Summary
Beyin de in vitro veya ektopik analizler tarafından temsil edilmeyen nitelikleri ile benzersiz bir sitedir. Tekrarlanabilir bulunduğu yere ve büyüme özelliklerine sahip Ortotopik fare modelleri güvenilir bir stereotaksik tespit aracı ve bir düşük basınç şırınga pompası kullanılarak kafatası içine uygulanan enjeksiyonları ile oluşturulabilir.
Abstract
Özellikle beyin gibi eşsiz fizyolojik ve mimari nitelikleri ile sitelerin in vitro ve ektopik modelleri yapamam - Orthotopik tümör modelleri canlı hayvanın bağlamında, şu anda ve müdahalesi olmadan, bir tümör türü özelliklerini incelemek için en iyi yoldur. Bu damar, kan beyin bariyeri, metabolizma, ilaç dağıtım ve toksisite, ve diğer ilgili faktörlerin bir ev sahibi gibi özellikler oluşturmaktadır. Orthotopik modelleri de onların sınırlamaları var, ama ilgi uygun tekniği tümör hücreleri doğru dokuya engrafted edilebilir ile o insan beyninde en yakından taklit koşulları. Doğru tekrarlanabilir oluşturulabilir tutarlı oranı ve basınç, öngörülebilir büyüme oranları ile insan beyin tümörlerinin fare modelleri yerleri tanımlanmış hassas ölçülen miktarlar teslim ve çeşitli müdahalelerin güvenilir analiz için uygun yöntemler kullanılarak. Burada açıklanan protokol te odaklanırchnical başarılı ve tekrarlanabilir tümör büyümesini tasarımı ve intrakranial enjeksiyon için hazırlanması, ameliyat gerçekleştirmek ve sağlanması detayları ve farklı beyin tümörü modelleri bir dizi için özelleştirilebilir çeşitli koşullar için başlangıç noktaları sağlar.
Introduction
Beyin tümörü hücrelerinin in vitro çalışmalar büyüme, hayatta kalma, göç ve kanser hücrelerinin işgali sürüş moleküler mekanizmalar diseksiyon için paha biçilemez; kültürlü hücre deneyleri, sinyal yolları tanımlamak potansiyel terapötik hedefler önermek ve ilaç tedavisine hücresel yanıtı karakterize edilebilir. Fakat in vitro sistemler ilaca organizma cevabı tahmin için çok basit olduğunu; onlar fizyolojik tepkileri, bağışıklık yanıtlarını, hücre mikroortam, ve hayvan canlı sistemler genel heterojeniteyi yoksundur. Genetik mühendisliği modelleri, çok değerli mevcut olabilir, fakat moleküler farklılıkların klinik gözlem 1 hayvan modelleri karşılaştırırken önemli çelişkilere sonuçlanan insan süreçlerdeki olayları özetlemek hayvan türlerinde ve murin hücreleri arasında bulunmaktadır. Cenahlan deri altına, insan beyin tümörü hücre kuşaklarının subkutan (SQ) enjeksiyonunu içeren fare ksenograft modelleri gerçekleştirmek için kolayve ölçmek; onlar gen modifikasyonu ve ilaç idaresi / dağıtım, metabolizma ve toksisite etkileri gidermek için kullanılabilir. Önemli dezavantajları, ancak, SQ modellerinin kullanımını sınırlayan. Doğal olarak oluşan bir mikro-ortam beyin tümörü olduğu özetlemek değildir: çeşitli hücre tipleri ve dokuların etkileşimleri; beyne özgü yerel damar, ve sayısız diğer faktörler çoğaltılmış edilemez. Daha doğru bir doğal olarak oluşan bir beyin tümörü eşsiz ve ilaç ortamını yeniden müdahalelerin etkisini test etmek için, bir fare ortotopik bir model kullanılmalıdır. Bundan başka, genetik teknikleri ortotopik tümörü oluşumunda sonuçlanan ya da insan olmayan stroma hücreleri, modifiye edilmiş ve bir fare ilgili bölgesine enjekte edilir, insan primer kanserli olmayan hücrelerin (farklılaşmış veya progenitor) 'in genetik olarak inşa edilen bir yaklaşım bir parçası olarak da kullanılabilir benzer insanlarda 1'de görülmektedir.
