Summary
O cérebro é um local único, com qualidades que não são bem representados por análises in vitro ou ectópicas. Ortotópico modelos de mouse com localização e características de crescimento reprodutíveis podem ser criados de forma confiável com injeções intracranianas utilizando um instrumento de fixação estereotáxica e uma bomba de seringa de baixa pressão.
Abstract
Modelos de tumor ortotópico Atualmente a melhor maneira de estudar as características de um tipo de tumor, com e sem intervenção, no contexto de um animal vivo - especialmente em locais com qualidades fisiológicas e arquitectónicas únicas, tais como o cérebro in vitro e modelos ectópica não pode. responsáveis por funções como a vasculatura, a barreira hemato-encefálica, metabolismo, distribuição de medicamentos e toxicidade, e uma série de outros fatores relevantes. Ortotópico modelos têm as suas limitações também, mas com células tumorais técnica adequada de interesse podem ser precisamente em vós implantada no tecido que melhor imita as condições do cérebro humano. Empregando os métodos que proporcionam volumes medidos com precisão a localizações definidas com precisão a uma taxa consistente e pressão, os modelos murinos de tumores cerebrais humanos, com taxas de crescimento previsível pode ser criado de forma reprodutível e são adequados para a análise fiável de diversas intervenções. O protocolo descrito aqui enfoca a technical detalhes de concepção e preparação para uma injeção intracraniana, a realização da cirurgia, e garantir o crescimento do tumor de sucesso e reprodutível e fornece pontos de partida para uma variedade de condições que podem ser personalizadas para uma gama de diferentes modelos de tumor cerebral.
Introduction
Estudos in vitro de células tumorais do cérebro são de valor inestimável para dissecar mecanismos moleculares crescimento, sobrevivência, migração e invasão das células cancerosas de condução; experiências em células cultivadas pode definir as vias de sinalização, sugerem potenciais alvos terapêuticos, e caracterizar a resposta celular ao tratamento com droga. Mas in vitro sistemas são demasiado simplista para prever a resposta do organismo aos medicamentos; faltam as reacções fisiológicas, as respostas imunes, microambiente celular, e heterogeneidade global dos sistemas de animais vivos. Geneticamente modificados modelos pode ser inestimável, quando disponível, mas existem diferenças moleculares entre as espécies e células de ratinho não pode recapitular eventos em processos humanos, resultando em diferenças significativas quando se comparam modelos animais para observações clínicas 1. Modelos de xenotransplante de rato envolvendo subcutânea (SQ) de injecção de linhas de células de tumor cerebral humanas sob a pele do flanco são fáceis de realizare medir; eles podem ser utilizados para tratar os efeitos de modificação do gene e a administração do fármaco / distribuição, o metabolismo e a toxicidade. Desvantagens significativas, no entanto, limitar a utilidade de modelos SQ. O microambiente não recapitular o de um tumor cerebral que ocorre naturalmente: as interacções de vários tipos de células e tecidos; vasculatura local, e uma miríade de outros factores única para o cérebro não pode ser replicado. Para reproduzir de forma mais precisa o único meio de um tumor cerebral que ocorre naturalmente e testar os efeitos da intervenção farmacêutica, deve ser utilizado um modelo ortotópico de rato. Além disso, as técnicas de ortotópicos pode ser utilizado como parte de uma abordagem de engenharia genética em que as células não-cancerosas humanas primárias (diferenciadas ou progenitoras) são geneticamente modificados e injectada no sítio correspondente de um rato, com ou sem as células do estroma humanas, resultando em tumorigénese semelhante ao observado em seres humanos um.
Este artigo descreveuma metodologia para criar com precisão e de forma reprodutível os tumores do cérebro em ratos. Utilizando esta técnica, o utilizador pode injectar com precisão uma pequena alíquota de suspensão de células em uma localização da região fronto-parietal-temporal do córtex cerebral do rato determinado. Mortalidade Mouse é extremamente baixo; em nossas mãos, não os ratos morreram de complicações cirúrgicas após 185 procedimentos. Características do tumor resultante pode ser comparado com o de tumores humanos clínicos típicos; por exemplo: a rapidez de crescimento, o grau de necrose, a extensão da invasão, a heterogeneidade do tipo de células, a presença de células mitóticas, marcadores de proliferação e apoptose, etc As linhas de células ou de tecidos ou amostras de tumores humanos desagregados pode então ser avaliada com base na sua capacidade para simular quadro clínico real. Pharmaceuticals, seleccionadas com base no seu desempenho em cultura de células, podem ser testadas no âmbito de um metabolismo de funcionamento, sistema circulatório, e barreira sangue-cérebro, como elas existem em um animal sobrecarregados witha do tumor, todos em um contexto de arquitectura relevantes. Além disso, as células escolhidas para injecção pode ser geneticamente modificado para investigar o impacto de knockdowns específicos, deleções, knock-ins, mutações, etc, sobre o crescimento de tumores e sobrevivência.
