Abstract
פירוק חלבונים על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) הוא מנגנון רגולציה עיקרי להומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. הגישה סטנדרטית לקביעת פירוק חלבונים תאיים מסתמכת על מבחני ביוכימיים לבעקבות קינטיקה של ירידת חלבון. שיטות כאלה הן לעתים קרובות מייגע וגוזלים זמן ולכן לא ניתן לניסויים שמטרתם להעריך את מצעים מרובים ותנאי השפלה. כחלופה, מבחני מבוססי צמיחת תאים פותחו, שהם, בפורמט קונבנציונלי, מבחני נקודת סיום שלהם שלא ניתן לקבוע כמותית שינויים יחסי ברמות חלבון.
כאן אנו מתארים שיטה שבנאמנות קובעת שינויים בשערי פירוק חלבונים על ידי צימודם לקינטיקה תא צמיחת שמרים. השיטה מבוססת על מערכת בחירה הוקמה בי auxotrophy אורציל של URA3 -deleted תאי שמרים הוא חולץ על ידי חלבון כתב הביע באופן אקסוגני, מורכב מהיתוך בין גן URA3 החיוני ומכריע השפלה (degron). חלבון הכתב מתוכנן כך ששיעור הסינתזה שלה הוא קבוע בזמן שקצב הפירוק שלה נקבע על ידי degron. כצמיחת תאים במדיום אורציל הלקוי היא פרופורציונלית לרמות היחסית של URA3, קינטיקה הצמיחה הן תלויה לחלוטין בפירוק חלבוני כתב.
שיטה זו מדויקת מודדת שינויים בקינטיקה פירוק חלבונים תוך-התאית. זה היה מוחל על: (א) הערכת התרומה היחסית של גורמי conjugating היוביקוויטין ידועים proteolysis (ב) E2 מבנה-תפקוד אנזים conjugating מנתח (ג) זיהוי ואפיון של degrons רומן. יישום של המערכת מבוססת URA3 degron- מתעלה תחום פירוק החלבונים, כפי שהוא יכול גם להיות מותאם לשינויי ניטור של רמות חלבון הקשורים לפונקציות של מסלולים סלולריים אחרים.
Introduction
מערכת השפלה יוביקוויטין-פרוטאזום היא מכונה רגולטורים גדולה, שהיה מעורבת בשמירה על הומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. UPS תחילה conjugates מולקולות יוביקוויטין מרובים לחלבון מטרה לאחר שחלבון פולי-יוביקוויטין מתויג הוא מושפל על ידי הפרוטאזום 26s. ברוב המקרים, שיעור הגבלת צעד להשפלת יוביקוויטין תיווך הוא ubiquitylation מצע, בתיווכו של E2 ו- E3 conjugating אנזימי ligating אנזימים (Ligases E3) 1. כתוצאה מכך, יציבות תאית של חלבונים ספציפיים משקפת את הרגישות שלהם ליוביקוויטין-נטיה ואת הפעילות של אנזימי ubiquitylation המקור שלהם.
ligases E3 הם מרכיבי הכרת המצע העיקריים של UPS. ככזה, אנזימים אלה להכיר degrons בתוך מצעים שלהם, כי הם קיימים או לא נחשפו בעמיתים שלהם יציבים 2. לדוגמא, רגולטורים רבים של מ 'מחזור התאיוסט להיות מסונתז ומושפל באופן באופן זמני ספציפי על מנת לשמור על התקדמות מחזור התא כדי. הפירוק של חלבונים אלה נשלט בדרך כלל על ידי זרחון, בתיווכו של קינאז המוסדר איתות התא 3,4. מצד השני, מוכרים חלבונים מקופלים aberrantly דרך degrons הנסתר. אלה הם אזורים שהם בדרך כלל חבויים במבנה היליד ונחשפים על ההפרעות מבנה. degrons אלו כולל תחומים הידרופובי 5-7 ומגזרים במהות סדר 8.
