Skapa Anatomiskt noggranna och reproducerbara Intrakraniell xenografter för mänskliga hjärntumörer

Summary

Hjärnan är en unik plats med egenskaper som inte är väl representerade av in vitro eller ektopiska analyser. Orthotopic musmodeller med reproducerbara läge och tillväxtegenskaper tillförlitligt kan skapas med intrakraniella injektioner med hjälp av en stereotaktisk fixering instrument och ett lågtryckssprutpump.

Abstract

Ortotop tumörmodeller är för närvarande det bästa sättet att studera egenskaperna hos en tumörtyp, med och utan ingrepp, inom ramen för ett levande djur - särskilt på platser med unika fysiologiska och arkitektoniska egenskaper såsom hjärnan In vitro och ektopiska modeller inte kan. redogöra för funktioner som kärlsystemet, blodhjärnbarriären, metabolism, medicinering och toxicitet, och en mängd andra faktorer. Ortotop modeller har sina begränsningar också, men med rätt teknik tumörceller av intresse exakt kan inympade i vävnad som närmast efterliknar förhållandena i den mänskliga hjärnan. Genom att använda metoder som levererar exakt uppmätta volymerna att exakt definierade ställen på en konsekvent hastighet och tryck, musmodeller av mänskliga hjärntumörer med förutsägbara tillväxttakt kan reproducerbart skapas och är lämpliga för tillförlitlig analys av olika insatser. Protokollet som beskrivs här fokuserar på technical uppgifter om att utforma och förbereda för en intrakraniell injektion, utföra operationen, och säkerställa framgångsrik och reproducerbar tumörtillväxt och ger utgångspunkter för en rad olika tillstånd som kan anpassas för en rad olika hjärntumörmodeller.

Introduction

In vitro-studier av hjärntumörceller är ovärderliga för dissekera molekylära mekanismer som driver tillväxt, överlevnad, migration och invasion av cancerceller; odlade cellförsök kan definiera signalvägar, föreslår potentiella terapeutiska mål, och karakterisera cellulära svar på läkemedelsbehandling. Men in vitro-system är alldeles för naivt att förutsäga organism reaktion på läkemedel; de saknar fysiologiska reaktioner, immunsvar, cellmikromiljö och övergripande heterogenitet levande djursystem. Genmanipulerade modeller kan vara ovärderligt, när det är tillgängligt, men molekylära skillnader mellan arter och murina celler kan inte rekapitulera händelser i mänskliga processer, vilket resulterar i betydande skillnader när man jämför djurmodeller till kliniska observationer ^1. Mus xenograft modeller som involverar subkutan (SQ) injektion av humana hjärntumör cellinjer under huden i flanken är lätta att utföraoch mäta; de kan användas för att hantera effekterna av genmodifiering och läkemedelsadministrering / leverans, metabolism och toxicitet. Väsentliga nackdelar emellertid begränsa användbarheten av SQ modeller. Den mikromiljön inte rekapitulera den hos en naturligt förekommande hjärntumör: interaktioner mellan olika celltyper och vävnader; den lokala kärl, och otaliga andra faktorer unika för hjärnan kan inte replikeras. För att mer exakt återge den unika miljön i en naturligt förekommande hjärntumör och testa effekterna av läkemedels interventioner bör en mus orthotopic modellen utnyttjas. Vidare kan orthotopic tekniker användas som en del av en genetiskt modifierad metod där mänskliga primära icke-cancerceller (differentierade eller stamfader) är genetiskt modifierade och injiceras i den aktuella platsen för en mus, med eller utan humana stromaceller, vilket resulterar i tumörbildning liknande den som ses hos människor ^1.

