Summary
मस्तिष्क में अच्छी तरह से इन विट्रो या अस्थानिक विश्लेषण से प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं कि गुणों के साथ एक अद्वितीय साइट है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थान और विकास विशेषताओं के साथ Orthotopic माउस मॉडल मज़बूती से एक stereotaxic निर्धारण साधन और एक कम दबाव सिरिंज पंप का उपयोग intracranial इंजेक्शन के साथ बनाया जा सकता है.
Abstract
विशेष रूप से इस तरह के मस्तिष्क के रूप में अद्वितीय शारीरिक और वास्तु गुणों के साथ साइटों में इन विट्रो और अस्थानिक मॉडल नहीं कर सकते हैं - Orthotopic ट्यूमर मॉडल एक जीवित जानवर के संदर्भ में, वर्तमान के साथ और हस्तक्षेप के बिना, एक ट्यूमर के प्रकार की विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है. ऐसी वाहिका संरचना, रक्त मस्तिष्क बाधा, चयापचय, दवा वितरण और विषाक्तता, और अन्य प्रासंगिक कारकों में से एक मेजबान के रूप में सुविधाओं के लिए खाते. Orthotopic मॉडल भी अपनी सीमाएं हैं, लेकिन ब्याज की उचित तकनीक ट्यूमर कोशिकाओं को सटीकता से ऊतक में engrafted किया जा सकता है के साथ कि मानव मस्तिष्क में सबसे निकट mimics शर्तों. इसे सही reproducibly बनाया जा सकता है एक सुसंगत दर और दबाव, उम्मीद के मुताबिक विकास दर के साथ मानव मस्तिष्क ट्यूमर के माउस मॉडल पर स्थानों में परिभाषित करने के लिए ठीक मापा मात्रा में देने और विभिन्न उपायों की विश्वसनीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि तरीकों को रोजगार से. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल ते पर केंद्रितchnical सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर के विकास, डिजाइन और एक intracranial इंजेक्शन के लिए तैयारी, सर्जरी प्रदर्शन, और यह सुनिश्चित करने के विवरण और विभिन्न मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि स्थितियों की एक किस्म के लिए शुरू अंक प्रदान करता है.
Introduction
मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं की इन विट्रो अध्ययन में विकास, अस्तित्व, प्रवास, और कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण ड्राइविंग आणविक तंत्र विदारक के लिए अमूल्य हैं; सुसंस्कृत सेल प्रयोगों, रास्ते संकेतन परिभाषित संभावित चिकित्सीय लक्ष्य का सुझाव, और नशीली दवाओं के उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया चिह्नित कर सकते हैं. लेकिन इन विट्रो में सिस्टम दवाइयों को जीवधारी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अभी तक बहुत साधारण हैं; वे शारीरिक प्रतिक्रियाओं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सेल microenvironment, और पशु सिस्टम रहने के समग्र विविधता की कमी है. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल, जब अमूल्य उपलब्ध हो सकता है, लेकिन आणविक मतभेद नैदानिक टिप्पणियों 1 के लिए पशु मॉडलों की तुलना करते समय महत्वपूर्ण विसंगतियों, जिसके परिणामस्वरूप मानव प्रक्रियाओं में घटनाओं की पुनरावृत्ति नहीं हो सकता प्रजातियों और murine कोशिकाओं के बीच मौजूद हैं. पार्श्व की त्वचा के नीचे मानव मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइनों के चमड़े के नीचे (वर्ग) इंजेक्शन शामिल माउस xenograft मॉडल प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैंऔर उपाय; वे जीन संशोधन एवं औषधि प्रशासन / वितरण, चयापचय और विषाक्तता के प्रभाव का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण कमियां है, तथापि, वर्ग मॉडल की उपयोगिता की सीमा. microenvironment एक स्वाभाविक रूप से होने वाली मस्तिष्क ट्यूमर की कि पुनरावृत्ति नहीं करता: विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों की बातचीत; मस्तिष्क के लिए अद्वितीय स्थानीय vasculature, और असंख्य अन्य कारकों नहीं दोहराया जा सकता है. अधिक सही एक स्वाभाविक रूप से होने वाली मस्तिष्क ट्यूमर के अद्वितीय वातावरण प्रतिलिपि और दवा हस्तक्षेप के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, एक माउस Orthotopic मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, Orthotopic तकनीक आनुवंशिक रूप tumorigenesis में जिसके परिणामस्वरूप, के साथ या मानव स्ट्रोमा कोशिकाओं के बिना, संशोधित और एक माउस के प्रासंगिक साइट में इंजेक्ट कर रहे हैं मानव प्राथमिक गैर कैंसर कोशिकाओं (भेदभाव या पूर्वज), जिसमें एक अनुवांशिक इंजीनियर दृष्टिकोण के भाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इसी तरह मनुष्य 1 में देखा.