Bu makaledebir metodoloji hassas ve tekrarlanabilir farelerde beyin tümörleri oluşturun. Bu tekniği kullanarak, kullanıcı doğru bir fare serebral korteksinin fronto-paryeto-temporal bölgenin belirli bir konuma süspanse edilen hücrelerin küçük bir kısım enjekte edebilir. Fare mortalite son derece düşük olduğunu; Bizim ellerde, hiçbir farenin 185 prosedürlerinden sonra cerrahi komplikasyonlar öldü. Elde edilen tümör özellikleri, tipik insan klinik tümörlerinin ile karşılaştırıldığında; örneğin: büyüme, nekroz derecesine, invazyon ölçüde, hücre tipi, mitotik hücrelerin varlığında, vb proliferasyon ve apoptozun, belirteçleri heterojenlik çabuklukla hücre çizgileri ya da ayrıştırılmış insan dokusu ya da tümör numuneleri, daha sonra ilgili kabiliyetleri bazında değerlendirilebilir gerçek klinik sunum simülasyonu. İlaç, hücre kültürü içinde performansına göre seçilmiş, çalışan bir metabolizma, dolaşım sistemi ve kan-beyin bariyeri bağlamında test edilebilir bir hayvan yükü wit var olduğuha tümör, ilgili mimari bağlamında bütün. Ayrıca, enjeksiyon için seçilmiş hücreler, genetik olarak, tümör büyümesi ve hayatta kalma gibi knock-in, mutasyonlar, belirli bir knockdowns, silmeler etkisini araştırmak için modifiye edilebilir.
Çok sayıda yayın intrakranial çeşitli teknikler kullanılarak tümörler çalışmaları belgelemek. Yamada ve ark. Boya ve U87 hücrelerinin enjeksiyonu detaylı bir çalışma yaptım ve hacmi ve enjeksiyon oranını azaltması iyi tümör 2 ürettiğini bulundu. . Brooks ve arkadaşları bir mikro-işlemci kontrollü enjektörü ziyade viral vektörlerin teslim etmek için bir manuel yöntem kullanarak üstün tekrarlanabilirlik ve verimliliği bulundu; Optimal enjeksiyon parametreleri konularındaki sonuçlar hücre teslim 3 için geçerlidir. Shankavaram ve diğ. Beyin içine cl gen tanımlama profili değinmeyecek (manuel bir metot kullanılarak) habis beyin tümörü (GBM) hücre çizgileri ortotopikal enjekte gösterdiinical tümörler daha sık olarak ya da nitro ya da SQ ksenograftlarda, klinik öncesi çalışmalar 4 intrakranial modellerinin kullanımını destekler. Giannini ve ark. Ilave farelerin beyinlerinde içine seri pasaj edilmesi suretiyle çıplak farelerin yan yüzlerin orta kısmından sürekli olan insan cerrahi örneklerden hücreleri enjekte ettik ve bu yaklaşım modelde 5 hasta tümör geninin korunmuş değişiklikler gösterdi. Benzer sonuçlar Yi ve ark 6 tarafından rapor edilmiştir. Sterotaksik bir kurulum, dikkatlice tanımlanmış enjeksiyon bölgesini ve yavaş ve istikrarlı bir enjeksiyon hızı kullanılarak, bunlar tutarlı büyüme oranları ve yüksek (% 100) engraftmınt oranı ile tekrarlanabilir beyin tümörleri elde. Bu tekniğin geçerliliği nedenle de kurulmuştur; Bir literatür araştırması bu tekniğin uygulamaları geniş olduğunu göstermektedir. Carty et al. Başarılı bir transgeni ön korteksinde terapötik genlerin ifade eden viral vektörlerin sunmak için intrakranyal enjeksiyon ikinciAlzheimer hastalığı 7 c modeli. Taki ve diğ. Zaten ortotopikal enjekte GBM, tümör 8 taşıyan çıplak farelere, nöral kök hücre bazlı bir taşıyıcı içinde tedavi edici onkolitik adenovirüs sunmak için intrakranyal enjeksiyon kullanımını tanımlamıştır. Açıkçası, intrakranial enjeksiyonları klinik öncesi araştırma için çok yönlü ve etkili bir araçtır. Visualized Experiments Dergisi'nde önceki yayınlar temel yaklaşımlar 9-11 tarif, ama biz-kolay-master teknolojisini kullanarak daha yüksek bir hassasiyet seviyesine intrakranial tümör enjeksiyonundan ve ortotopik modelleme kavramını alır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm açıklanan prosedürleri gözden ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Plan Deney
- Hücreleri seçin enjekte edilecek. Yapışık hücre kültür soyları, genetik olarak modifiye edilmiş klonlar, neurosphere hücreler, primer kültürü ya da ayrıştırılmış tümörleri: çeşitli kaynaklardan gelen hücreler enjeksiyon için adaydırlar. Istenen modelin tipi enjeksiyon için en uygun sitesi tanımlayacaktır.
