 و 12 أسابيع من العمر. الفئران التي تزن أقل من 20 غراما يمكن أن يكون صعبا لوضع على وإطار tereotaxic وربما يكون أكثر عرضة لانخفاض حرارة الجسم.
2. تجميع معدات
- الحصول على وتطهير ماوس إطار التجسيمي، وحدة التحكم المحاذاة، والتخدير الغاز الماوس حامل الرأس، مضخة محقنة مكروية، وسادة الحرارة، آلة التخدير، والألياف البصرية مصباح العمل، ومتغيرة السرعة الحفر الدوار. تنظيف وتطهير جميع المعدات.
- برمجة المعلمات حقن (بما في ذلك حجم الحقن، ومعدل، وحدة حال، نوع تدفق الحقنة) والمتغيرات الأخرى اللازمة لتشغيل ضخ حقنة. تحسين الإعدادات لكل نموذج معين.
ملاحظة: في هذه الحقن كانت الإعدادات 3،000 عينات NL بمعدل 400 نيكولا لانغ / دقيقة (وحدات معدل "M") باستخدام حقنة 25 ميكرولتر (نوع الجهاز "E") واسطة في غير مجمعة ("N"). - تنظيف محقنة مكروية الدقة مع 26 G إبرة مع العديد من يشطف من الماء منزوع الأيونات معقمة (DIH 2 O) و 70٪ من الإيثانول (ETOH)، القيام ري النهائيNSE مع DIH 2 O. بعض وليس كل النماذج مصممة ليتم تعقيمها. تأكد من أن حركة المكبس على نحو سلس وحرة.
- الحصول على معدات تسليم التخدير. الأيزوفلورين هو المخدر المفضل لأنه من السهل لتنظيم عمق ومدة التخدير. تأكد من أن تم تجهيز وحدة التجسيمي مع مرفق غاز التخدير الماوس وأن الأنابيب والموصلات اللازمة في مكانها الصحيح لتقديم خليط الغاز من جهاز التخدير على الماوس.
- الأدوات الجراحية الأوتوكلاف، بما في ذلك مقص غيض غرامة، وهما ملقط / المرقأة (مع أسنان) للخياطة، مقص المتوسطة الحجم، ملاقط المتوسطة ويميل غرامة، واثنين على الأقل من 1 ملم بت حفر الأسنان. إبقاء أدوات نظيفة أثناء إجراء مع 70٪ ETOH، مطهر، أو حبة تعقيم.
- الحصول الأيزوفلورين، مسكن، مرهم العيون / زيوت التشحيم، مرهم مضاد حيوي، المالحة، و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2)، مطهر، والشمع العظام (الرغبة) منالعرض البيطري أو الطبية. إعداد عقيمة DIH 2 O و 70٪ ETOH. يتم تصنيف المستهلكات مثل منصات الشاش والضمادات المعقمة، الغرز، ومسحات الايثانول، ومسحات القطن ذات الرؤوس، والقفازات الجراحية المعقمة، شفرات الجراحية وأكثر في قائمة المواد. يجب تطهير علامة دائمة تلميح الجميلة لوسم الجمجمة ومكرسة للاستخدام الجراحي.
3. إعداد الخلايا لحقن
- في التجارب هو موضح هنا، حدد خط الخلية GBM البشري خلد. تحديد عدد الخلايا (2 × 10 5) وحجم تعليق ليتم حقنه (3 ميكرولتر) تجريبيا. قد تختلف التفاصيل مع نوع من الخلايا. استخدام حجم لا يقل عن 50 ميكرولتر لتسهيل قياس دقيقة، والاختلاط، والحقن.
- يعرض للتريبسين الخلايا و resuspend في وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني. تنفيذ الخطوات التالية فقط قبل حقن الخلايا:
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا عن طريق الطموح وشطف مع 10 مل PBS لكل 100 ملم وحة؛ إزالة برنامج تلفزيوني.
- الإعلاند 1 مل التربسين لكل 100 ملم لوحة واحتضان في RT فترة طويلة بما يكفي لانتاج تعليق خلية واحدة.
- وقف النشاط التربسين مع 5 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لكل 100 ملم لوحة.
- خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج و resuspend في 5 مل ~ المصل DMEM مجانا (SF-DMEM) لكل 100 ملم لوحة.
- عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي.
- ضبط كثافة الخلية الحية إلى 2 × 10 5 خلية / 3 ميكرولتر (أو على النحو الذي يحدده التجريب) التكوير بواسطة الخلايا وإعادة التعليق في SF-DMEM.
- إبقاء خلايا المبردة على الجليد أو حزمة البرد (لا تسمح للخلايا لتجميد). المزيج بلطف بواسطة الإصبع عبها.
4. تخدير وإعداد ماوس لجراحة
- لحث على التخدير باستخدام ~ 5٪ الأيزوفلورين (تدفق الأوكسجين ~ 2 لتر / دقيقة) أو حسب توجيهات الطبيب البيطري. الحث يجب أن تأخذ 2 إلى 3 دقائق. الحفاظ على الماوس في عمق كافالتخدير مع ~ 3٪ الأيزوفلورين.
- تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميه، وضبط الأيزوفلورين إذا المشار إليها ومواصلة رصد التنفس واستجابة قرصة اصبع القدم في جميع أنحاء الداخلي. تغطية الماوس مع منصات الشاش للدفء ورصد الماوس بانتظام طوال الإجراءات، التي قد تستغرق 45 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على معدل الحقن.
- ضع الماوس في إطار التجسيمي عن طريق تحريك بعناية شريط الحنك على اللسان وداخل الفم. ربط القواطع الأمامية في حفرة الأسنان. استخدام القضبان الأذن لتحقيق الاستقرار في الرأس، مع سطح الأذن إلى العين أقرب وقت ممكن الأفقي. لا قوة القضبان في قناة الأذن. فمن الأهمية بمكان أن موقف رئيس أمان: تحقق الحركة جنبا إلى جنب، ويصل وأسفل بلطف بأطراف الأصابع. استخدم عناصر التحكم للتعديل وحدة التجسيمي لتحسين لياقتهم.
- تليين العينين مع مرهم للعين. تنظيف الجلد بين الأذنين والعينين مرتين بالتناوب مع التطبيقات من بوفيدون iodinالبريد مطهر و 70٪ ETOH.
- حقن تحت الجلد اختيار مسكن (SQ) في الجناح (أو حسب توجيهات).
5. تنفيذ حقن
- تحديد موقع الحقن. قد تختلف موقع الحقن مع حجم وسلالة من الماوس ونوع من الخلايا. حقن الخلايا قريبة جدا من البطينين قد يؤدي إلى انتشار القحف الشوكي من المرض. حقن الخلايا ضحلة جدا قد ينمو من خلال المسار الإبرة.
ملاحظة: في هذه التجارب هو موضح هنا، تم تعريف الهدف على المنطقة الأمامية من القشرة المخية موقع 2.5 ملم الجانبي (يمين)، وقد تم اختيار 1.5 ملم الأمامي، و 3.5 ملم بطني فيما يتعلق bregma (الشكل 1)، وإنتاج ورم في الدماغ المتوسط في الفئران تتراوح بين 20 إلى 30 غراما. - إجراء شق صغير (~ 8 ملم طويلة) باستخدام تقنية معقمة من خلال الجلد من الرأس لفضح bregma وموقع الحقن. وهناك قطع قطري، من وجهة نظر بين محور خط الوسط والعين اليمنى باتجاه الأذن اليمنى (
- سحب الجلد واستخدام ممسحة قطنية معقمة لتجفيف سطح الجمجمة. وصمة عار العظام مع مسحة أخرى مبلل مع H 2 O 2 إلى تصور bregma. وH 2 O 2 سوف تنتج فقاعات الأكسجين، وترك خطوط رقيقة من الرغوة البيضاء على طول الغرز الاكليلية والسهمي التي تتقاطع في bregma.
- قفل حقنة فارغة مع إبرة على micropump والمناورة غيض من الإبرة مباشرة على bregma. مجموعة الإحداثيات على وحدة محاذاة إلى 0.0 ملم الجانبية، 0.0 ملم الأمامي / الخلفي، و 0.0 ملم بطني / الظهرية.