I denna artikel beskrivsen metod för att exakt och reproducerbart skapa hjärntumörer i möss. Med denna teknik, kan användaren noggrant injicera en liten alikvot av suspenderade celler till en angiven plats på fronto-parieto-temporala regionen av mus hjärnbarken. Mus dödligheten är extremt låg; i våra händer, har inga möss dog av kirurgiska komplikationer efter 185 procedurer. Kännetecken för den resulterande tumören kan jämföras med den hos typiska humana kliniska tumörer; till exempel: snabba tillväxt, graden av nekros, omfattning invasion, heterogenitet celltyp, förekomst av mitotiska celler markörer för proliferation och apoptos, etc. cellinjer eller uppdelade mänskliga vävnader eller tumörprover kan sedan utvärderas baserat på deras förmåga att simulera faktisk klinisk presentation. Läkemedel, utvalda efter deras prestation i cellkultur, kan testas i samband med en fungerande ämnesomsättning, cirkulationssystemet, och blod-hjärnbarriären som de existerar i ett djur belastade withektar tumör, allt i en relevant arkitektoniskt sammanhang. Vidare kan cellerna som valts för injektion modifieras genetiskt för att undersöka effekterna av specifika knockdowns, deletioner, knock-ins, mutationer etc. på tumörtillväxt och överlevnad.

Ett antal publikationer dokumenterar tumörer studier med hjälp av olika intrakraniella tekniker. Yamada et al. Gjorde en detaljerad studie av injektion av färgämne och U87 celler och fann att minimera volym och injektionshastighet producerade den bästa tumör ^2. . Brooks et al fann överlägsen reproducerbarhet och effektivitet med hjälp av en mikroprocessorstyrd injektor i stället för en manuell metod för att leverera virala vektorer; sina slutsatser beträffande optimala insprutningsparametrar gäller för cell leverans ^3. Shankavaram et al. Visade att glioblastoma multiforme (GBM) cellinjer injiceras ortotopiskt (med hjälp av en manuell metod) in i hjärnan intagits genuttryck profilen för clinical tumörer närmare än både in vitro eller SQ implanterad, stödja användningen av intrakraniella modeller för prekliniska studier ^4. Giannini et al. Injiceras celler från humana kirurgiska prov som hade lidit i flankerna av nakna möss genom seriepassage in i hjärnorna på ytterligare möss, och visade att detta tillvägagångssätt konserverade patientens tumör genförändringar i modellen ^5. Liknande resultat rapporteras av Yi et al ^6. Med hjälp av en stereotaktisk setup, noggrant definierade injektionsstället, och en långsam och stadig insprutningshastighet, fick de reproducerbara hjärntumörer med konsekventa tillväxt och hög (100%) engraftment takt. Giltigheten av denna teknik har därför väl etablerad; en litteraturgenomgång visar att de tillämpningar av denna teknik är omfattande. Carty et al. Används intrakraniella injektioner för att framgångsrikt leverera virala vektorer som uttrycker terapeutiska gener i frontala cortex av transgenic modell av Alzheimers sjukdom ^7. Thaci m.fl.. Beskrev användningen av intrakraniella injektioner för att leverera terapeutisk onkolytisk adenovirus i en neural stamcell baserad bärare i nakna möss som redan bär ortotopiskt injicerade GBM tumörer ^8. Tydligt, intrakraniella injektioner är ett mångsidigt och effektivt verktyg för preklinisk forskning. Tidigare publikationer i The Journal of visualiseras Experiment beskriva grundläggande metoder ^9-11, men vi tar begreppet intrakraniella tumörinjektion och orthotopic modellering till en högre grad av precision med hjälp av lätt behärska tekniken.

Protocol

Alla beskrivna förfaranden granskats och godkänts av vår institutionella djuromsorg och använda kommitté.