इस लेख का वर्णनएक कार्यप्रणाली ठीक और reproducibly चूहों में मस्तिष्क ट्यूमर बनाने के लिए. इस तकनीक का उपयोग करना, उपयोगकर्ता इसे सही माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के fronto-parieto लौकिक क्षेत्र की एक निर्दिष्ट स्थान में निलंबित कोशिकाओं के एक छोटे से विभाज्य इंजेक्षन कर सकते हैं. माउस मृत्यु दर बहुत कम है; हमारे हाथ में है, कोई चूहों 185 प्रक्रियाओं के बाद शल्य जटिलताओं से मृत्यु हो गई है. परिणामी ट्यूमर के लक्षण ठेठ मानव नैदानिक ट्यूमर के साथ तुलना में किया जा सकता है; उदाहरण के लिए: विकास, परिगलन की डिग्री, आक्रमण की हद, सेल प्रकार, mitotic कोशिकाओं की उपस्थिति, आदि प्रसार और apoptosis के मार्कर की विविधता का तेज़ी सेल लाइनों या disaggregated मानव ऊतक या ट्यूमर के नमूने तो उनकी क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है वास्तविक नैदानिक प्रस्तुति अनुकरण. फार्मास्यूटिकल्स, सेल संस्कृति में उनके प्रदर्शन के आधार पर चुना, एक कार्य चयापचय, संचार प्रणाली, और रक्त मस्तिष्क बाधा के संदर्भ में परीक्षण किया जा सकता है कि वे एक जानवर बोझ बुद्धि में मौजूद रूपहा ट्यूमर, एक प्रासंगिक वास्तु संदर्भ में सभी. इसके अलावा, इंजेक्शन के लिए चुना कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से, ट्यूमर के विकास और अस्तित्व पर आदि दस्तक इन, म्यूटेशन, विशिष्ट knockdowns, विलोपन के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
प्रकाशनों की संख्या intracranial विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर ट्यूमर पढ़ाई दस्तावेज़. यामादा एट अल. डाई और U87 कोशिकाओं के इंजेक्शन की एक विस्तृत अध्ययन किया और मात्रा और इंजेक्शन की दर को कम करने का सबसे अच्छा ट्यूमर 2 उत्पादित पाया. . ब्रूक्स एट अल एक माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित इंजेक्टर बजाय वायरल वैक्टर देने के लिए एक पुस्तिका विधि का उपयोग बेहतर reproducibility और दक्षता पाया; इष्टतम इंजेक्शन मापदंडों के बारे में अपने निष्कर्ष सेल वितरण 3 को लागू कर रहे हैं. Shankavaram एट अल. मस्तिष्क में सीएल के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल recapitulated (एक मैनुअल विधि का प्रयोग करके) glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) सेल लाइनों orthotopically इंजेक्शन से पता चला किinical ट्यूमर और अधिक बारीकी से या तो इन विट्रो या वर्ग xenografts में, preclinical अध्ययन 4 के लिए intracranial मॉडल के उपयोग का समर्थन. जियानिनी एट अल. अतिरिक्त चूहों के दिमाग में धारावाहिक passaging द्वारा नग्न चूहों की flanks में निरंतर गया था कि मानव शल्य नमूनों से कोशिकाओं इंजेक्शन, और इस दृष्टिकोण मॉडल 5 में रोगी ट्यूमर जीन परिवर्तन संरक्षित दिखाया. इसी तरह के परिणाम यी एट अल 6 द्वारा सूचित किया गया है. एक stereotaxic स्थापना, ध्यान से परिभाषित इंजेक्शन साइट, और एक धीमी और स्थिर इंजेक्शन दर का उपयोग करना, वे लगातार विकास दर और उच्च (100%) engraftment दर के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मस्तिष्क ट्यूमर प्राप्त की. इस तकनीक की वैधता इसलिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है; एक साहित्य खोज इस तकनीक के आवेदन व्यापक हैं कि पता चलता है. Carty एट अल. सफलतापूर्वक transgeni के ललाट प्रांतस्था में चिकित्सीय जीन व्यक्त वायरल वैक्टर देने के लिए intracranial इंजेक्शन का इस्तेमाल कियाअल्जाइमर रोग 7 सी मॉडल. Thaci एट अल. पहले से ही orthotopically इंजेक्शन जीबीएम ट्यूमर 8 ले जाने नग्न चूहों में एक तंत्रिका स्टेम सेल आधारित वाहक में चिकित्सीय oncolytic adenovirus देने के लिए intracranial इंजेक्शन के प्रयोग का वर्णन किया. जाहिर है, intracranial इंजेक्शन preclinical अनुसंधान के लिए एक बहुमुखी और प्रभावी उपकरण हैं. कल्पना प्रयोगों के जर्नल में इससे पहले प्रकाशनों मौलिक दृष्टिकोण 9-11 का वर्णन है, लेकिन हम आसान करने के लिए मास्टर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर परिशुद्धता के एक उच्च स्तर तक intracranial ट्यूमर इंजेक्शन और Orthotopic मॉडलिंग की अवधारणा ले.
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Protocol
सभी वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1 योजना प्रयोग
- कोशिकाओं चुनें इंजेक्शन जा. पक्षपाती सेल संस्कृति लाइनों, आनुवंशिक रूप से संशोधित क्लोन, neurosphere कोशिकाओं, प्राथमिक संस्कृतियों, या disaggregated ट्यूमर: सूत्रों की एक किस्म से कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए उम्मीदवार हैं. वांछित मॉडल के प्रकार के इंजेक्शन के लिए सबसे उपयुक्त साइट को परिभाषित करेगा.