Um número de publicações documentam tumores estudos usando uma variedade de técnicas intracranianas. Yamada et al. Fez um estudo detalhado da injeção de corante e de células U87 e descobriu que a minimização do volume e injeção taxa produziu o melhor tumor 2. . Brooks et al encontraram reprodutibilidade superior e eficiência usando um injector controlado por um microprocessador, em vez de um método manual para entregar os vectores virais; suas conclusões sobre os parâmetros de injeção ideais são aplicáveis a entrega de 3 células. Shankavaram et al. Mostrou que o glioblastoma multiforme (GBM) linhas de células injectadas ortotopicamente (utilizando um método manual) no cérebro recapitulado no perfil da expressão do gene cltumores inical mais perto do que in vitro ou SQ xenotransplantes, apoiando o uso de modelos intracranianos para estudos pré-clínicos 4. Giannini et al. Células de espécimes cirúrgicos humanos que haviam sido sustentados nos flancos de ratos nu por passagens em série no cérebro de camundongos injetados adicionais, e mostrou que esta abordagem preservada alterações genéticas do tumor do paciente no modelo 5. Resultados semelhantes foram relatados por Yi et al 6. Usando uma configuração estereotáxica, local da injeção cuidadosamente definidos, e uma taxa de injeção lenta e constante, obtiveram tumores cerebrais reprodutíveis com taxas de crescimento consistentes e alta (100%) Taxa de enxerto. A validade desta técnica, portanto, foi bem estabelecida; uma pesquisa bibliográfica sugere que as aplicações desta técnica são extensas. Carty et al. Utilizado injecções intracranianos para entregar com sucesso vectores virais que expressam genes terapêuticos para o córtex frontal de transgenic modelo de doença de Alzheimer 7. Thaci et al. Descreveu a utilização de injecções intra-cranianas para entregar adenovírus oncolítico terapêutico num transportador base de células estaminais neuronais em ratinhos nus portadores de tumores GBM já ortotopicamente injectados 8. Claramente, as injeções intracranianas são uma ferramenta versátil e eficaz para a investigação pré-clínica. Publicações anteriores no Jornal of Experiments visualizado descrevem abordagens fundamentais 9-11, mas tomamos o conceito de injeção de tumor intracraniano e modelagem ortotópico a um maior nível de precisão usando a tecnologia fácil de dominar.
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Protocol
Todos os procedimentos foram revistos e aprovados por nosso comitê de cuidados com os animais e uso institucional.
1 Plano do Experimento
- Escolha células a serem injectadas. As células a partir de uma variedade de fontes, são candidatos para injecção: as linhas de cultura de células aderentes, clones geneticamente modificados, culturas de células primárias, Neurosphere ou tumores desagregados. O tipo de modelo desejado irá definir o local mais apropriado da injecção.
- Determinar o número de células de injeção. O número de células é necessária para formar os tumores varia com a linha de células e têm de ser determinadas empiricamente; taxa de crescimento do tumor depende fortemente do tipo de célula, e o número de células de cultura de tecidos número passagem. Os números de células que variam de 1 x outubro 4-2 x 10 5 ou mais por injecção produziram tumores de diferentes taxas de crescimento.
- Limitar o volume de injeção. As células devem ser suspensos no menor volume de meios de comunicação livres de soro ou de fosfato sAline (PBS) que permite liso, a passagem fácil através de uma agulha G 26. Quanto menor o volume efectivamente fornecido para o cérebro, o mais preciso e definido o tumor resultante; os melhores resultados são obtidos através da injecção de volumes que variam de 3 a 6 ul. Plano para preparar um volume total final de, pelo menos, 50 ul de suspensão de células, independentemente do número de injecções planeados, para permitir uma medição precisa, misturando e amostragem.