- Enjeksiyon için hücre sayısını belirlemek. Tümörler oluşturmak için gereken hücre sayısı, hücre soyu ile değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir; Tümör büyüme oranı, hücre tipi, hücre sayısı ve doku kültürü kanal adedi büyük ölçüde bağlıdır. 1 x 10 4 2 x 10 5 veya enjeksiyon başına daha fazla değişen hücre sayıları değişen büyüme oranları tümörleri üretmişlerdir.
- Enjeksiyon için hacmini sınırlayın. Hücreler serum barındırmayan ortam veya fosfat tamponlu s en küçük hacminde süspansiyon haline olmalıdır26 G'lik bir iğne içinden, pürüzsüz ve kolay geçişine olanak tanır dizilmek (PBS). Daha küçük olan hacmi aslında beyin içine teslim daha kesin ve elde edilen tümör tanımlandığı gibidir; en iyi sonuçlar 3 ila 6 ul arasında değişen hacimlerde enjekte edilmesi ile elde edilir. Doğru bir ölçüm, karıştırma ve numune alma sağlamak için, bağımsız olarak planlanan enjeksiyon sayısı, suspensiyon halindeki hücreler en az 50 ml'lik bir son toplam hacmi hazırlamaktır planı.
- Modele uygun fareler seçin. İnsan tümörlerinin murin modelleri genellikle bağışıklık kaynaklı graft rejeksiyonu önlemek için, genç bağışıklık yetersizliği olan fareler kullanır. Uygun önlemler dekontaminasyon, dezenfeksiyon, malzeme ve ekipmanların sterilizasyonu dahil alınırsa çalışma biyolojik güvenlik kabini içinde yer almak için gerekli değildir. Burada gösterilen çalışma yaş 6 ve 12 hafta, erkek ve dişi atimik çıplak farelerde, yapılmıştır. Zor olabilir az 20 g ağırlığında Fareler olarak konumlandırmakve tereotaxic çerçeve hipotermiye daha duyarlı olabilir.
2. Ekipman birleştirin
- Elde edilir ve bir fareye stereotaksik çerçeve, hizalama konsolu ve fare gaz anestezi kafa tutucu, mikroenjektör pompa, ısı pedi, anestezi makinesi, fiber optik iş lamba ve değişken hız döner matkap dekontamine. Temizleyin ve tüm ekipmanı dezenfekte.
- Şırınga pompasının çalışması için gerekli olan ve diğer değişkenlerin (oranı, oran birimleri, enjektör türü, akış enjeksiyon hacmi de dahil olmak üzere), enjeksiyon parametreleri programlamak. Her bir model için ayarlarını optimize eder.
NOT: Ayarlar 3.000 nl örnekleri 25 ul şırınga (Aygıt Türü "E") Non-Gruplanarak ("N") modu kullanılarak (hızı birimleri "M") 400 nl / dk hızında olan bu enjeksiyonları. - Son RI yaparken, bir steril deiyonize su ile pek çok kez durulanır 26 G iğne ile hassas mikroenjektör (diH 2 O) ve% 70 etanol (EtOH) temizleyindiH 2 O. ile nse Bazı ancak tüm modeller otoklava üzere tasarlanmıştır değildir. Piston hareketi düzgün ve ücretsiz olduğundan emin olun.
- Anestezi uygulama ekipmanı edinin. Bu anestezi derinliğini ve süresini düzenleyen kolay olduğu gibi izofluran tercih anesteziktir. Stereotaksik birim fare anestezi gaz eki ile ve gerekli tüp ve konektörleri fare anestezi makineden gaz karışımını sunmak için yerinde olduğunu donanımlı olmasını sağlamak.
- Ince uçlu (diş ile) makas, iki forseps / hemostatlarla dikilmesi için, orta boy makas, orta ve ince uçlu cımbız, ve en az iki adet 1 mm'lik diş matkap dahil Otoklav cerrahi aletler,. % 70 EtOH, dezenfektan veya bir boncuk sterilizatör ile işlem sırasında temiz aletleri tutun.