1 Planera Experiment

1. Välj celler som ska injiceras. Celler från en rad olika källor är kandidater för injektion: vidhäftande cellkulturlinjer, genetiskt modifierade kloner, neuroniska element, kulturer eller disaggregerade tumörer. Den typ av modell önskas kommer att definiera den lämpligaste injektionsstället.
   1. Bestäm antalet celler för injektion. Antalet celler som krävs för att bilda tumörer varierar med cellinje och måste bestämmas empiriskt; tumörtillväxttakt beror mycket på celltyp, antalet celler och vävnadsodling passagenummer. Cell siffror mellan 1 x ^04-2 oktober x 10 ⁵ eller mer per injektion har producerat tumörer av olika tillväxthastigheter.
   2. Begränsa volymen för injektion. Cellerna bör upphävas i den minsta volymen av serum fria medier eller fosfatbuffrade saline (PBS) som möjliggör smidig, enkel passage genom en 26 G nål. Ju mindre volym som faktiskt levereras till hjärnan, desto mer exakt och definierat den resulterande tumören; optimala resultat erhålles genom att injicera volymer sträcker 3-6 pl. Plan för att framställa en slutlig total volym av åtminstone 50 l av suspenderade celler, oberoende av antalet injektioner som planeras, för att tillåta noggrann mätning, blandning och provtagning.
2. Välj lämplig möss för modellen. Musmodeller av humana tumörer använder typiskt unga immunkomprometterade möss för att undvika immunmedierad avstötning. Det är inte nödvändigt för att arbetet ska ske i ett biologiskt säkerhetsskåp, om lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas, bland annat sanering, desinficering och sterilisering av material och utrustning. Arbetet visas här har gjorts i atymiska nakna möss, manliga och kvinnliga, mellan 6 och 12 veckors ålder. Möss som väger mindre än 20 g kan vara svårt att placera in somtereotaxic ramen och kan vara mer mottagliga för hypotermi.

2 Montera Equipment

1. Skaffa och sanera en mus stereotaktisk ram, anpassning konsol, och mus gas anestesi huvudet innehavaren, mikropump, värmedyna, anestesiapparaten, fiberoptisk arbetslampa, och variabel hastighet roterande borr. Rengör och sanera all utrustning.
2. Programmera injektions parametrar (inklusive injektionsvolym, flödeshastighet, hastighetsenheter, sprut typ) och andra variabler som är nödvändiga för driften av sprutpumpen. Optimera inställningarna för varje modell.
   OBS: I dessa injektioner var inställningarna 3.000 nl prov med en hastighet av 400 nl / min (hastighetsenheter "M") med hjälp av en 25 l spruta (Device Type "E") i Ogrupperade ("N") läget.
3. Rengör en precisionsmikrospruta med 26 G nål med flera sköljningar i sterilt avjoniserat vatten (DIH ₂ O) och 70% etanol (EtOH), gör en sista riNSE med DIH ₂ O. Vissa, men inte alla modeller är konstruerade för att autoklaveras. Kontrollera att kolvrörelsen är jämn och fri.
4. Skaffa anestesiutrustning. Isofluran är den föredragna bedövningsmedel som det är lätt att reglera djupet och varaktigheten av anestesi. Se till att stereotaktisk enheten är utrustad med ett fäste musen anestesi gas och att den nödvändiga slangar och kopplingar finns på plats för att leverera gasblandningen från anestesiapparaten till musen.
5. Autoklav kirurgiska verktyg, inklusive fin spets sax, två pincett / peanger (med tänder) för suturering, medelstora sax, medellång och spetsig pincett, och minst två 1 mm tandborr. Håll instrument rent under förfarandet med 70% EtOH, desinfektionsmedel, eller en pärla autoklav.
6. Erhåll isofluran, analgetiska, oftalmisk salva / smörjmedel, antibiotisk salva, saltlösning, 30% väteperoxid (H ₂ O _2), antiseptisk, och benvax (om så önskas) från enveterinär eller medicinsk försörjning. Förbered sterila DIH ₂ O och 70% EtOH. Engångs såsom gasbinda kuddar, sterila förband, suturer, etanol kompresser, bomullsspets kompresser, sterila operationshandskar, kirurgiska knivar och fler är specificerade i listan material. En fin spets permanent markör för att markera skallen ska saneras och dedikerad för kirurgisk användning.