- Escolha camundongos apropriado para o modelo. Modelos murinos de tumores humanos utilizam tipicamente jovens ratinhos imuno-comprometidos, para evitar a rejeição do enxerto mediada imune. Não é necessário para o trabalho a realizar-se em uma cabine de segurança biológica, se tomem as devidas precauções, incluindo a descontaminação, desinfecção e esterilização de materiais e equipamentos. O trabalho mostrado aqui foi feito em ratos nus atímicos, do sexo masculino e do sexo feminino, entre 6 e 12 semanas de idade. Os ratinhos que pesam menos de 20 g pode ser difícil posicionar sobre comoquadro tereotaxic e podem ser mais suscetíveis à hipotermia.
2 Monte o Equipamento
- Obtenha e descontaminar um rato quadro estereotáxico, console de alinhamento e suporte de cabeça anestesia gás rato, bomba de micro, almofada de calor, aparelho de anestesia, fibra óptica lâmpada de trabalho, e broca rotativa de velocidade variável. Limpar e descontaminar todos os equipamentos.
- Programar os parâmetros de injecção (incluindo volume de injecção, a taxa de, unidades de razão, o tipo de seringa de fluxo) e outras variáveis necessários para o funcionamento da bomba de seringa. Otimizar as configurações para cada modelo específico.
Observação: nessas injeções as configurações foram 3.000 amostras nl a uma taxa de 400 nl / min (unidades de taxa "M") usando uma seringa de 25 mL (tipo de dispositivo "E") no modo não agrupada ("N"). - Limpar uma micro de precisão com 26 L de agulha com várias lavagens de água estéril de s ionizada (DIH 2 O) e 70% de etanol (EtOH), fazendo um ri definitivanse com Dih 2 O. Alguns, mas não todos os modelos são projetados para ser autoclavados. Certifique-se de que o movimento do pistão é suave e livre.
- Obter equipamentos de anestesia. Isoflurano é o anestésico preferido, uma vez que é fácil de regular a profundidade e duração da anestesia. Certifique-se de que a unidade estereotáxica é equipado com um acessório de gás anestesia rato e que a tubulação e conectores necessários estão no local para entregar a mistura de gases do aparelho de anestesia com o mouse.
- Instrumentos cirúrgicos autoclave, incluindo uma tesoura de ponta fina, duas pinças / hemostatos (com dentes) para sutura, tesouras, pinças e médio porte médio e de ponta fina, e pelo menos dois 1 milímetro brocas dentárias. Manter instrumentos limpos durante o procedimento com 70% de EtOH, desinfectante, ou um esterilizador talão.
- Obter isoflurano, analgésico, pomada oftálmica / lubrificante, pomada antibiótica, salino, 30% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2), anti-séptico, e cera de osso (se desejado) a partir de umfornecimento veterinária ou médica. Prepare estéril dih 2 O e 70% de EtOH. Materiais descartáveis, tais como gaze, curativos estéreis, suturas, cotonetes etanol, algodão derrubado cotonetes, luvas cirúrgicas estéreis, lâminas cirúrgicas e mais estão especificados na lista de materiais. Um marcador permanente ponta fina para a marcação do crânio devem ser descontaminados e dedicada para uso cirúrgico.
3 Prepare Células para Injeção
- Nos experimentos mostrados aqui, selecione uma linhagem humana imortalizada celular GBM. Determinar o número de células (2 x 10 5) e o volume de suspensão para ser injectada (3 ul) empiricamente; Detalhes podem variar com o tipo de célula. Use um volume de pelo menos 50 ul para facilitar a exata medição, mistura e injeção.
- Trypsinize células e ressuspender em mídia ou PBS. Execute as seguintes etapas imediatamente antes da injeção de células:
- Remova a mídia de células por aspiração e lavar com 10 ml PBS por placa de 100 mm; remover PBS.
- Anúnciod 1 ml de tripsina a cada placa de 100 mm e incubar à temperatura ambiente o tempo suficiente para se obter uma suspensão de célula única.
- Pare a actividade da tripsina com 5 ml de Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) por placa de 100 mm.
- Células por centrifugação a 450 xg e ressuspender em ~ 5 ml de soro DMEM livre (SF-DMEM) por placa de 100 mm.
- Contagem de células viáveis utilizando um hemacitómetro, ou um contador de células automatizado.