- تحريك الإبرة إلى 2.5 ملم الجانبية (يمين) و 1.5 ملم الأمامي فيما يتعلق bregma (أو الموقع المطلوب) باستخدام المقابض السيطرة على وحدة التجسيمي. رفع حقنة قليلا وعلامة على المكان المحدد على الجمجمة مع مخصص قلم فلوماستر. إذا كان السطح الخارجي للجمجمة وليس على متن طائرة مستوى مع bregma (ط.ه.، الظهرية / بطني تنسيق لم يعد يقرأ صفر)، إعادة تعيين بطني / الظهرية القراءة ل0.0 للتأكد من أن عمق الحقن لا تحول.
- حفر ثقب صغير في الجمجمة مع حفر دوارة باليد تجهيزه مع طرف العقيمة الأسنان في الموقع المناسب ملحوظ مع القلم في الخطوة 5.5. عقد حفر في زاوية في الجمجمة ولمس بلطف شديد غيض حتى العظم. كرر حسب الحاجة. حفر تقريبا ولكن ليس بشكل كامل من خلال العظام، وترك إبرة لاختراق هذه الطبقة في الواقع من الجمجمة، والنتائج في أنظف الحقن.
- إزالة الغبار العظام مع مسحة القطن المبلل في برنامج تلفزيوني أو المالحة. العودة المحقنة إلى مضخة وخفض إبرة رأسا إلى أسفل إلى ثقب لدغ لتأكيد مكان. إذا لم يتم توسيط ثقب لدغ مع الإبرة، استخدم الحفر للتكبير الافتتاح.
- المزيج بلطف تعليق الخلية واستخلاص الخلايا في حقنة باستخدام وحدة تحكم مضخة. تجنب فقاعات وكتل ومسح الطرافة إبرةح مسحة الكحول لإزالة الخلايا الملوثة على السطح الخارجي. إذا تم انسداد الحقنة / الإبرة أو المجمدة، وإزالة بسرعة ونظيفة مع الماء المعقم و 70٪ ETOH.
- خفض الإبرة إلى مستوى سطح الجمجمة (0.0 ملم بطني / الظهرية). ثم ببطء (أكثر من حوالي 1 دقيقة) خفض إبرة ليخترق من خلال سمك كامل من الجمجمة والدماغ اختراق حتى عمق 4 مم ventrall. سحب الإبرة ببطء إلى 3.5 ملم بطني. إذا تم عقد رئيس الماوس بشكل آمن في وحدة التجسيمي، ينبغي أن يكون هناك تقريبا أي حركة الجمجمة.
- تأكد من أن يتم إدخال المعلمات الصحيحة إلى وحدة تحكم مضخة (القسم 2.2) ثم اضغط على "RUN / STOP" (أو حسب توجيهات دليل المنتج) إلى autoinject الخلايا. مراقبة الماوس وضبط الأيزوفلورين إذا المشار إليها. مشاهدة الحقنة والتأكد من أن المكبس يتحرك في برميل. حركة المجمدة أو المسدودة يمكن أن يؤدي إلى عازمة / كسر الغطاس.
- الانتظار 1-2 دقائق مع الإبرة في بالمطر، ثم ببطء شديد (أكثر من 3 إلى 4 دقيقة) سحب الإبرة من الأنسجة. الزمن الكلي لإزالة الإبرة بعد حقن اكتمال هو 5 دقائق. استخدام مسحة القطن وصمة عار في محيط الحفرة لدغ. ترك حواف من الجلد مفتوحة للسماح العظام لتجف.
- إزالة حقنة من المضخة وشطف بسرعة 3X مع H 2 O معقمة، 3X مع ETOH 70٪، و3X مع H 2 O معقمة (أو حسب توجيهات صانع). مسح الإبرة مع ETOH وتوضع جانبا.
- تطبيق الشمع العظام معقم (ما يعادل 1 أو 2 ميكرولتر) إلى الحفرة واستخدام لدغ نهاية خشبية من قطعة قطن معقمة لاحش الشمع على وفي العظام. إذا تجفف السطح على نحو كاف، وينبغي أن عصا.
- نشر ثنى العقيمة عبر منطقة عمل الماوس والمحيطة وخياطة الجرح. يجب أن تكون ثلاث غرز كافية. بدلا من ذلك، يمكن استخدام لاصق جراحي. تطبيق المضادات الحيوية الموضعية.