- इंजेक्शन के लिए सेल नंबर निर्धारित करते हैं. ट्यूमर फार्म के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या सेल लाइन के साथ बदलता रहता है और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए; ट्यूमर के विकास दर सेल प्रकार, सेल नंबर और टिशू कल्चर बीतने संख्या पर काफी निर्भर करता है. 1 एक्स 10 4 से 2 एक्स 10 5 या इंजेक्शन प्रति अधिक से लेकर सेल नंबर अलग विकास दर के ट्यूमर का उत्पादन किया है.
- इंजेक्शन के लिए मात्रा सीमित करें. कोशिकाओं सीरम मुक्त मीडिया या फॉस्फेट बफर है की छोटी मात्रा में निलंबित किया जाना चाहिएएक 26 जी सुई के माध्यम से चिकनी, आसान पारित होने के लिए अनुमति देता है कि Aline (पीबीएस). छोटे मात्रा वास्तव में मस्तिष्क में कर दिया, और अधिक सटीक और जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर परिभाषित; इष्टतम परिणाम 3 से 6 μl लेकर इंजेक्शन संस्करणों से प्राप्त कर रहे हैं. सही माप, मिश्रण और नमूना अनुमति देने के लिए, की परवाह किए बिना योजना बनाई इंजेक्शन की संख्या से निलंबित कोशिकाओं के कम से कम 50 μl के अंतिम कुल मात्रा को तैयार करने की योजना है.
- मॉडल के लिए उपयुक्त चूहों चुनें. मानव ट्यूमर के murine मॉडल आम तौर पर प्रतिरक्षा की मध्यस्थता भ्रष्टाचार अस्वीकृति से बचने के लिए युवा प्रतिरक्षा समझौता चूहों का उपयोग. उचित सावधानियों परिशोधन, कीटाणुशोधन, और सामग्री और उपकरणों की नसबंदी सहित लिया जाता है तो काम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह लेने के लिए के लिए यह आवश्यक नहीं है. यहाँ दिखाए गए काम उम्र के 6 और 12 सप्ताह के बीच, पुरुष और महिला athymic नग्न चूहों में किया गया है. मुश्किल हो सकता है कम से कम 20 ग्राम वजन कि चूहे के रूप में की स्थिति कोऔर tereotaxic फ्रेम हाइपोथर्मिया के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है.
2 उपकरण इकट्ठे
- प्राप्त करें और एक माउस stereotaxic फ्रेम, संरेखण कंसोल, और माउस गैस संज्ञाहरण सिर धारक, microsyringe पंप, गर्मी पैड, संज्ञाहरण मशीन, फाइबर ऑप्टिक काम दीपक, और चर गति रोटरी ड्रिल शुद्ध करना. साफ और सभी उपकरण शुद्ध करना.
- सिरिंज पंप के संचालन के लिए आवश्यक है और अन्य चर (दर, दर इकाइयों, सिरिंज प्रकार प्रवाह, इंजेक्शन की मात्रा सहित) इंजेक्शन मापदंडों कार्यक्रम. प्रत्येक विशेष मॉडल के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित.
नोट: सेटिंग 3,000 नाथन नमूने एक 25 μl सिरिंज (युक्ति प्रकार "ई") गैर समूहीकृत में ("एन") मोड का उपयोग (दर इकाइयों "एम") 400 NL / मिनट की दर से थे इन इंजेक्शनों में. - एक अंतिम आरआई कर रही है, एक बाँझ विआयनीकृत पानी के कई rinses साथ 26 जी सुई के साथ सटीक microsyringe (DIH ओ 2) और 70% इथेनॉल (EtOH) स्वच्छDIH 2 ओ के साथ एनएसई कुछ लेकिन सभी मॉडलों autoclaved तैयार हो रहे हैं नहीं. सवार आंदोलन चिकनी और मुक्त है कि सुनिश्चित करें.
- संज्ञाहरण वितरण उपकरण प्राप्त. यह संज्ञाहरण की गहराई और अवधि को विनियमित करने के लिए आसान है के रूप में isoflurane पसंदीदा संवेदनाहारी है. Stereotaxic इकाई एक माउस संज्ञाहरण गैस लगाव के साथ और आवश्यक ट्यूबिंग और कनेक्टर्स माउस को एनेस्थीसिया मशीन से गैस मिश्रण देने के लिए जगह में हैं कि सुसज्जित है कि सुनिश्चित करें.
- ठीक टिप (दांत) के साथ कैंची, दो संदंश / hemostats suturing के लिए, मध्यम आकार की कैंची, मध्यम और ठीक इत्तला दे दी चिमटी, और कम से कम दो 1 मिमी डेंटल ड्रिल बिट्स सहित आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण,. 70% EtOH, कीटाणुनाशक, या एक मनका अजीवाणु साथ प्रक्रिया के दौरान साफ यंत्र रखें.