- Bir ikinci, izofluran, analjezik, oftalmik merhem / yağlayıcı maddenin, antibiyotik merhem, tuzlu su,% 30 hidrojen peroksit (H2O 2), antiseptik ve (arzu edilirse) kemik mumu elde edilirveteriner veya sağlık kaynağı. Steril diH 2 O ve% 70 EtOH hazırlayın. Böyle gazlı bez, steril pansuman, sütür, etanol bezlerden, pamuklu çubuklarla, steril cerrahi eldiven, cerrahi bıçaklar ve daha fazlası gibi Sarf malzemeler listesinde itemized. Kafatasını işaretleme için ince uçlu kalıcı marker dekontamine ve cerrahi kullanım için tahsis edilmelidir.
3. Enjeksiyon için Hücreleri hazırlayın
- Burada gösterilen deneylerde, ölümsüzleştirilmiş insan GBM hücre çizgisi seçin. Hücre sayısını (2 x 10 5) bağlıdır ve tecrübi olarak enjekte edilecek olan süspansiyon hacminin (3 ul) belirlenmesi; bilgilerini hücre türüne göre değişebilir. Hassas ölçüm, karıştırma ve enjeksiyon kolaylaştırmak için en azından 50 ul'lik bir hacim kullanılır.
- Medya veya PBS hücreleri ve tekrar süspansiyon Trypsinize. Hücre enjeksiyonu hemen önce aşağıdaki adımları uygulayın:
- Aspirasyon ile hücreleri medya çıkarın ve 100 mm plaka başına 10 ml PBS ile yıkayın; PBS kaldırmak.
- ReklamHer 100 mm levha d 1 ml tripsin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yeterince uzun, oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 5 tripsin aktivitesi durdurma mi Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) +% 10, 100 mm plaka başına fetal sığır serumu (FBS).
- 100 mm plaka başına ~ 5 ml serumsuz DMEM (SF-DMEM) içinde 450 x g'de santrifüj ile tekrar süspansiyon Pelet hücreleri.
- Hemasitometre ya da otomatik bir hücre sayacı kullanılarak canlı hücreler sayılır.
- 2 x 10 5 hücre / 3 ul canlı hücre yoğunluğunu ayarlamak (veya deney ile belirlendiği gibi) hücreler tane haline SF-DMEM içinde yeniden süspanse edilerek.
- Buz veya soğuk paketi (hücre dondurma için izin vermez) üzerinde soğutulmuş hücreleri tutun. Parmak titreşmesinde hafifçe karıştırın.
4. anestezisi ve Cerrahisi Fare hazırlayın
- Anestezi ile ~% 5 izofluran (oksijen akışı ~ 2 L / dk) veya veteriner tarafından yönetilen Uyarmaktadır. Indüksiyon 2 3 dk almalıdır. Yeterli derinlikte fare koruyun~% 3 izofluran ile anestezi.
- , Ayak tutam tarafından anestezi derinliğini kontrol endikasyon varsa izofluran ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak tutam yanıt izlemeye devam. Isınmak için gazlı bez ile fare Kapak ve enjeksiyon hızına bağlı olarak, 1 saat 45 dakika sürebilir, süreç boyunca düzenli fare monitör.
- Dikkatle, dil üzerinde ve ağız içine damak çubuğunu kaydırarak stereotaktik çerçeve içinde fare yerleştirin. Diş deliğe ön kesici dişler kanca. Mümkün olduğunca yatay yakın olarak kulak-göz yüzeyi ile kafa stabilize etmek için kulak çubuklarını kullanın. Kulak kanalı içine çubukları zorlamayın. Bu güvenli baş pozisyonu önemlidir: nazikçe yan-yana ve yukarı-aşağı hareket edin. Uygun optimize etmek stereotaksik ünitesinin ayarlanabilir denetimlerini kullanın.
- Oftalmik merhem ile gözleri yağlayın. Iki kez povidon-iodin dönüşümlü uygulamaları ile gözleri ve kulakları arasındaki cildi temizleyinE antiseptik ve% 70 EtOH.
- Böğrüne seçilen analjezik subkutan (SQ) enjekte (ya da yönetti).
5. Enjeksiyon gerçekleştirin
- Enjeksiyon siteyi belirleyin. Enjeksiyon yeri ve boyutu fare soyunun ve hücrenin türüne göre değişiklik gösterebilir. Ventriküllere çok yakın enjekte hücreleri hastalığın kranyo-spinal yayılmasına yol açabilir. Çok sığ enjekte edilen hücrelerin iğne izi dışarı gelişebilir.