3 Förbered celler för Injection

1. I de experiment som visas här, välj en odödlig human GBM cellinje. Bestäm antalet celler (2 x 10 ⁵⁾ och volymen av suspension som skall injiceras (3 l) empiriskt; detaljer kan variera med celltyp. Använd en volym på minst 50 ^ för att underlätta noggrann mätning, blandning och injektion.
2. Trypsinisera celler och resuspendera i media eller PBS. Utför följande steg precis före cellinjektion:
   1. Ta bort media från celler genom aspiration och skölj med 10 ml PBS per 100 mm platta; avlägsna PBS.
   2. Add 1 ml trypsin till varje 100 mm platta och inkubera vid RT precis tillräckligt länge för att ge en enkelcellsuspension.
   3. Stoppa trypsinaktivitet med 5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum (FBS) per 100 mm platta.
   4. Pellets cellerna genom centrifugering vid 450 xg och återsuspendera i ~ 5 ml serumfritt DMEM (SF-DMEM) per 100 mm platta.
   5. Räkna livskraftiga celler med användning av en hemacytometer eller en automatiserad cellräknare.
   6. Justera den levande celldensitet till 2 x 10 ⁵ celler / 3 pl (eller såsom bestäms genom experiment) genom pelletering av cellerna och återsuspendering i SF-DMEM.
3. Håll celler kylda på is eller en chill pack (inte tillåter cellerna att frysa). Blanda försiktigt med finger snärta.

4 Bedöva och Förbered musen för kirurgi

1. Inducera anestesi med hjälp ~ 5% isofluran (syreflöde ~ 2 L / min) eller enligt anvisningar från veterinär. Induktion bör ta 2 till 3 minuter. Upprätt musen på tillräckligt djupav anestesi med ~ 3% isofluran.
   1. Kontrollera anestesidjup genom tå nypa, justera isofluran om indicerat och fortsätter att andas och tå nypa respons under hela förfarandet övervaka. Täck mus med gasbinda kuddar för värme och övervaka musen regelbundet under hela förfarandet, vilket kan ta 45 minuter till 1 timme, beroende på graden av injektionen.
2. Placera musen i stereotaktisk ram genom att försiktigt glida gommen bar över tungan och in i munnen. Haka framtänderna i tandhålet. Använd öron barer att stabilisera huvudet, med örat mot öga yta så nära horisontell som möjligt. Tvinga inte barer i hörselgången. Det är viktigt att placera huvudet ordentligt: ​​kolla från sida till sida och upp-och-ner rörelse försiktigt med fingertopparna. Använd de justerbara kontroller av stereotaktisk enheten för att optimera passformen.
3. Smörj ögonen med ögon salva. Rengör huden mellan öron och ögon två gånger med alternerande tillämpningar av en povidon-iodine antiseptisk och 70% EtOH.
4. Injicera valt smärtstillande subkutant (SQ) i flanken (eller enligt anvisningar).