- एक से isoflurane, एनाल्जेसिक, नेत्र मरहम / स्नेहक, एंटीबायोटिक मलहम, खारा, 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2), एंटीसेप्टिक, और (यदि वांछित) हड्डी मोम प्राप्तपशु चिकित्सा या चिकित्सा आपूर्ति. बाँझ DIH 2 हे और 70% EtOH तैयार करें. ऐसी धुंध पैड, बाँझ ड्रेसिंग, टांके, इथेनॉल swabs, कपास इत्तला दे दी swabs, बाँझ सर्जिकल दस्ताने, सर्जिकल ब्लेड और अधिक के रूप में disposables सामग्री सूची में अलग अलग रखा जाता है. खोपड़ी अंकन के लिए एक अच्छी टिप स्थायी मार्कर decontaminated और शल्य चिकित्सा उपयोग के लिए समर्पित होना चाहिए.
3 इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार
- यहाँ दिखाए गए प्रयोगों में, एक अमर मानव जीबीएम सेल लाइन का चयन करें. कोशिकाओं की संख्या (2 एक्स 10 5) और अनुभव से इंजेक्शन जा निलंबन की मात्रा (3 μl) निर्धारित; विवरण सेल प्रकार से भिन्न हो सकते हैं. सही मापने, मिश्रण, और इंजेक्शन की सुविधा के लिए कम से कम 50 μl की एक मात्रा का प्रयोग करें.
- मीडिया या पीबीएस में कोशिकाओं और resuspend Trypsinize. सेल इंजेक्शन के लिए बस से पहले निम्न चरणों का पालन:
- आकांक्षा द्वारा कोशिकाओं से मीडिया निकालें और 100 मिमी प्लेट प्रति 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला; पीबीएस को हटा दें.
- विज्ञापनप्रत्येक 100 मिमी प्लेट के लिए डी 1 मिलीलीटर trypsin और एक एकल कक्ष निलंबन उपज अभी काफी लंबा आरटी पर सेते हैं.
- 5 के साथ trypsin गतिविधि को रोकने मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% 100 मिमी प्लेट प्रति भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS).
- 100 मिमी प्लेट प्रति ~ 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त DMEM (एस एफ DMEM) में 450 XG पर centrifugation और resuspend द्वारा गोली कोशिकाओं.
- एक hemacytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना.
- 2 x 10 5 कोशिकाओं / 3 μl को जीवित कोशिका घनत्व समायोजित (या प्रयोग द्वारा निर्धारित) कोशिकाओं pelleting और एस एफ DMEM में resuspending द्वारा.
- बर्फ या एक सर्द पैक (कोशिकाओं फ्रीज करने की अनुमति नहीं है) पर ठंडा कोशिकाओं रखें. उंगली flicking द्वारा धीरे मिलाएं.
4 anesthetize और सर्जरी के लिए माउस को तैयार
- संज्ञाहरण का उपयोग ~ 5% isoflurane (ऑक्सीजन का प्रवाह ~ 2 एल / मिनट) या पशु चिकित्सक द्वारा निर्देशित के रूप में प्रेरित. प्रेरण 2 मिनट से 3 लेना चाहिए. एक पर्याप्त गहराई पर माउस बनाए रखें~ 3% isoflurane के साथ संज्ञाहरण की.
- , पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच संकेत अगर isoflurane समायोजित करने और प्रक्रिया के दौरान सांस लेने और पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी जारी है. गर्मी के लिए धुंध पैड के साथ माउस को कवर किया और इंजेक्शन की दर पर निर्भर करता है, 1 घंटा 45 मिनट का समय लग सकता है, जो प्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से माउस की निगरानी.
- ध्यान से जीभ पर और मुंह में तालू बार फिसलने से stereotaxic फ्रेम में माउस की स्थिति. दांत छेद में सामने incisors हुक. संभव के रूप में क्षैतिज रूप में पास कान करने वाली आंख की सतह के साथ, सिर को स्थिर करने के लिए कान सलाखों का प्रयोग करें. कान नहर में सलाखों के लिए मजबूर न करें. यह सुरक्षित रूप से सिर की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है: उंगलियों के साथ धीरे पक्ष की ओर करने के लिए और ऊपर और नीचे गति की जाँच करें. फिट करने के लिए अनुकूलन stereotaxic इकाई के समायोज्य नियंत्रण का प्रयोग करें.
- नेत्र मरहम के साथ आंखों चिकना. दो बार एक povidone-iodin की बारी अनुप्रयोगों के साथ कान और आंखों के बीच की त्वचा साफई एंटीसेप्टिक और 70% EtOH.
- पार्श्व में चुना एनाल्जेसिक subcutaneously (वर्ग) इंजेक्ट (या के रूप में निर्देशित).
5 इंजेक्शन प्रदर्शन
- इंजेक्शन स्थल निर्धारित करते हैं. इंजेक्शन साइट आकार और माउस के तनाव और सेल के प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं. निलय के करीब इंजेक्शन कोशिकाओं रोग की cranio-रीढ़ की हड्डी में प्रसार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बहुत उथले इंजेक्शन कोशिकाओं सुई ट्रैक के माध्यम से बाहर हो जाना सकता है.