Not: Burada gösterilen deneylerde, hedef korteksin ön bölge olarak tanımlanan bir Alanı 2.5 mm (sağ), 1.5 mm ön tarafı, ve bregmaya göre 3,5 mm ventral lateral seçildi (Şekil 1) üretilmesi 20 ila 30 g arasında değişen farelerde bir orta beyin tümörü. - Bregma ve enjeksiyon yerini ortaya çıkarmak için kafa derisindeki steril bir teknik kullanılarak küçük bir kesik (~ 8 mm uzunlukta) olun. Orta hat eksen ve sağ kulağına doğru sağ gözü (arasında bir noktadan bir çapraz kesim,
- Cilt çekin ve kafatasının yüzeyini kurulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Bregma görselleştirmek için H 2 O 2 ile nemlendirilmiş bir bez ile kemik kurulayın. H 2 O 2 bregmada kesişir koronal ve sagital sütür boyunca beyaz köpük ince çizgiler bırakarak, oksijen kabarcıkları üretecek.
- Micropump üzerine iğne ile boş bir şırınga kilitlemek ve doğrudan bregma üzerine iğne ucu manevra; set 0.0 mm lateral, 0,0 mm ön / arka, ve 0.0 mm ventral / dorsal için hizalama konsolda koordinatları.
- Stereotaksik ünitesindeki kumanda düğmelerini kullanarak 2,5 mm yanal (sağda) ve bregmadan (veya istenilen yere) göre 1.5 mm anterior için iğne taşımak. Biraz şırınga kaldırın ve özel bir keçeli kalem ile kafatası tam konumunu işaretlemek. Kafatasının dış yüzeyi bregma (i olan bir seviye düzleminde emniyetle değilse.e., dorsal / ventral koordinat artık, sıfırlamak) sıfır okur ventral / dorsal 0.0 okuma enjeksiyon derinliği kaymıştır değil emin olmak için.
- Adım 5.5 kalemle işaretlenmiş uygun yerinde steril bir diş ucu ile donatılmış bir el döner matkap ile kafatası içine küçük bir delik delin. Kafatasına bir açıyla matkap tutun ve çok yavaşça kemiğe ucuna dokunun. Gerektiği gibi tekrarlayın. Aslında kafatası bu tabaka nüfuz iğne bırakarak, kemik yoluyla neredeyse ancak tamamen değil delme, temiz enjeksiyon ile sonuçlanmaktadır.
- PBS ya da tuzlu su nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla kemik tozu kaldırmak. Pompaya şırınga dönün ve konumunu doğrulamak için düz aşağı çapak deliğe iğne düşük. Burr deliği iğne merkezli değilse, bu kapaklar açıldığında matkap için kullanın.
- Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın ve pompa kontrolörü kullanarak şırıngaya hücreleri çizmek. Kabarcıklar ve yığınlarını önlemek ve iğne zekâ silinalkol tamponunu s dış yüzey üzerindeki kirletici hücreler ayıklandı. Şırınga / iğne tıkanmış ya da donmuş ise, kaldırmak ve steril su ve% 70 etanol ile hızlı bir şekilde temiz.
- Kafatası yüzeyi seviyesine iğnesini (0,0 mm ventral / dorsal) indirin. Daha sonra yavaş yavaş (yaklaşık 1 dakika boyunca) kafatası tam kalınlığı boyunca delmek ve 4 mm ventrall derinliğe kadar nüfuz beyin iğne düşük. Ventral 3,5 mm yavaşça iğneyi çekin. Fare kafası stereotaksik biriminde güvenli bir şekilde yapılır ise, kafatası hemen hemen hiç hareket olmalıdır.
- Doğru parametreler pompa kontrol girilir ki (Bölüm 2.2) ve basın "Run / Stop" Onayla (veya ürün kılavuzda belirtildiği gibi) hücreleri autoinject için. Fare izleyin ve endikasyon varsa izofluran ayarlayın. Şırınga izleyin ve piston namlu içinde hareket emin olun. Dondurulmuş veya tıkanmış hareket bükük / kırık dalgıç neden olabilir.
- B iğne ile 2 dakika 1 bekleyinyağmur, daha sonra çok yavaş bir şekilde (3-4 dakika boyunca) dokudan iğnenin geri çekilmesi. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra iğneyi kaldırmak için Toplam süresi 5 dk. Çapak delik çevresini örtecek bir pamuklu bir bez kullanın; Kemik kuruması için açık deri kenarlarını bırakın.