- Ajustar a densidade de células vivas para 2 x 10 5 células / 3 mL (ou conforme determinado por experimentação) por sedimentação das células e ressuspender em SF-DMEM.
- Mantenha células refrigerados com gelo ou um pacote de frio (não permitir que as células de congelar). Misture delicadamente por estalar os dedos.
4. Anestesie e Prepare mouse para Cirurgia
- Induzir a anestesia utilizando ~ 5% de isoflurano (fluxo de oxigênio ~ 2 L / min) ou conforme indicado pelo veterinário. Indução deve levar 2-3 min. Manter o mouse em uma profundidade adequadade anestesia com ~ 3% de isoflurano.
- Verifique a profundidade de anestesia por aperto do dedo do pé, ajustar isoflurano se indicado e continuar a monitorizar a respiração e toe resposta aperto ao longo do procedimento. Cubra rato com compressas de gaze para o calor e monitorar rato regularmente durante todo o procedimento, que pode demorar de 45 minutos a 1 hora, dependendo da taxa de injeção.
- Posicione o mouse no quadro estereotáxico cuidadosamente deslizando a barra paladar sobre a língua e na boca. Gancho incisivos da frente para o buraco do dente. Use barras de ouvido para estabilizar a cabeça, com a superfície da orelha-de-olho mais próximo da horizontal possível. Não force bares no canal do ouvido. É fundamental para posicionar a cabeça de forma segura: confira o movimento lado-a-lado e para cima e para baixo suavemente com os dedos. Use os controles ajustáveis da unidade estereotáxico para otimizar o ajuste.
- Lubrifique os olhos com pomada oftálmica. Limpe a pele entre as orelhas e os olhos duas vezes com a alternância de aplicações de um povidone-iodine anti-séptico e de 70% de EtOH.
- Injetar por via subcutânea analgésico escolhido (SQ) no flanco (ou conforme indicado).
5. Execute Injeção
- Determine o local da injeção. O local de injecção pode variar com o tamanho e estirpe de rato e do tipo de célula. Células injectadas muito perto dos ventrículos pode levar a crânio-espinal propagação da doença. As células injetadas muito raso pode crescer para fora através da pista agulha.
Nota: Nas experiências apresentadas aqui, o alvo foi definida como a região frontal do córtex cerebral de uma área de 2,5 mm lateral (direita), 1,5 mm anterior e 3,5 mm ventral em relação ao bregma foi escolhido (Figura 1), produzindo um tumor do cérebro médio em ratos variando de 20 a 30 g. - Fazer uma pequena incisão (~ 8 mm de comprimento) utilizando uma técnica estéril, através da pele da cabeça para expor o bregma e o local da injecção. Um corte em bisel, a partir de um ponto situado entre o eixo da linha média e o olho direito no sentido da orelha direita (
- Retrair a pele e usar uma mecha de algodão estéril para secar a superfície do crânio. Seque o osso com uma outra compressa humedecida com H 2 O 2 para visualizar bregma. O H 2 O 2 irá produzir bolhas de oxigênio, deixando linhas finas de espuma branca ao longo das suturas coronal e sagital que se cruzam em bregma.
- Bloquear uma seringa vazia com agulha para a microbomba e manobrar a ponta da agulha directamente sobre a bregma; conjunto de coordenadas no console alinhamento a 0,0 mm lateral, 0,0 milímetros anterior / posterior, e 0,0 milímetros ventral / dorsal.
- Mova a agulha 2,5 mm lateral (direita) e 1,5 mm anterior em relação ao bregma (ou local desejado) usando os botões de controle na unidade estereotáxico. Levante a seringa ligeiramente e marcar a localização exacta sobre o crânio com uma caneta com ponta de feltro dedicado. Se a superfície externa do crânio que não é num plano horizontal com bregma (i.e., o dorsal / ventral coordenar já não lê zero), redefinir o ventral / dorsal lendo a 0,0 para garantir que a profundidade da injeção não é deslocada.
- Faça um furo pequeno no crânio com uma broca rotativa de mão equipado com uma ponta dental estéril no local apropriado marcado com a caneta na etapa 5.5. Segurar a broca em um ângulo para o crânio e toque muito suave da ponta para o osso. Repita conforme necessário. A perfuração quase, mas não completamente através do osso, deixando a agulha penetrar, na verdade, para esta camada do crânio, resulta na injecção limpa.