नोट: यहां दिखाए गए प्रयोगों में, लक्ष्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स के ललाट क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया था एक साइट 2.5 मिमी (सही), 1.5 मिमी पूर्वकाल, और शीर्षस्थान के लिए सम्मान के साथ 3.5 मिमी उदर में चुना गया था पार्श्व (चित्रा 1), उत्पादन 20 से 30 ग्राम से लेकर चूहों में एक मध्यमस्तिष्क ट्यूमर. - शीर्षस्थान और इंजेक्शन के स्थल का पर्दाफाश करने के लिए सिर की त्वचा के माध्यम से बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक छोटा सा चीरा (~ 8 मिमी लंबे) बनाते हैं. Midline अक्ष और सही कान की दिशा में सही नज़र (बीच में एक बिंदु से एक विकर्ण कटौती,
- त्वचा वापस लेना और खोपड़ी की सतह सुखाने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें. शीर्षस्थान कल्पना करने के लिए एच 2 ओ 2 के साथ सिक्त एक और झाड़ू के साथ हड्डी दाग. एच 2 ओ 2 शीर्षस्थान पर एक दूसरे को काटना है कि राज्याभिषेक और बाण के समान sutures के साथ सफेद फोम की पतली लाइनों छोड़ने, ऑक्सीजन बुलबुले का उत्पादन होगा.
- MICROPUMP पर सुई के साथ एक खाली सिरिंज लॉक और सीधे शीर्षस्थान पर सुई की नोक पैंतरेबाज़ी; सेट 0.0 मिमी पार्श्व, 0.0 मिमी पूर्वकाल / पीछे, और 0.0 मिमी उदर / पृष्ठीय के लिए संरेखण कंसोल पर निर्देशांक.
- Stereotaxic इकाई पर नियंत्रण knobs का उपयोग 2.5 मिमी पार्श्व (दाएं) और शीर्षस्थान (या इच्छित स्थान) के लिए सम्मान के साथ 1.5 मिमी पूर्वकाल के लिए सुई ले जाएँ. थोड़ा सिरिंज उठाएँ और एक समर्पित महसूस की नोक कलम के साथ खोपड़ी पर सटीक स्थान चिह्नित. खोपड़ी की बाहरी सतह शीर्षस्थान (मैं के साथ एक स्तर विमान पर नहीं है.ई., पृष्ठीय / उदर समन्वय नहीं रह गया, रीसेट) शून्य पढ़ता उदर / पृष्ठीय 0.0 को पढ़ने के इंजेक्शन की गहराई स्थानांतरित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए.
- कदम 5.5 में कलम के साथ चिह्नित उपयुक्त स्थल पर एक बाँझ दंत टिप के साथ outfitted एक हाथ से आयोजित रोटरी ड्रिल के साथ खोपड़ी में एक छोटा सा छेद ड्रिल. खोपड़ी के लिए एक कोण पर ड्रिल पकड़ो और बहुत धीरे हड्डी को टिप स्पर्श. जरूरत के रूप में दोहराएँ. वास्तव में खोपड़ी के इस परत घुसना सुई छोड़ रहा है, हड्डी के माध्यम से लगभग नहीं बल्कि पूरी तरह से ड्रिलिंग, साफ इंजेक्शन में परिणाम है.
- पीबीएस या खारा में सिक्त एक कपास झाड़ू के साथ हड्डी धूल निकालें. पंप के लिए सिरिंज लौटें और स्थान की पुष्टि करने के लिए सीधे नीचे गड़गड़ाहट छेद करने के लिए सुई कम है. गड़गड़ाहट छेद सुई के साथ केंद्रित नहीं है, तो उद्घाटन विस्तार करने के लिए ड्रिल का उपयोग करें.
- धीरे सेल निलंबन मिश्रण और पंप नियंत्रक का उपयोग सिरिंज में कोशिकाओं आकर्षित. बुलबुले और गुच्छों से बचें और सुई बुद्धि पोंछएक शराब झाड़ू घंटे बाहरी सतह पर contaminating कोशिकाओं को हटाने के लिए. सिरिंज / सुई भरा हुआ या जमे हुए है, तो हटाने और बाँझ पानी और 70% EtOH के साथ जल्दी से साफ.
- खोपड़ी की सतह के स्तर को सुई (0.0 मिमी उदर / पृष्ठीय) कम. फिर धीरे धीरे (अधिक लगभग 1 मिनट) खोपड़ी का पूरा मोटाई के माध्यम से बेध और 4 मिमी ventrall की गहराई तक मस्तिष्क घुसना सुई कम है. उदर 3.5 मिमी धीरे धीरे सुई वापस ले लें. माउस सिर stereotaxic इकाई में सुरक्षित रूप से आयोजित किया जाता है, तो खोपड़ी की लगभग कोई आंदोलन नहीं होना चाहिए.
- सही मापदंडों पंप नियंत्रक में प्रवेश कर रहे हैं कि (धारा 2.2) और प्रेस "भागो / बंद करो" की पुष्टि (या उत्पाद का मार्गदर्शन द्वारा निर्देशित) कोशिकाओं autoinject लिए. माउस मॉनिटर और संकेत दिया कि अगर isoflurane समायोजित. सिरिंज देखो और सवार बैरल में घूम रहा है कि यह सुनिश्चित करें. जमे हुए या भरा हुआ आंदोलन एक तुला / टूट सवार में परिणाम कर सकते हैं.
- बी में सुई के साथ 2 मिनट के लिए 1 रुकोबारिश, तो बहुत धीरे धीरे (3 से 4 मिनट से अधिक) के ऊतकों से सुई वापस ले लें. इंजेक्शन पूर्ण होने के बाद सुई निकालने के लिए कुल समय 5 मिनट है. गड़गड़ाहट छेद के आसपास के क्षेत्र दाग को एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें; हड्डी शुष्क करने की अनुमति के लिए खुला त्वचा के किनारों को छोड़ दें.