- Pompadan şırınga çıkarın ve hızlı bir şekilde% 70 etanol ile, steril H 2 O ile 3x 3x yıkayın ve steril H 2 O ile 3 kata (veya üreticisi tarafından belirtildiği gibi). EtOH ile iğne silin ve bir kenara koyun.
- Çapak delik (1 veya 2 ul eşdeğer) steril kemik balmumu uygulayın ve üzerine ve kemiğe balmumu bastırıp sıkıştırmak için steril bir pamuklu çubukla tahta ucunu kullanın. Yüzey yeterince kurutulmuş ise, sopa gerekir.
- Fare ve çevredeki iş alanı üzerinde steril örtüyü yaymak ve kesi dikin; Üç ilmek yeterli olmalıdır. Seçenek olarak ise, cerrahi, yapışkan kullanılabilir. Topikal antibiyotik uygulayın.
- % 0 izofluran azaltın ve c olmak stereotaksik biriminden fare kaldırmakDişleri korumak için areful. Kulaklar, ağız ve dil kontrol edin.
- Yakından enjeksiyonun ardından fare izleyin. 5 ile 10 dakika boyunca bir ısı yastığı Yeri fare; sonra (ısı yastığı) kafes transfer ve fare uyanır ve ayaktan kadar gözlemlemek. O sternum recumbence korumak için yeterli bilince kavuşana kadar fare gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete fareyi iade etmeyin. Ağrı belirtileri fark ise ek analjezik kullanımını düşünün.
6. Finish ve Monitör Kurtarma ve Tümör Gelişimi
- % 70 EtOH, fareler arasında bir boncuk sterilizatör veya dezenfektan kullanarak temizleyiniz tüm alet ve ekipmanlar.
- Ağrı, enfeksiyon veya diğer komplikasyonların belirtilerinin için işlem sonrası iki gün boyunca enjekte fareler izleyin. İşlemden sonra, 24 ve 48 saat (ya da belirtilen) bir analjezik enjekte edilir. Gerekirse, 7-10 gün sonra dikiş çıkarın.
- Hastalık, paralysi klinik belirtileri için fareler değerlendirins, kilo kaybı, nöbetler, veya genel hastalığı aktivite azalmıştır.
- [Vivo Görüntüleme Sistemleri İçinde manyetik rezonans görüntüleme (MRI), (IVIS), ve saire] uygun olan yöntem ile tümör gelişimini izlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güvenilir intrakranial ksenogratflardır bu açıklanan teknikle oluşturulabilir. Fare kafatası kritik yapılar (Şekil 1) belirlenmesi Bregma tanınması için izin ve kesin ve tekrarlanabilir enjeksiyon konuma araştırmacı rehberlik edecektir. Bu çalışmalarda, U251, ebeveyn doğrusu, lusiferaz (U251-Luc) veya U87 ile transfekte U251 insan GBM hücrelerinin doku kültürü hücreleri, SF-DMEM 4-6 ul içerisinde süspansiyon haline getirildi, ölümsüzleştirilmiş ve 2.5 mm (sağ) yan, 1,5 mm anterior enjekte ve bregmaya göre 3,5 mm ventral (Şekil 2).
Oluşan tümörler görsel ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG, Şekil 3), in vivo Işıklı görüntüleme (IVIS, Şekil 4), ya da rutin brüt patoloji teknikleri (H & E boyama, Şekil 5) ile analiz edilebilir. Özellikle dikkat edilmelidir ve optimizasyon ÖDENEK belirlemek için yapılırte hücreleri ve enjeksiyon yeri arzulanan zamanlaması, büyüme ve tümör modeli temsil etmek.
Şekil 1. Kafatası anatomi. Fare baş ve kafatası anatomik özellikleri gösterilmiştir. Gözleri ve koronal ve sagital sütür kesiştiği kulak arasındaki orta hat ekseni üzerinde Bregma, tekrarlanabilir enjeksiyon koordinatlarını bulmak için kullanılır.
Şekil 2. Kesi ve enjeksiyon haritası. Enjeksiyon yerinde deri kesisi belirlemek ve kesin bulmak için kullanılan özellikleri gösterilmektedir. Bir çapraz kesi bregmadan ve enjeksiyon yerinde hem erişime izin vermek için yapılır. % 30 H 2 O Uygulama 2kafatasının yüzeyine dikiş kafatası görselleştirmek için yardımcı olur. Micropump üzerine iğne ile bir şırınga yerleştirin ve Bregma üzerinden doğrudan iğne ucu manevra. Set sıfıra hizalama konsolda koordinatları; Tüm kafatası ölçümleri sonra tekrarlanabilir bregmaya göre yapılır.