5. Utför Injektion

1. Bestäm injektionsstället. Injektionsstället kan variera med storleken och stam av mus och den typ av cell. Celler injiceras för nära ventriklarna kan leda till kranio-spinal sjukdomsspridning. Celler injiceras för grunt kan växa ut genom nålen spåret.
   OBS: I de experiment som visas här, var målet definieras som den främre regionen av hjärnbarken sajt 2,5 mm i sidled (höger), 1,5 mm främre och 3,5 mm ventralt i förhållande till bregma valdes (Figur 1), som producerar en hjärnan tumör i möss från 20 till 30 g.
2. Gör ett litet snitt (~ 8 mm lång) med användning av steril teknik genom huden av huvudet för att exponera bregma och injektionsstället. Ett diagonalt snitt, från en punkt mellan mittlinjen axel och höger öga mot höger öra (
3. Dra in i huden och använda en steril bomullstopp för att torka ytan av skallen. Blot benet med en annan pinne fuktad med H ₂ O ₂ för att visualisera bregma. H ₂ O ₂ kommer att producera syrebubblor, som lämnar tunna linjer av vitt skum längs koronala och sagittal suturer som skär vid bregma.
4. Lås en tom spruta med nål på mikro och manövrera nålspetsen direkt över bregma; set-koordinater om anpassning konsol till 0,0 mm i sidled, 0.0 mm främre / bakre, och 0,0 mm ventralt / rygg.
5. Flytta nålen till 2,5 mm i sidled (höger) och 1,5 mm anterior avseende bregma (eller önskad plats) med hjälp av kontrollknapparna på stereotaktisk enheten. Lyft sprutan något och markera den exakta platsen på skallen med en dedikerad tuschpenna. Om den yttre ytan av skallen är inte på en nivå plan med bregma (i.e., rygg / ventrala samordna inte längre visar noll), återställ den ventrala / rygg läsning till 0,0 för att se till att djupet injektionen inte förskjuts.
6. Borra ett litet hål i skallen med en handhållen borrmaskin utrustad med en steril tand tips på lämplig plats markeras med pennan i steg 5.5. Håll borren i en vinkel mot skallen och mycket försiktigt röra spetsen på benet. Upprepa efter behov. Borrning nästan men inte helt genom benet, vilket lämnar nålen för att faktiskt penetrera detta skikt av skallen, resulterar i den renaste injektion.
7. Ta bort ben damm med en bomullspinne fuktad i PBS eller saltlösning. Återgå sprutan på pumpen och sänka nålen rakt ner till borrhålet för att bekräfta plats. Om borrhålet är inte centrerad med nålen, använd borren för att förstora öppningen.
8. Blanda försiktigt cellsuspensionen och dra cellerna i sprutan med hjälp av pumpstyrningen. Undvik bubblor och klumpar och torka nålen with en spritsudd för att avlägsna kontaminerande celler på utsidan. Om sprutan / nålen är igensatt eller frysta, ta bort och snabbt rent med sterilt vatten och 70% EtOH.
9. Sänk ner nålen till nivån av skallen ytan (0.0 mm ventralt / rygg). Sedan långsamt (under ca 1 min) sänka nålen att tränga igenom hela tjockleken av skallen och penetrera hjärnan till ett djup av 4 mm ventrall. Dra ut nålen långsamt till 3,5 mm ventrala. Om musen huvud hålls säkert på stereotaxic enhet, bör det finnas nästan ingen rörelse hos skallen.
10. Kontrollera att rätt parametrar förs in i pumpstyrningen (avsnitt 2.2) och tryck på "RUN / STOP" (eller enligt anvisningar från produkthandboken) för att autoinject celler. Övervaka musen och justera isofluran om indikerat. Titta på sprutan och säkerställa att kolven rör sig i cylindern. Frysta eller igensatt rörelse kan resultera i en böjd / trasig kolv.
11. Vänta 1-2 min med nålen i bregn, sedan mycket långsamt (över 3-4 min) dra nålen från vävnad. Total tid för att ta bort nålen efter injektionen är klar är 5 min. Använd en bomullspinne för att torka området runt borrhålet; lämna kanterna av huden öppen för att tillåta ben att torka.
12. Avlägsna sprutan från pumpen och snabbt spola 3x med sterilt _H2O, 3x med 70% EtOH och 3x med sterilt _H2O (eller enligt anvisningar från tillverkaren). Torka nål med EtOH och ställ åt sidan.
13. Applicera steril benvax (ekvivalent med 1 eller 2 | il) till borrhålet och använda trä änden av en steril bomullstopp för att tamp vaxet på och in i benet. Om ytan torkas på lämpligt sätt, bör det hålla.
14. Sprid steril duk över musen och omgivande arbetsområdet och sutur snittet; tre maskor bör räcka. Alternativt kan kirurgiskt bindemedel användas. Applicera en aktuell antibiotika.
15. Minska isofluran till 0% och ta bort musen från stereotaktisk enhet, är careful att skydda tänderna. Kolla öron, mun och tunga.
16. Övervaka musen noga efter injektion. Placera musen på en värmedyna för 5 till 10 minuter; sedan överföra till buren (på värmedyna) och observera tills musen vaknar och är ambulatorisk. Lämna inte musen utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt med medvetandet att behålla sternala bakåtlutad kroppsställning. Skicka inte tillbaka musen till sällskap med andra djur förrän återhämtat sig helt. Överväg att använda ytterligare smärtstillande, om tecken på smärta är märkt.