- تقليل الأيزوفلورين إلى 0٪ وإزالة الماوس من وحدة التجسيمي، ويجري جareful لحماية الأسنان. تحقق الأذنين والفم واللسان.
- مراقبة الماوس بعد الحقن عن كثب. مكان الماوس على وسادة الحرارة لمدة 5 إلى 10 دقيقة. ثم نقل إلى قفص (على لوحة الحرارة) ومراقبة حتى يستيقظ الفأر هو والمتنقلة. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه يكفي للحفاظ على رقود القصية. لا عودة الماوس للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. النظر في استخدام مسكن إضافي إذا لاحظت علامات الألم.
6. إنهاء ورصد الانتعاش والتنمية ورم
- تنظيف جميع الأدوات والمعدات التي تستخدم ETOH 70٪، وحبة معقمة أو مطهرة بين الفئران.
- مراقبة الفئران المحقونة لمدة يومين بعد العملية لعلامات الألم أو عدوى أو مضاعفات أخرى. حقن مسكنة في 24 و 48 ساعة (أو أشار عليه السلام) بعد الإجراء. إزالة الغرز في 7 إلى 10 يوما، إذا لزم الأمر.
- تقييم الفئران لعلامات سريرية للمرض، الشللق، وانخفاض النشاط، وفقدان الوزن، والمضبوطات، أو المرض العام.
- مراقبة تطور الورم عن طريق الطريقة المناسبة [التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وأنظمة التصوير فيفو (IVIS)، إلخ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إنشاء xenografts داخل القحف موثوق بها مع هذه التقنية وصفها. وتحديد الهياكل الحرجة من الجمجمة الماوس (الشكل 1) السماح للاعتراف bregma وتوجيه المحققين إلى موقع الحقن الدقيق وقابلة للتكرار. في هذه الدراسات خط الوالدين U251، U251 خلايا transfected مع وسيفيراز (U251 لوك)، أو U87 تخليد علقت خلايا زراعة الأنسجة GBM الإنسان في 4-6 ميكرولتر من SF-DMEM وضخت 2.5 ملم الجانبي (يمين)، و 1.5 ملم الأمامي ، و 3.5 ملم بطني فيما يتعلق bregma (الشكل 2).
الأورام الناتجة يمكن تصور وتحليلها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI، الشكل 3)، في الجسم الحي الانارة التصوير (IVIS، الشكل 4)، أو تقنيات علم الأمراض الجسيمة الروتينية (H & E تلطيخ، الشكل 5). يجب اتخاذ عناية خاصة وتحسين أداء لتحديد appropriaخلايا الشركة المصرية للاتصالات وموقع حقن لتمثيل توقيت، ومعدل النمو، ونموذج الورم المطلوب.
ويوضح الشكل 1. تشريح الجمجمة. الملامح التشريحية للرئيس الماوس والجمجمة. وbregma، التي تقع على محور خط الوسط بين العينين والأذنين عند تقاطع للالاكليلية والغرز السهمي، ويستخدم لتحديد إحداثيات بتكاثر الحقن.
الشكل 2. شق وخريطة الحقن. يتم توضيح الميزات المستخدمة لتحديد شق الجلد وبدقة تحديد موقع الحقن. يتم إجراء شق مائل للسماح بالوصول إلى كل bregma وموقع الحقن. تطبيق 30٪ H 2 O 2 على سطح الجمجمة تساعد على تصور الغرز الجمجمة. ضع المحاقن مع إبرة على micropump والمناورة طرف الإبرة مباشرة على bregma. مجموعة الإحداثيات على وحدة محاذاة إلى الصفر. ثم يتم إجراء جميع القياسات الجمجمة بتكاثر فيما يتعلق bregma.
الرقم 3. الأورام طعم أجنبي داخل الجمجمة التمثيلية: صور الرنين المغناطيسي MRI T2 الصور المرجح لورم مشتقة من (A) 2 × 10 5 خلايا U87 مقارنة مع ورم مشتقة من (B) 2 × 10 5 خلايا U251. مجلدات (C) ورم المحسوبة من صور الرنين المغناطيسي من ثلاثة الفئران الفردية حقنها بخلايا U251 تآمر مع مرور الوقت تظهر نافذة استنساخه التنمية الورم والنمو التي تنسجم في جميع التجارب.