- पंप से सिरिंज निकालें और जल्दी से 70% EtOH के साथ, बाँझ एच 2 ओ के साथ 3x 3x कुल्ला, और बाँझ एच 2 ओ के साथ 3x (या निर्माता द्वारा निर्देशित). EtOH के साथ सुई साफ कर लें और अलग निर्धारित करें.
- गड़गड़ाहट छेद करने के लिए (1 या 2 μl के बराबर) बाँझ हड्डी मोम लागू करें और पर और हड्डी में मोम कूटना करने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू से लकड़ी के अंत का उपयोग करें. सतह पर्याप्त रूप से सूख जाता है, यह रहना चाहिए.
- माउस और आसपास के कार्य क्षेत्र से अधिक बाँझ कपड़ा बिखरा हुआ है और चीरा टांका; तीन टांके पर्याप्त होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, शल्य चिकित्सा चिपकने वाला इस्तेमाल किया जा सकता है. एक सामयिक एंटीबायोटिक लागू करें.
- 0% करने के लिए isoflurane में कमी और सी जा रहा है, stereotaxic इकाई से माउस को दूरदांत की रक्षा के लिए areful. कान, मुंह और जीभ की जाँच करें.
- बारीकी से इंजेक्शन के बाद माउस मॉनिटर. 5 मिनट 10 के लिए एक गर्मी पैड पर जगह माउस; तो (गर्मी पैड पर) पिंजरे को हस्तांतरण और माउस उठता है और चल रहा है जब तक निरीक्षण करते हैं. यह sternal लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक माउस नायाब मत छोड़ो. पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए माउस वापस नहीं करते. दर्द के लक्षण देखा जाता है तो अतिरिक्त एनाल्जेसिक के उपयोग पर विचार करें.
6 समाप्त करें और मॉनिटर वसूली और ट्यूमर के विकास
- 70% EtOH, चूहों के बीच एक मनका अजीवाणु या कीटाणुनाशक का उपयोग स्वच्छ सभी उपकरणों और उपकरणों.
- दर्द, संक्रमण या अन्य जटिलताओं के संकेत के लिए प्रक्रिया के बाद दो दिनों के लिए इंजेक्शन चूहों मॉनिटर. प्रक्रिया के बाद 24 और 48 घंटे (या संकेत के रूप में) में एनाल्जेसिक इंजेक्षन. यदि आवश्यक हो तो, 7 से 10 दिन में टांके निकालें.
- रोग, paralysi के नैदानिक लक्षण के लिए चूहों का मूल्यांकनएस, वजन घटाने, दौरे, या सामान्य बीमारी गतिविधि की कमी हुई.
- [Vivo इमेजिंग सिस्टम में चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), (IVIS), आदि] उचित विधि से ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के.
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Representative Results
विश्वसनीय intracranial xenografts यह वर्णित तकनीक के साथ बनाया जा सकता है. माउस खोपड़ी की महत्वपूर्ण संरचनाओं (चित्रा 1) की पहचान शीर्षस्थान की मान्यता के लिए अनुमति देते हैं और एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इंजेक्शन स्थान पर अन्वेषक मार्गदर्शन करेंगे. इन अध्ययनों में U251 पैतृक लाइन, luciferase (U251 ल्यूक), या U87 साथ ट्रांसफ़ेक्ट U251 कोशिकाओं मानव जीबीएम टिशू कल्चर कोशिकाओं एस एफ DMEM के 4 से 6 μl में निलंबित कर दिया गया अमर और 2.5 मिमी (दाएं) पार्श्व, 1.5 मिमी पूर्वकाल इंजेक्शन , और शीर्षस्थान के लिए सम्मान के साथ 3.5 मिमी उदर (चित्रा 2).
जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर कल्पना और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई, चित्रा 3), इन विवो luminescent इमेजिंग (IVIS, चित्रा 4), या दिनचर्या सकल पैथोलॉजी तकनीक (एच ई धुंधला हो जाना, चित्रा 5) से विश्लेषण किया जा सकता है. विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए और अनुकूलन appropria निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन कियाते कोशिकाओं और इंजेक्शन के स्थान इच्छित समय, विकास दर, और ट्यूमर मॉडल का प्रतिनिधित्व करने के लिए.
चित्रा 1 खोपड़ी शरीर रचना. माउस सिर और खोपड़ी की शारीरिक विशेषताओं सचित्र हैं. आंखों और राज्याभिषेक और बाण के समान sutures के चौराहे पर कान के बीच midline अक्ष पर है जो शीर्षस्थान, reproducibly इंजेक्शन निर्देशांक पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2 चीरा और इंजेक्शन मानचित्र. इंजेक्शन साइट त्वचा चीरा निर्धारण और ठीक पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया सुविधाओं सचित्र हैं. एक विकर्ण चीरा शीर्षस्थान और इंजेक्शन साइट दोनों के लिए उपयोग की अनुमति के लिए किया जाता है. 30% एच के आवेदन 2 ओ 2खोपड़ी की सतह के लिए खोपड़ी टांके कल्पना करने में मदद करता है. MICROPUMP पर सुई के साथ एक सिरिंज स्थिति और शीर्षस्थान पर सीधे सुई टिप छल. सेट शून्य करने के लिए संरेखण कंसोल पर निर्देशांक; सभी खोपड़ी माप तो reproducibly शीर्षस्थान के लिए सम्मान के साथ किया जाता है.