6 Slutför och bildskärm Recovery & Tumör Utveckling

1. Rengör alla instrument och utrustning som använder 70% EtOH, en pärla autoklav eller desinfektionsmedel mellan möss.
2. Övervaka de injicerade möss för två dagar efter det att förfarandet för tecken på smärta, infektion eller andra komplikationer. Injicera smärtstillande vid 24 och 48 timmar (eller som indikerade) efter förfarande. Ta bort suturer vid 7 till 10 dagar, om det behövs.
3. Utvärdera mössen för kliniska tecken på sjukdom, paralysis, minskad aktivitet, viktminskning, kramper, eller allmän sjukdom.
4. Övervaka tumörutveckling genom lämplig metod [magnetisk resonanstomografi (MRT), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc].

Representative Results

Pålitliga intrakraniella xenografter kan skapas med detta beskrivna tekniken. Identifiera de kritiska strukturer musen skallen (Figur 1) kommer att möjliggöra erkännande av bregma guide utredaren till en exakt och reproducerbar injektion plats. I dessa studier på U251 föräldralinjen, U251 celler transfekterade med luciferas (U251-Luc), eller U87 förevigat mänskliga GBM vävnadsodlingsceller suspenderades i 4-6 l av SF-DMEM och injicerades 2,5 mm i sidled (höger), 1,5 mm anterior och 3,5 mm ventralt i förhållande till bregma (Figur 2).

De resulterande tumörerna kan visualiseras och analyseras av magnetisk resonanstomografi (MRT, figur 3), in vivo självlysande imaging (IVIS, figur 4), eller rutinmässiga brutto patologi tekniker (H & E-färgning, Figur 5). Särskild försiktighet måste iakttas och optimering för att bestämma den appropriate celler och placering av injektion för att representera timing, tillväxttakt, och tumörmodell önskas.

Figur 1 skalle anatomi. De anatomiska särdrag hos mus huvud och skalle illustreras. Den bregma, som är på mittlinjen axel mellan ögonen och öronen vid skärningen mellan den koronala och sagittala suturer, används för att på ett reproducerbart sätt lokalisera injektions koordinaterna.

Figur 2. Incision och injektion karta. De funktioner som används för att bestämma huden snitt och exakt lokalisera injektionsstället illustreras. Ett diagonalt snitt görs för att medge tillgång till både bregma och injektionsstället. Tillämpning av 30% H ₂ O ₂till ytan av skallen hjälper att visualisera suturerna. Placera en spruta med nål på mikro och manövrera nålspetsen direkt över bregma. Set-koordinater på inriktnings konsolen till noll; alla mätningar skalle sedan reproducerbart görs med avseende på bregma.

Figur 3. Representativa intrakraniella xenotransplantattumörer: MRI-bilder MRI T2 viktade bilder av en tumör som härrör från (A) 2 x 10 ⁵ U87 celler jämfört med en tumör som härrör från (B) 2 x 10 ⁵ U251 celler.. (C) Tumörvolymerna beräknas från MRI-bilder av tre individuella möss som injicerats med U251-celler plottas över tid visar en reproducerbar fönster för tumörutveckling och tillväxt som är konsekvent i alla experiment.

Figur 4. Representativa xenotransplantattumörer: IVIS bilder. IVIS bild av U251-Luciferas transducerade GBM celler injicerats intrakraniellt i nakna möss (A). Musen till vänster framgångsrikt injiceras som beskrivits med U251-Luc-celler och visar en mycket stark focalized signal (fotoner / sek) på önskad plats. Musen till höger visar ett misslyckat resultat av felaktig injektions plats. H & E undersökning av ryggraden avslöjade tumörcelltillväxt i ryggraden till följd av injektion för nära mittlinjen med ventrikulär spridning. (B) Tumörstorleken beräknas från luciferasaktivitet (fotoner / sekund) i hjärnan regionen av intresse, plottas över tiden. Den blå linjen motsvarar musen med en framgångsrik intrakraniell injektion, medan den röda linjen motsvarar musen med tumörcellförskjutning till ryggraden.