ه = "دائما"> 
الرقم 4. الأورام طعم أجنبي التمثيلية: صور IVIS. IVIS صورة U251-luciferase المراسل transduced خلايا GBM حقنه في الفئران عارية intracranially (A). تم حقن الماوس على اليسار بنجاح كما هو موضح مع خلايا U251 لوك ويظهر إشارة مبؤرة (الفوتونات / ثانية) قوي جدا في الموقع المطلوب. الماوس على اليمين يدل على نتيجة ناجحة من موقع الحقن غير لائق. كشفت H & E فحص العمود الفقري نمو الخلايا السرطانية في العمود الفقري الناتجة عن حقن قريبة جدا من خط الوسط مع نشر البطين. ويقدر (B) حجم الورم من النشاط وسيفيراز (الفوتونات / الثانية) في منطقة الدماغ من الفائدة، تآمر مع مرور الوقت. الخط الأزرق يتوافق مع الماوس مع الحقن داخل الجمجمة ناجحة، في حين أن الخط الأحمر يتوافق مع الفأر مع نزوح الخلايا السرطانية في العمود الفقري.
الشكل 5. H & E الأورام طعم أجنبي داخل الجمجمة. تم جمع أدمغة الفئران كلها من مرحلة ما بعد التضحية وثابتة في الفورمالين، التي شنت في البارافين، مقطوع وملطخة H & E. وقد اشتق الورم (A) من خلايا U87 GBM ويوضح مساحة النمو كثيفة الورم (الزاوية اليسرى العليا) والمتاخمة أنسجة المخ طبيعية مع الغزو المجهري للخلايا الخبيثة (يمين الزاوية السفلى). اتخذ الورم (B) من قسم من وسط ورم مشتقة من خلايا U251 GBM. قسم يتطابق عن كثب التشريح الغريب مع الخلايا الخبيثة متعددة النوى ينظر في GBM البشري نموذجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج الماوس مثلي من سرطان الدماغ البشري يمكن أن يكون أداة ممتازة لتقييم فعالية العلاجات السريرية، ولكن يجب الحرص على تحسين وضع الخلايا في أنسجة المخ. وقد أظهرت الدراسات أن حجم قسامة المفرطة، تقنية الحقن دون المستوى الأمثل ومعدلات الحقن متسرعة يمكن أن يؤدي إلى التسرب وظهور الخلايا السرطانية في مواقع غير مرغوب فيها (البطينين، والحبل الشوكي، والمناطق الجافية، الخ) والتباين الكبير في حجم الورم 2 (الملاحظات الشخصية ). وجد تحليل لتسليم يحركها المعالجات الدقيقة للعينات noncellular أن استخدام micropump أنتجت تسليم أكثر مبؤرة، وأقل عينة الجزر وتقلب أقل من الطرق اليدوية من الحقن، ونسبت إلى السلس، والتسليم موحدة ومتسقة الضغوط 3. في حين أنه قد يكون تحديا لتكثيف العدد المطلوب من الخلايا في حجم فقط 2 أو 4 ميكرولتر، واستخدام التجسيمي أداة وحدة التحكم محاذاة مكافئuipped مع برمجة المضخة الصغيرة يمكن أن تسفر عن الأورام استنساخه وموثوق بها مع معدلات نمو مماثلة. نموذج طعم أجنبي لا يمكن أبدا أن يكرر حقا المكروية، بدء وتطوير ورم طبيعيا، لا سيما مع المضيفين نقص المناعة، ولكن نموذج مثلي مصممة بشكل جيد وتنفيذها هو أفضل بديل، وهو أعلى بكثير من نموذج خارج الرحم.
والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي إنشاء كشف الأورام ضمن إطار زمني ثابت. توقيت ظهور الورم يعتمد على نوع الخلية وعدد الخلايا المحقونة، ولكن لا يمكن التنبؤ به إلى حد ما، وأنشأت معظم الأورام ضمن إطار ضيق الوقت بالنسبة للمدة من نمو الورم (أي الوقت حتى نقطة النهاية). وهذا يتيح للباحث لتحديد نقاط زمنية لجمع البيانات (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو IVIS) أو التدخل (مثل العلاج من تعاطي المخدرات). معدلات نمو الورم تختلف مع نوع من الخلايا، عدد الخلايا المحقونة، والابام الماوس إلى ماوس (بقدر يفعلون في المرضى من البشر)، ولكن تتفق من تجربة إلى تجربة.