चित्रा 3 प्रतिनिधि intracranial xenograft ट्यूमर: एमआरआई छवियों एमआरआई टी 2 (बी) से ली गई एक ट्यूमर के साथ तुलना में (ए) 2 एक्स 10 5 U87 कोशिकाओं 2 एक्स 10 5 U251 कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक ट्यूमर की भारित छवियों.. समय के साथ साजिश रची U251 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन तीन व्यक्ति चूहों के एमआरआई छवियों से गणना (सी) ट्यूमर संस्करणों सभी प्रयोगों में संगत है कि ट्यूमर के विकास और विकास की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य खिड़की से पता चलता है.
चित्रा 4 प्रतिनिधि xenograft ट्यूमर: IVIS छवियों. U251-luciferase के IVIS छवि नग्न चूहों (ए) में intracranially इंजेक्शन जीबीएम कोशिकाओं transduced. इच्छित स्थान में U251 ल्यूक कोशिकाओं के साथ वर्णित है और एक बहुत मजबूत focalized संकेत (फोटॉनों / सेकंड) से पता चलता है के रूप में छोड़ दिया पर माउस सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया गया था. सही पर माउस अनुचित इंजेक्शन स्थान से एक असफल परिणाम को दर्शाता है. रीढ़ की एच ई परीक्षा निलय प्रसार के साथ midline के करीब इंजेक्शन से उत्पन्न स्पाइनल कॉलम में ट्यूमर कोशिकाओं की वृद्धि का पता चला. (बी) के ट्यूमर के आकार luciferase गतिविधि से अनुमान लगाया गया है, ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में (/ दूसरा फोटॉनों) समय के साथ साजिश रची. लाल रेखा रीढ़ की हड्डी में ट्यूमर सेल विस्थापन के साथ माउस से मेल खाती है, जबकि ब्लू लाइन, एक सफल intracranial इंजेक्शन के साथ माउस से मेल खाती है.
Intracranial xenograft ट्यूमर की चित्रा 5 एच ई. पूरे दिमाग चूहों बलिदान पद से एकत्र और formalin में तय, आयल में घुड़सवार, sectioned और एच एंड ई के साथ दाग रहे थे. ट्यूमर (ए) U87 जीबीएम कोशिकाओं से ली गई है और घने ट्यूमर के विकास (ऊपरी बाएँ कोने) और घातक कोशिकाओं (दाएं निचले कोने) की सूक्ष्म आक्रमण के साथ सटे सामान्य मस्तिष्क ऊतक के एक क्षेत्र को दिखाता था. ट्यूमर (बी) U251 जीबीएम कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक ट्यूमर के केंद्र के एक वर्ग से लिया गया था. खंड बहुत बारीकी से ठेठ मानव जीबीएम में देखा multinucleated घातक कोशिकाओं के साथ विचित्र ऊतकविकृतिविज्ञानी replicates.
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Discussion
मानव मस्तिष्क कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल नैदानिक उपचार की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हो सकता है, लेकिन मस्तिष्क के ऊतकों में कोशिकाओं के स्थान के अनुकूलन करने के लिए लिया जाना चाहिए देखभाल कर सकते हैं. अध्ययन अत्यधिक विभाज्य संस्करणों, suboptimal इंजेक्शन तकनीक और जल्दबाजी में इंजेक्शन एक्सचेंज (ट्यूमर आकार 2 में leakiness और अवांछनीय स्थानों (निलय, रीढ़ की हड्डी, extradural क्षेत्रों, आदि.) में ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति और उच्च भिन्नता के व्यक्तिगत टिप्पणियों का नेतृत्व कर सकते हैं कि पता चला है ). Noncellular नमूने के माइक्रोप्रोसेसर संचालित डिलीवरी के विश्लेषण से एक MICROPUMP का उपयोग अधिक focalized वितरण, कम नमूना भाटा और चिकनी, वर्दी वितरण और लगातार दबाव 3 के लिए जिम्मेदार ठहराया इंजेक्शन के मैनुअल तरीके से कम परिवर्तनशीलता का उत्पादन पाया. यह केवल 2 या 4 μl, एक stereotaxic साधन और संरेखण सांत्वना EQ के उपयोग की एक मात्रा में कोशिकाओं की जरूरत संख्या गाढ़ा करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता हैइसी तरह की वृद्धि दर के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय ट्यूमर प्राप्ति कर सकते हैं एक प्रोग्राम सूक्ष्म पंप के साथ uipped. एक xenograft मॉडल वास्तव में विशेष रूप से प्रतिरक्षा की कमी मेजबान के साथ, एक स्वाभाविक रूप से ट्यूमर का microenvironment, दीक्षा और विकास नकल नहीं कर सकते हैं, लेकिन एक अच्छी तरह से डिजाइन और कार्यान्वित Orthotopic मॉडल सबसे अच्छा विकल्प है और एक अस्थानिक मॉडल से बेहतर है.
इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ एक सुसंगत समय सीमा के भीतर detectable ट्यूमर की स्थापना है. ट्यूमर उपस्थिति के समय सेल प्रकार और इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर है, लेकिन काफी उम्मीद के मुताबिक है, और सबसे ट्यूमर ट्यूमर के विकास (यानी, समापन बिंदु तक का समय) की अवधि के लिए समय रिश्तेदार की एक संकीर्ण खिड़की के भीतर स्थापित कर रहे हैं. इस डेटा (जैसे एमआरआई या IVIS के रूप में) संग्रह या हस्तक्षेप (जैसे दवा इलाज के रूप में) के लिए समय बिंदुओं की पहचान करने के लिए शोधकर्ता सक्षम बनाता है. ट्यूमर के विकास दरों सेल प्रकार, कोशिकाओं की संख्या इंजेक्शन, और fr के साथ बदलती(वे मानव रोगियों में करना ज्यादा के रूप में), लेकिन प्रयोग करने के लिए प्रयोग से संगत कर रहे हैं माउस को ओम माउस.
इस प्रोटोकॉल एक तकनीक को रोजगार जबकि इंजेक्शन की कम सटीक मैनुअल तरीके से भी अधिक इंस्ट्रूमेंटेशन और समय की आवश्यकता हो सकती है और बड़े पैमाने पर जांच के लिए लागू नहीं हो सकता है कि, Iwami से वर्णित है कि इस तरह के रूप में पशुओं की बड़ी संख्या (के प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं कि intracranial इंजेक्शन के लिए तकनीक एट अल. 12) परिभाषा से तेजी से, उच्च दबाव इंजेक्शन शामिल है और अक्सर अस्थिरता और अनिश्चितता के अधीन हैं जो हाथ से आयोजित उपकरण और मैनुअल माप, शामिल है. इन कारकों में रिसाव और बंद लक्ष्य वितरण 2,3 के साथ जुड़ा हो सकता है. एक शुद्ध बचत - सटीक, reproducibility, और इस प्रक्रिया के कम मृत्यु दर अन्वेषक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए कम चूहों का उपयोग कर उपचार प्रयोगों डिजाइन करने के लिए अनुमति देगा.
एक कदम के लिए महत्वपूर्ण हैट्यूमर आरोपण की सफलता: इंजेक्शन की सटीक स्थान. निलय के करीब इंजेक्शन कोशिकाओं निलय प्रणाली के माध्यम से या extracranial क्षेत्रों में बीमारी की सीएसएफ प्रसार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बहुत उथले इंजेक्शन कोशिकाओं सुई ट्रैक के माध्यम से बाहर हो जाना सकता है. सुई नियुक्ति मैला है अगर पूर्व निर्धारित निर्देशांक छोटे मूल्य के हैं. Stereotaxic इकाई में सुरक्षित रूप से माउस सिर की स्थिति के लिए समय ले लो. माउस के लिए उपकरण फिट, और सिर stably तैनात है और प्रक्रिया के दौरान रॉक या मोड़ नहीं होगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए stereotaxic समायोजन विकल्प और कान सलाखों का प्रयोग करें. परिवर्तन या बदलाव के इंजेक्शन साइट ट्यूमर ले, विकास, आक्रामक क्षमता, और दवा वितरण और ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए उपयोग सहित, ट्यूमर विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है.
जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर पर गहरा प्रभाव पड़ता है कि अन्य मापदंडों इंजेक्शन दर, सेल संख्या और मात्रा में शामिल हैं; सभी अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा के लिए मात्रा को कमट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक कोशिकाओं के आर; व्यावहारिक धीरे इंजेक्शन दर का उपयोग करें. सेल नंबर और बीतने संख्या भी ट्यूमर ले और विकास दर पर प्रमुख प्रभाव है. यहां इस्तेमाल विशेष उपकरणों बेहतर नियंत्रण प्रदान करते हैं, लेकिन कम से कम मात्रा सटीक लक्ष्यीकरण, न्यूनतम और लगातार इंजेक्शन दर और धीमी सुई वापसी की अवधारणाओं (मैनुअल इंजेक्शन सहित) विभिन्न तकनीकों और उपकरणों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.
यह प्रक्रिया संशोधनों की एक किस्म के लिए खुला है: इंजेक्शन साइट ट्यूमर के विशेष प्रकार पुनरावृत्ति करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. पक्षपाती टिशू कल्चर कोशिकाओं, आनुवंशिक रूप से संशोधित क्लोन, neurospheres, disaggregated माउस ट्यूमर, या मानव ऊतक टुकड़े एक माउस मस्तिष्क में engrafted किया जा सकता है. इस तकनीक को भी वायरल जीन स्थानांतरण 3 सहित noncellular पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. मज़बूती से वांछित विशेषताओं के ट्यूमर के उत्पादन के लिए एक विधि स्थापित हो जाने के बाद, प्रयोगों effi की तुलनाचिकित्सा, दवा उपचार और संयोजन, और इस तरह के जीन स्थानांतरण के रूप में अन्य विकल्पों की cacy किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
डॉ कीटिंग डीओडी अनुदान CA100335 द्वारा वित्त पोषित है और एक सेंट Baldrick फाउंडेशन विद्वान है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
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