Figur 5 H & E i Intrakraniella xenotransplantattumörer. Hela hjärnor samlades från möss posta offer och fixerades i formalin, monterade i paraffin, snittades och färgades med H & E. Tumör (A) erhölls från U87 GBM celler och illustrerar ett område med tät tumörtillväxt (vänstra övre hörnet) och närliggande normal hjärnvävnad med mikroskopiskt invasion av maligna celler (högra nedre hörnet). Tumör (B) togs från en del av centrum för en tumör som härrör från U251 GBM-celler. Avsnittet replikerar mycket nära den bisarra histopatologi med flerkärniga maligna celler ses i typiska mänskliga GBM.

Discussion

Orthotopic musmodeller av human cancer i hjärnan kan vara ett utmärkt verktyg för att bedöma effektiviteten i kliniska terapier, men vård måste vidtas för att optimera placering av celler i hjärnvävnad. Studier har visat att alltför stora alikvot volymer, suboptimal injektionsteknik och förhastade injektionstakt kan leda till läckage och uppkomsten av tumörceller i oönskade lägen (ventriklar, ryggmärg, extradural regioner, osv.) Och hög variation i tumörstorlek ² (personliga observationer ). En analys av mikroprocessorstyrd leverans av icke-cellulär prover funnit att användningen av en mikropump producerade mer focalized leverans, mindre prov reflux och mindre variabilitet än manuella metoder för injektion, hänföras till en smidig, jämn leverans och konsekventa tryck ^3. Medan det kan vara svårt att kondensera behövs antalet celler i en volym av endast 2 eller 4 | il, användningen av ett stereotaxiskt instrument och uppriktning konsol ekvuipped med en programmerbar mikropump kan ge reproducerbara och tillförlitliga tumörer med liknande tillväxttal. En xenograftmodell kan aldrig riktigt duplicera mikromiljön, initiering och utveckling av en naturligt förekommande tumör, särskilt immun bristfälliga värdar, men en väl utformad och genomförs orthotopic modell är det bästa alternativet och är vida överlägsen en ektopisk modell.

Den stora fördelen med detta protokoll är att upprätta detekterbara tumörer inom en enhetlig tidsramen. Tidpunkten för tumör utseende är beroende av celltyp och antalet celler som injicerats, men är relativt förutsägbar, och de flesta tumörer är etablerade inom ett smalt fönster av tid i förhållande till varaktigheten av tumörtillväxt (dvs tiden tills slutpunkt). Detta gör det möjligt för forskare att identifiera tidpunkter för datainsamling (t.ex. MR eller IVIS) eller ingrepp (såsom läkemedelsbehandling). Tumörtillväxttakten varierar med celltyp, antal celler injiceras, och frOM mus mus (mycket som de gör hos människor), men är konsekvent från experiment till experiment.

Även om detta protokoll använder en teknik som kan kräva mer instrumentering och tid än mindre exakta manuella metoder för injektion och kan inte tillämpas på storskaliga undersökningar, tekniker för intrakraniella injektioner som tillåter genomströmning av ett stort antal djur (t.ex. som beskrivs av Iwami et al. ¹²⁾ per definition innebära en snabb, högtrycksinjektion och innebär ofta handhållna instrument och manuell mätning, som är föremål för instabilitet och osäkerhet. Dessa faktorer kan associeras med läckage och off-target leverans ^2,3. Precisionen, reproducerbarhet och låg dödlighet i den här proceduren gör att utredaren att utforma behandlings experiment med färre möss för att få statistiskt signifikanta resultat - en nettobesparing.