في حين أن هذا البروتوكول يستخدم تقنية التي قد تتطلب المزيد من الأجهزة وقتا أطول من الطرق اليدوية الدقيقة أقل من الحقن وربما لا تكون قابلة للتطبيق على تحقيقات واسعة النطاق، تقنيات الحقن داخل الجمجمة التي تسمح للإنتاجية أعداد كبيرة من الحيوانات (مثل تلك التي وصفها Iwami في وآخرون 12) من خلال تعريف تنطوي السريع، حقن عالي الضغط وغالبا ما تنطوي على الأجهزة المحمولة باليد وقياس دليل، والتي تخضع لعدم الاستقرار وعدم اليقين. قد تترافق هذه العوامل مع التسرب وبعيدا عن الهدف تسليم 2،3. فإن الدقة، واستنساخ، والوفيات منخفضة من هذا الإجراء يسمح للمحقق لتصميم تجارب العلاج باستخدام عدد أقل من الفئران للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية - وفورات صافية.
خطوة واحدة أمر بالغ الأهمية لنجاح زرع الورم: الموقع الدقيق للحقن. حقن الخلايا قريبة جدا من البطينين قد يؤدي إلى انتشار المرض CSF من خلال نظام البطيني أو إلى مناطق خارج القحف. حقن الخلايا ضحلة جدا قد ينمو من خلال المسار الإبرة. الإحداثيات المحددة سلفا هي ذات قيمة تذكر إذا وضع إبرة هو قذرة. يستغرق وقتا طويلا لوضع رئيس الماوس بشكل آمن في وحدة التجسيمي. استخدام خيارات التكيف التجسيمي والحانات الأذن لتناسب المعدات إلى الماوس، وضمان أن يتم وضع الرأس ثابت ولن صخرة أو تحريف أثناء العملية. تغييرات أو الاختلاف إذا كان موقع الحقن قد تؤثر على خصائص الورم، بما في ذلك اتخاذ الورم، والنمو، وإمكانات الغازية، والحصول على إيصال الدواء وامدادات الاوكسجين.
وتشمل العوامل الأخرى التي لها تأثير عميق على الورم الناتج معدل الحقن، وعدد الخلايا والحجم؛ كل شيء يجب أن تحدد تجريبيا. تقليل حجم للكم رقمص الخلايا اللازمة لنمو الورم. استخدام أبطأ معدل حقن العملي. عدد الخلايا وعدد مرور لها أيضا آثار كبيرة على اتخاذ الورم ومعدل النمو. المعدات المتخصصة المستخدمة هنا تقدم تحكم متفوقة، ولكن يمكن تطبيق مفاهيم الحد الأدنى من حجم، والاستهداف الدقيق، والحد الأدنى وثابت معدل الحقن، وبطء سحب الإبرة إلى مجموعة متنوعة من التقنيات (بما في ذلك الحقن اليدوي) ومجموعة متنوعة من الصكوك.
هذا الإجراء مفتوحا لمجموعة متنوعة من التعديلات: يجوز تخصيص موقع الحقن لألخص أنواع معينة من الأورام. الخلايا الملتصقة زراعة الأنسجة، استنساخ المعدلة وراثيا، neurospheres والأورام الماوس مصنفة، أو شظايا الأنسجة البشرية قد المغروسة في مخ الفأر. ربما أن تتكيف هذه التقنية للدراسات noncellular، بما في ذلك نقل الجين الفيروسي 3. مرة واحدة يتم تأسيس طريقة لإنتاج موثوق الأورام من الخصائص المطلوبة، والتجارب التي تقارن وايفيcacy من العلاجات، العلاجات المخدرات ومجموعات، وخيارات أخرى مثل نقل الجينات يمكن أداؤها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويتم تمويل الدكتور كيتينغ بواسطة CA100335 منحة وزارة الدفاع ومؤسسة هو الباحث القديس Baldrick ل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