מאז גילוי הזרע של יוביקוויטין-המערכת לפירוק חלבונים ואפיון של עקרונות היסוד שלה בlysates reticulocyte 9, שמרי גנטיקה סייעה בגילוי רב של הרכיבים במערכת היוביקוויטין 10. ההצלחה של שמרי כאורגניזם מודל לניתוח שיטתי של פירוק חלבונים על ידי UPS היא בעיקר בשל העובדה כי UPS היא גבוההly נשמרים בכל אאוקריוטים 4, בשילוב עם amenability כמערכת ניסיונית. ואכן, מערכות המבוססים על שמרים בדרך מועסקות לפענח את מנגנוני פעולה של מכונות ubiquitylation.
לומד פירוק חלבונים באמצעות יוכימיים בדרך כלל דורש הכנת תמציות תא. בעוד ניתן לחלץ חלבוני תא חי בתנאים מתונים יחסית השומרים על אינטראקציות חלבון ותפקוד, הנוכחות של דופן תא חזקה בשמרים 11 דורשת תנאי הפרעה להחמרה ניכרת שבעלולים להשפיע על התאוששות חלבון. ואכן, הליכים שונים להפרעת תא שמרים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לשחזר את החלבונים שלמים בסכומים שבצורה נכונה לייצג השפע הסלולרי היחסי שלהם. אי דיוק נוסף טמון בשיטות השונות מועסקות לקביעת תעריפי פירוק של חלבונים ספציפיים: ניסויי מטבוליות המבוסס על תיוג "דופק מרדף" אחרי immunoprecipitation, כדי לבודד חלבונים ספציפיים 12, הוא לעתים קרובות לא כמותי בקפדנות. לכן, כאשר פירוק חלבונים בהשוואה בשיטה זו, זהירות צריכה להיות למימוש בלפרש את התוצאות. כדי לעקוף את זה חסרון, יכול להיות מועסק assay מרדף cycloheximide חלופי (CHX) 12. ב assay זה, מעכב התרגום יתווסף לתרביות תאים ושינויים זמניים ברמות מצב יציב חלבון נמצאים במעקב בהמשך. עם זאת, השימוש בCHX מוגבל לחלבונים עם מחצית חיים קצרים יחסית (<90 דקות), כמו עיכוב ארוך טווח של סינתזת חלבון הוא רעיל לתאים. יש לציין, שניהם מבחני הנ"ל דורשים שימוש בנוגדנים ספציפי לחלבון, שאינם תמיד זמינים.
כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה, חוקרים פיתחו כמה גישות שאינם דורשים מיצוי תא וטיפול חלבון ישיר. גישה אחת מבוססת על הקמת כן auxotrophicזני st, שהושגו על ידי המחיקה של גני המקודדים אנזימים מטבוליים חיוניים. גנים אלה כוללים HIS3, LEU2, LYS2 וTRP1, קידוד לאנזימים דרושים לסינתזה של חומצות אמינו, כמו גם URA3 שמקודד decarboxylase OMP (URA3), אנזים חיוני של סינתזת ribonucleotide פירימידין. URA3 כבר בשימוש נרחב במחקרי פירוק חלבונים. במבחנים אלה, ביטוי מכונן של URA3 מציל צמיחה של תאי URA3 במדיום אורציל לקוי 13. כתוצאה מכך, ערעור יציבות URA3 באמצעות השילוב של degron יכולה להפחית צמיחת תאים באורציל הבינוני חסר המינימלי. שיטה זו נעשתה שימוש במחקרי פירוק חלבונים שונים, כוללים זיהוי של השפלה גורמי 5, E3 ligases 14 וubiquitylation עזר גורמי 15 וגילוי degrons UPS רומן 16. כל השיטות האלה מועסקות צמיחת תאים על צלחות אגר כקריאת assay. עם זאת, לאהוא קריטריון צמיחה (צמיחה חיובית / שלילית), ואילו חזק ויעיל, הוא בעיקר איכותי ואינו מספק מידע כמותי שהוא חשוב להערכת העוצמה של degron או את תרומתו היחסית של גורמי השפלה עזר שונים.