Ett steg är avgörande förframgången för tumörimplantation: den exakta platsen för injektionen. Celler injiceras för nära ventriklarna kan leda till CSF-spridning av sjukdom genom det ventrikulära systemet eller i extrakraniella regioner. Celler injiceras för grunt kan växa ut genom nålen spåret. Förutbestämda koordinater är av föga värde om nål placering är slarvig. Ta dig tid att placera musen huvudet ordentligt i stereotaktisk enheten. Använd stereotaktiska justeringsalternativ och örat barer att montera utrustningen till musen, och se till att huvudet är stabilt placerad och kommer inte rock eller vridning under förfarandet. Ändringar eller variation, om injektionsstället kan påverka tumöregenskaper, inklusive tumör take, tillväxt, invasiv potential, samt tillgång till läkemedelstillförsel och syretillförsel.

Andra parametrar som har en djupgående inverkan på den resulterande tumören inkluderar insprutningshastigheten, mobilnummer och volym; alla måste bestämmas empiriskt. Minimera volymen för number av celler krävs för tumörtillväxt; använda den långsammaste insprutningshastigheten praktiskt. Cell nummer och passagenummer har också stora effekter på tumör ta och tillväxt. Den specialutrustning som används här ger överlägsen kontroll, men begreppen minimal volym, exakt inriktning, minimal och konsekvent insprutningshastigheten, och långsam tillbakadragande nål kan appliceras på en mängd olika tekniker (inklusive manuell injektion) och en mängd olika instrument.

Detta förfarande är öppen för en mängd olika modifikationer: injektionsstället kan anpassas för att rekapitulera särskilda typer av tumörer. Adherenta vävnadsodlingsceller, genetiskt modifierade kloner, neurosfärer, disaggregerade mustumörer eller humana vävnadsfragment kan inympade i en mushjärna. Denna teknik kan även anpassas för icke-cellulär studier, inklusive viral genöverföring ^3. När ett förfarande för att tillförlitligt producera tumörer av de önskade egenskaperna är etablerad, experiment jämföra effikans av terapier, läkemedelsbehandling och kombinationer och andra alternativ såsom genöverföring kan utföras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B
Mouse Ear Bars	Kopf	Medel 922
Fiber Optic Illuminator	Fisher	12-562-36
UltraMicroPump III	WPI	UMP3
Micro4 microprocessor	WPI	UMC4
Variable speed hand-held rotary drill	Dremel	Model 300
Dental drill bit, 1.0 mm	Spoelting	514554
Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet	Dremel	481
Heating pad			for mice
Isoflurane vaporizer system			for mice
Medical tubing and connectors			to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame
Instruments
Precision 25 μl microsyringe	Hamilton	7636-01	Model 702, without needle
Microsyringe needles, 26s G	Hamilton	7804-04	RN, 25 mm point style 2
Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)
Medium-sized standard scissors
Standard serrated forceps
Serrated hemostats (2)
Fine-tipped forceps
Supplies
Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)	MWI	J463G
Surgical blades #10, stainless (Feather)	Fisher	296#10
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	NDC 13985-528-60	Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)	Pfizer	NDC 61106-8507-01	dilute in saline
Ophthalmic ointment (artificial tears)	Rugby	NDC 0536-6550-91
Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )	Akorn	NDC 17478-238-35
Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)	Betadine	NDC 67618-150-04
Hydrogen peroxide, 30%	Fisher	H325-100	for visualizing skull landmarks
Sterile saline	VetOne	NDC 13985-807-25	for diluting solutions, cleaning tissue
Bone wax	WPI	Item #501771
Sterile drapes	McKesson	25-517
Sterile surgical gloves	McKesson	(to fit)
Sterile gauze pads, 2 x 2	Fisherbrand	22028556
Sterile gauze pads, 4 x 4	Fisherbrand	22-415-469
Alcohol prep pads (medium)	PDI	B603
Sterile cotton-tipped applicators	Fisherbrand	23-400-114
Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells	USA Scientific	1405-4700	for cells
Individually wrapped sterile dispo pipettes	Fisher	BD 357575	for needle cleaning solutions
BD insulin syringes with needles	Fisher	329461	for analgesic
70% Ethanol			for cleaning
Sterile diH2O			for cleaning
Microfuge tubes for cleaning solutions			for needle cleaning solutions
Felt tip pen (dedicated)			for marking skull