Şekil 3. Örnek intrakraniyal ksenograft tümörler: MR görüntüleri MR T2 (B) 'den elde edilen bir tümör ile karşılaştırıldığında (A), 2 x 10 5 U87 hücreleri 2 x 10 5 hücre U251 türetilmiş bir tümör ağırlıklı görüntüler.. Zamanla çizilen U251 hücreleri enjekte üç ayrı farelerin MR görüntülerinden hesaplanan (C) Tümör hacimleri tüm deneylerde tutarlı tümör gelişiminde ve büyüme tekrarlanabilir penceresini gösterir.
Şekil 4. Temsilcisi ksenogreft tümörler: IVIS görüntüler. U251-lusiferaz IVIS görüntü çıplak farelerin (A) içine enjekte intrakranial GBM hücrelerinin transduse. Istenen konumda U251-Luc hücreleri ile tanımlanan ve çok güçlü bir odaklanmış ve bir sinyal (foton / saniye) gösterildiği gibi soldan fare başarılı bir şekilde enjekte edilmiştir. Sağdaki fare uygunsuz enjeksiyon yerden başarısız bir sonuç göstermektedir. Omurga H & E ile inceleme ventriküler yayılması ile orta hat çok yakın enjeksiyonundan kaynaklanan spinal kolon tümör hücresi büyüme gösterdi. (B) Tümör boyutu, lusiferaz aktivitesinden tahmin edilmektedir, ilgi konusu beyin bölgesi (/ saniye fotonlar) zaman içinde işlenmiştir. Kırmızı çizgi omurga tümör hücresi yer değiştirmesi ile fare tekabül ederken mavi çizgi, başarılı bir intrakranial enjeksiyon ile fare karşılık gelir.
İntrakraniyal ksenogreft tümörlerin Şekil 5. H & E. Bütün beyinler farenin kurban sonrası toplanır ve formalin içinde sabitlenmiş, parafin içine monte edilmiş, kesit ve H & E ile boyandı. Tümör (A) U87 GBM hücrelerden türetilmiş ve yoğun tümör büyümesi (sol üst köşe) ve malign hücrelerin (sağ alt köşe) mikroskobik işgali ile komşu normal beyin dokusu bir alanı göstermektedir edildi. Tümör (B), U251 GBM hücrelerinden türetilmiş bir tümör merkezinin bir bölümü alındı. Bölüm çok yakından tipik insan GBM görülen çok çekirdekli malign hücreleri ile tuhaf histopatolojisini çoğaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan beyin kanseri Ortotopik fare modelleri klinik tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için mükemmel bir araç olabilir, ama beyin dokusunda hücrelerin yerleşimi optimize etmek için dikkat edilmesi gerekiyor olabilir. Çalışmalar aşırı kısım hacimleri, optimal enjeksiyon tekniği ve aceleci enjeksiyon oranları (tümör boyutu 2 sızdırma ve istenmeyen yerlere (karıncıklar, omurilik, epidural bölgelerde, vb.) Tümör hücrelerinin bir görünüm ve yüksek varyasyon kişisel gözlemlerini yol göstermiştir ). , Hücresel-olmayan örneklerin mikroişlemci tabanlı doğum analizi bir micropump kullanımı ise daha fazla odaklanmış ve teslimat daha fazla örnek reflü ve düzgün, homojen dağılımı ve tutarlı basınçları 3 atfedilen enjeksiyon manüel yöntemler, daha az değişkenlik ürettiği bulundu. Sadece 2 veya 4 ul, stereotaksik alet ve hizalama konsol eq kullanımının bir hacim içindeki hücreleri göz gerekli sayı yoğunlaştırmak için zor olsa dabenzer büyüme oranlarına sahip, güvenilir ve tekrarlanabilir tümörleri verim programlanabilir bir mikro-pompa ile uipped. Bir ksenogreft model gerçekten özellikle bağışıklık yetersizliği ana, doğal olarak oluşan bir tümörün mikroçevresinin, başlatılması ve gelişimini yinelenen asla, ama çok iyi tasarlanmış ve uygulamaya orthotopik modeli iyi bir alternatif olduğunu ve bir ektopik modeline göre çok daha üstündür.