- Remova o pó de osso com um cotonete embebido em PBS ou soro fisiológico. Volte a seringa à bomba e abaixe a agulha em linha reta até o orifício de trepanação para confirmar localização. Se o orifício de trepanação não está centrada com a agulha, utilizar a broca para alargar a abertura.
- Misture suavemente a suspensão de células e extrair as células para dentro da seringa utilizando o controlador da bomba. Evite bolhas e pedaços e limpe a sagacidade agulhah um algodão embebido em álcool para remover células contaminantes na superfície exterior. Se a seringa / agulha está entupido ou congelado, retire e rapidamente limpar com água estéril e etanol 70%.
- Diminuir a agulha para o nível da superfície do crânio (0,0 milímetros ventral / dorsal). Em seguida, lentamente (ao longo de aproximadamente 1 min) inferior a agulha para perfurar a espessura total do crânio e penetrar no cérebro para uma profundidade de 4 mm ventrall. Retire a agulha lentamente a 3,5 mm ventral. Se a cabeça do rato é realizada de forma segura no aparelho estereotáxico, deve haver quase nenhum movimento do crânio.
- Confirme se os parâmetros corretos são inseridos no controlador da bomba (Seção 2.2) e pressione "RUN / STOP" (ou como indicado pelo manual do produto) para autoinject células. Monitorar o mouse e ajustar o isoflurano, se indicado. Assista a seringa e garantir que o êmbolo se move no barril. Movimento congelado ou entupido pode resultar em uma inclinação / atuador quebrado.
- Esperar 1 a 2 minutos, com a agulha na bchuva, em seguida, muito lentamente (mais de 3-4 min) retirar agulha do tecido. O tempo total para remover a agulha após a injecção está completa é de 5 min. Utilize um cotonete para apagar a área ao redor do orifício de trepanação; deixar os bordos da pele aberta para permitir que o osso para secar.
- Remover a bomba de seringa e rapidamente lavar 3x com H 2 O estéril, 3 x com 70% de EtOH, e 3x com H 2 O estéril (ou como indicado pelo fabricante). Limpe a agulha com EtOH e reserve.
- Aplicar cera óssea estéril (equivalente a 1 ou 2 ul) para o orifício de trepanação e utilizar a fim de madeira de uma mecha de algodão estéril para conter a cera sobre e dentro do osso. Se a superfície é seca de forma adequada, ele deve manter.
- Espalhe campo estéril sobre a área de trabalho com o mouse e entorno e suturar a incisão; três pontos devem ser suficientes. Alternativamente, o adesivo cirúrgico pode ser usado. Aplicar um antibiótico tópico.
- Reduzir isoflurano para 0% e remover o mouse da unidade estereotáxica, sendo careful para proteger os dentes. Verifique ouvidos, boca e língua.
- Monitorar o mouse seguindo de perto a injeção. Colocar o mouse sobre uma almofada de calor por 5 a 10 minutos; em seguida, transferir a gaiola (na almofada de calor) e observar até rato acorda e é ambulatorial. Não deixe o mouse autônoma até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Considere o uso de analgésicos adicionais se os sinais de dor são notados.
6. Finish e Recuperação Monitor & Desenvolvimento Tumor
- Limpe todos os instrumentos e equipamentos que utilizam etanol 70%, um esterilizador talão ou desinfetante entre ratos.
- Monitorizar os ratinhos injectados durante dois dias após o procedimento de sinais de dor, infecção ou outras complicações. Injetar analgésicos em 24 e 48 horas (ou conforme indicado) após o procedimento. Remover suturas em 7 a 10 dias, se necessário.
- Avaliar os ratos para sinais clínicos da doença, paralysis, diminuição da atividade, perda de peso, convulsões ou doenças em geral.
- Acompanhar o desenvolvimento do tumor através dos meios apropriados [ressonância magnética (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc].
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Representative Results
Xenografts intracranianas confiáveis podem ser criados com esta técnica descrita. Identificando as estruturas críticas do crânio do rato (Figura 1) vai permitir o reconhecimento do bregma e guiar o investigador para um local de injecção precisa e reprodutível. Nestes estudos, a linha parental U251, células U251 transfectadas com luciferase (U251-Luc), ou U87 células imortalizadas de cultura de tecidos humanos GBM foram suspensos em 4 a 6 mL de SF-DMEM e injectados 2,5 milímetros lateral (direita), 1,5 mm anterior , e 3,5 mm ventral em relação ao bregma (Figura 2).
Os tumores resultantes podem ser visualizados e analisados por ressonância magnética (IRM, Figura 3), imagiologia in vivo luminescente (IVIS, Figura 4), ou técnicas de patologia brutas de rotina (coloração H & E, Figura 5). Um cuidado especial deve ser tomado e otimização realizada para determinar a appropriacélulas te e local de injecção para representar tempo, taxa de crescimento, e um modelo de tumor desejado.
Figura 1 Crânio anatomia. As características anatômicas da cabeça do rato e do crânio são ilustrados. O bregma, que é sobre o eixo da linha média entre os olhos e os ouvidos, na intersecção da coronal e as suturas sagital, é usado para localizar reproducibly as coordenadas de injeção.
Figura 2 Mapa de incisão e injecção. Os recursos utilizados para determinar a incisão da pele e precisa localizar o local da injecção são ilustrados. Uma incisão é feita na diagonal para permitir o acesso a ambos bregma e o local da injecção. Aplicação de 30% de H 2 O 2para a superfície do crânio ajuda a visualizar suturas cranianas. Posicione uma seringa com agulha na micropump e manobrar a ponta da agulha diretamente sobre o bregma. Ajustar as coordenadas no console de alinhamento para zero; todas as medições do crânio são então reproducibly feita com relação à bregma.
Figura 3. tumores de xenoenxertos intracranianos representativos: imagens de IRM IRM T2 imagens ponderadas de um tumor derivado de (A) 2 x 10 5 células U87 comparado com um tumor derivado de (B) 2 x 10 5 células U251.. volumes (C) Tumor calculados a partir de imagens de ressonância magnética de três camundongos injetados com células individuais U251 plotados ao longo do tempo mostra uma janela reprodutível de desenvolvimento e crescimento do tumor que é consistente em todos os experimentos.
Figura 4. tumores xenoenxerto representativos: imagens IVIS. IVIS imagem de U251-luciferase transduzidas células GBM injectados por via intracraniana em ratinhos nus (A). O mouse da esquerda foi injetado com sucesso, conforme descrito com células U251-Luc e mostra um sinal muito forte focalizada (fótons / s) no local desejado. O rato à direita demonstra um resultado mal sucedido do local de injeção imprópria. H & E exame da espinha revelaram crescimento de células de tumor da coluna vertebral resultantes de injecção muito próximo da linha média com difusão ventricular. (B) O tamanho do tumor é calculado a partir de actividade de luciferase (fotões / segundo) na região do cérebro de interesse, representados graficamente ao longo do tempo. A linha azul corresponde ao ratinho com uma injecção intracraniana bem sucedida, enquanto que a linha vermelha corresponde ao deslocamento do rato com células de tumor para a coluna vertebral.
Figura 5 H & E de tumores intracranianos de xenotransplante. Cérebros inteiros foram coletadas de camundongos postar sacrifício e fixadas em formol, montado em parafina, seccionados e corados com H & E. Tumor (A) foi obtido a partir de células U87 de GBM e ilustra uma área de crescimento denso tumor (canto superior esquerdo) e no tecido cerebral normal adjacente com invasão microscópica de células malignas (canto inferior direito). Tumor (B) foi feita a partir de uma secção de centro de um tumor derivado de células U251 GBM. A seção reproduz muito de perto a histopatologia bizarro com células malignas multinucleadas visto em GBM humano típico.
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Discussion
Modelos de mouse ortotópico de câncer de cérebro humano pode ser uma excelente ferramenta para avaliar a eficácia das terapias clínicas, mas é preciso ter cuidado para otimizar a colocação de células no tecido cerebral. Estudos têm demonstrado que os volumes de alíquotas excessivas, técnica de injeção abaixo do ideal e taxas de injecção precipitadas podem levar a leakiness eo aparecimento de células tumorais em locais indesejáveis (ventrículos, medula espinhal, regiões extradurais, etc.) E alta variação no tamanho do tumor 2 (observações pessoais ). Uma análise de distribuição accionado por microprocessador de amostras alveolares descobriram que a utilização de uma microbomba produzido entrega mais focalizadas, menos de refluxo de amostra e menor variabilidade do que os métodos manuais de injecção, atribuídas à, administração uniforme suave e pressões consistentes 3. Enquanto que pode ser difícil para condensar o número necessário de células num volume de apenas 2 ou 4 ul, o uso de um instrumento estereotáxico e consola de alinhamento equipped com uma micro-bomba programável pode produzir tumores reprodutíveis e confiáveis, com taxas de crescimento semelhantes. Um modelo de xenotransplante nunca pode realmente duplicar o microambiente, iniciação e desenvolvimento de um tumor que ocorre naturalmente, particularmente com deficiência do sistema imunológico anfitriões, mas um modelo ortotópico bem desenhado e implementado é a melhor alternativa e é muito superior ao de um modelo ectópica.