Bu protokolün büyük avantajı tutarlı bir zaman çerçevesi içinde tespit tümörlerin kurulmasıdır. Tümör görünüm zamanlaması hücre tipi ve enjekte edilen hücrelerin sayısına bağlıdır, ancak oldukça beklenen bir şeydir ve en çok tümör büyümesi tümörler (örneğin, uç nokta kadar zaman) süresine göre zaman içinde bir dönem içinde kurulmuştur. Bu veriler (örneğin MR veya IVIS gibi) toplanması veya müdahale (örneğin ilaç tedavisi gibi) için zaman noktaları belirlemek için araştırmacı sağlar. Tümör büyüme hızları, hücre tipi, hücre sayısı enjekte edilir ve fr ile değişir(onlar insan hastalarda yapmak kadar), ancak deneme deney tutarlı olan fare om fare.
Bu protokol bir teknik kullanır iken enjeksiyon daha az kesin manuel yöntemlere göre daha enstrümantasyon ve zaman gerektirebilir ve büyük ölçekli araştırmaların için geçerli olmayabilir, Iwami tarafından tarif ki gibi çok sayıda hayvanın (bir hacmi için izin intrakranial enjeksiyonlar için teknikler ve ark. 12) tanımına göre hızlı, yüksek basınçlı enjeksiyon tutabilen ve sıklıkla dengesizlik ve belirsizlik tabidir el aletleri ve manuel ölçüm, içerir. Bu faktörler, sızıntı ve boşaltma hedef verme 2,3 ile ilişkili olabilir. Net tasarruf - hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve bu prosedürün düşük mortalite araştırmacı istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için daha az fareler kullanılarak tedavi deney tasarımı sağlayacaktır.
Bir adım için önemlidirTümör implantasyon başarısı: enjeksiyon hassas konum. Ventriküllere çok yakın enjekte edilen hücrelerin ventriküler sistemi aracılığıyla ya da Ekstrakranial bölgelerine hastalık BOS yayılmasına yol açabilir. Çok sığ enjekte edilen hücrelerin iğne izi dışarı gelişebilir. Iğne yerleştirilmesi özensiz ise önceden belirlenmiş koordinatları az değeri vardır. Steryotaksik ünitesinde güvenli fare kafası konumlandırmak için zaman ayırın. Fare ekipmanı uygun ve baş stabil konumlandırılmış ve işlem sırasında kaya veya büküm olmayacak emin olmak için stereotaksik ayar seçeneklerini ve kulak çubuklarını kullanın. Değişiklikler veya varyasyon enjeksiyon sitesi tümör alımı, büyüme, invaziv potansiyeli ve ilaç dağıtım ve oksijen kaynağına erişimi de dahil olmak üzere, tümör özellikleri etkileyebilir eğer.
Çıkan tümör üzerinde derin bir etkiye sahip Diğer parametreler enjeksiyon oranını, hücre sayısı ve hacmi vardır; Tüm deneysel olarak tespit edilmelidir. Numbe için hacmi en aza indirmektümör büyümesi için gerekli olan hücrelerin r; Pratik yavaş enjeksiyon hızı kullanın. Hücre sayısı ve geçiş sayısı da tümör Aldıkları ve büyüme oranı üzerinde önemli etkileri vardır. Burada kullanılan özel ekipman üstün kontrol sunar, ancak minimal hacimde, hassas hedefleme, minimal ve tutarlı, enjeksiyon hızı ve yavaş iğne çekilme kavramları (manuel enjeksiyon dahil) çeşitli teknikler ve çeşitli araçlara uygulanabilir.
Bu prosedür değişiklikler çeşitli açıktır: enjeksiyon yeri tümörlerin belli tipteki özetlemek için özelleştirilebilir. Yapışık doku kültürü hücreleri, genetik olarak modifiye edilmiş klonlar, Neurospheres, tasnif edilmiş fare tümörleri veya insan doku fragmanları bir fare beyin nakledilmiş olabilir. Bu yöntem, viral gen transferi 3 de dahil olmak üzere, hücresel-olmayan çalışmaları için adapte edilebilir. Güvenilir bir şekilde arzu edilen özelliklere tümörleri üretilmesi için bir yöntem, bir kez kurulduğunda, deneyler kate karşılaştırılmasıterapileri, ilaç tedavileri ve bunların kombinasyonları ve bu gen transferi gibi diğer seçenekler cacy gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Dr Keating DOD hibe CA100335 tarafından finanse edilen ve bir Aziz Baldrick'in Vakfı Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