A grande vantagem deste protocolo é o estabelecimento de tumores detectáveis dentro de um prazo consistente. O tempo de aparecimento do tumor é dependente do tipo de células e do número de células injectadas, mas é razoavelmente previsível, e a maioria dos tumores são estabelecidos dentro de uma estreita janela de tempo em relação à duração do crescimento do tumor (isto é, o tempo até que ponto final). Isso permite que o pesquisador a identificar pontos de tempo para a coleta de dados (como ressonância magnética ou IVIS) ou intervenção (como tratamento medicamentoso). Taxas de crescimento do tumor variar com o tipo de célula, número de células injetadas, e from mouse para rato (tanto como eles fazem em pacientes humanos), mas são consistentes de experiência para experiência.
Embora este protocolo emprega uma técnica que pode necessitar de mais tempo do que instrumentos e métodos manuais exactas menos de injecção e pode não ser aplicável para investigações em larga escala, as técnicas de injecções intra-cranianas que permitem a transferência de grandes quantidades de animais (tal como a descrita por Iwami et al. 12), por definição, envolve, injeção rápida de alta pressão e muitas vezes envolvem instrumentação de mão e medição manual, que estão sujeitos à instabilidade e incerteza. Estes factores podem ser associados com o vazamento e para fora do alvo de entrega 2,3. A precisão, reprodutibilidade e baixa mortalidade deste procedimento permitirá ao investigador desenvolver experimentos de tratamento com menor número de ratos para obter resultados estatisticamente significativos - uma poupança líquida.
Um passo é crítico para osucesso da implantação do tumor: a localização precisa da injecção. As células injetadas muito perto dos ventrículos pode levar a CSF propagação da doença através do sistema ventricular ou em regiões extracranianas. As células injetadas muito raso pode crescer para fora através da pista agulha. Coordenadas pré-determinadas são de pouco valor se a colocação da agulha é desleixado. Tire um tempo para posicionar a cabeça do rato com segurança na unidade estereotáxico. Use as opções de ajuste estereotáxica e as barras de ouvido para ajustar o equipamento para o mouse, e garantir que a cabeça está posicionada de forma estável e não balançar ou torção durante o procedimento. As alterações ou variações se o local da injeção pode afetar as características do tumor, incluindo take tumor, o crescimento, o potencial invasivo, e acesso a entrega da droga e da oferta de oxigênio.
Outros parâmetros que têm um impacto profundo sobre o tumor resultante inclui a taxa de injeção, número e volume das células; tudo deve ser determinada empiricamente. Minimizar o volume do number de células necessário para o crescimento do tumor; utilizar a taxa de injeção mais lenta prático. Número de células e número de passagens também têm efeitos importantes sobre take tumor e taxa de crescimento. O equipamento especializado utilizado aqui oferece um controlo superior, mas os conceitos de volume mínimo, direccionamento preciso, a taxa mínima de injecção e consistente, e a retirada da agulha lenta pode ser aplicado a uma variedade de técnicas, incluindo injecção (manual) e uma variedade de instrumentos.
Este procedimento é aberto para uma variedade de modificações: o sítio da injecção pode ser personalizado para recapitular a determinados tipos de tumores. As células aderentes de cultura de tecidos, clones geneticamente modificados, neurospheres, tumores desagregados rato, ou fragmentos de tecidos humanos podem ser enxertados em um cérebro de camundongo. Esta técnica pode ainda ser adaptado para estudos alveolares, incluindo a transferência de genes virais 3. Depois de um método para a produção fiável de tumores das características desejadas é estabelecida, experiências comparando a eficácia de terapias, tratamentos com drogas e combinações, e outras opções, como a transferência de genes pode ser realizada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Dr. Keating é financiado pelo CA100335 concessão DOD e é um St. Baldrick Foundation Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
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