לכן פיתחנו ומנוצלים וקטורי שמרים ושיטות הקרנה המאפשרים ניתוח שיטתי וכמותית של פירוק חלבונים על ידי URA3 -degron מערכת היתוך. הפרוטוקול מבוסס על assay-לידית קלה המודד קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי (GiLS) ועל הדור של עקומות גדילה סטנדרטית. קינטיקה צמיחת שמרים מתאפיינות בשלושה שלבים עיקריים - הפיגור, מעריכי (יומן) ושלב הנייח. חישוב קינטיקה שמרי שכפול בשלב היומן בתנאים סלקטיבית, אשר נקבע על ידי רמות ביטוי של URA3-degron, מספק o מדידת כמותית בלתי משוחדתפירוק חלבונים ו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת למדידה והשוואה של שיעורי השפלה של מצעי UPS המרובים בו זמנית במספר רב של זנים ובתנאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תרבות 1. תא
- להפוך את התאים המתאימים auxotrophic שמרים, כגון Try467 (טבלה 2), עם פלסמיד המכיל (א) URA3 -degron היתוך ו- (ב) סמן חילוף חומרים נוסף לבחירת פלסמיד ותחזוקה.
הערה: דוגמא של פלסמיד המתאים היא YDpK-MET25p-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) זה פלסמיד אינטגרטיבי שמרים המכיל חלבון היתוך הכולל Deg1 - degron נגזר משמרי השעתוק. גורם Mat2 17, epitope FLAG - לגילוי על ידי immunoblotting, Vma12 - חלבון ER יציב, וURA3 15,18 (איור 3 א). (ראה טבלה 3 לפלסמידים ששמשו במחקר זה ולדוגמאות נוספות של פלסמידים מתאימים.) - לבחירת פלסמיד ותחזוקה, לשמור על תאים בצלחות אגר תחת סינטטי מתאים המוגדרות בינוני (SD) חסר סמני בחירת אמינו חומצה
- לגדל תאי O / N ב 30 מעלות צלזיוס במדיום SD סלקטיבית מתאים לתחזוקת פלסמיד עד שיגיע לשלב נייח. לגדול תאים במבחנות או בצלחת 96-היטב, בהתאם למספר הדגימות שנבדק (סעיף 2).
תא הכנה 2. לניתוח
- כאשר מספר קטן של דגימות (N≤15) יש assayed, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום באופן הבא:
- לדלל 50 μl של תאים מO / תרבות N עם 150 μl של מדיום SD לכל גם ב96-גם צלחת (תחתון ברור). שים לב, לדוגמא הראשונה היא יועדה ריק מכילה בינוני בלבד.
- לקבוע 600 OD הערכים של הדגימות בצלחת 96-היטב באמצעות קורא microplate.
- לחשב את OD בפועל 600 בכל טוב על ידי הכפלת קריאת OD 600 על ידי הגורם לדילול (x4), שמ"שIch הערך של הקריאה ריקה מופחת. לנרמל את הערכים וכתוצאה מכך על ידי החלוקה ב -0.55 כדי להשיג נתיב באורך מחושב של 1 סנטימטר על פי חוק באר-למברט. שים לב, ערך זה הוא קבוע בעת מדידת OD 600 של 200 μl של תאים בצלחת 96-היטב סטנדרטית.
- חשב את הנפח המדויק הנדרש להשגת תאי שמרים בסכום שווה ערך ל OD 600 של 0.25 ולהעביר אותו לצינור Eppendorf.
- ספין למטה התאים במהירות גבוהה (12,000 XG) 1 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מיליליטר של המדיום סלקטיבית המתאים (ראה סעיף 3.1) כדי לקבל OD 600 של 0.25.
- העבר את 200 μl של הזנים מדוללים לבאר חדשה בצלחת 96-היטב.
- כאשר מספר גדול של דגימות (N> 15) הוא להיבדק, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום ללא מדידה OD 600 לפני, כדלקמן:
- העבר את 10 μl של תאים נייחיםO הבוגר / N בצלחת 96-היטב לתוך צלחת 96-היטב חדשה המכילה 190 μl (דילול 1:20) של התקשורת סלקטיבית המתאימה (ראה סעיף 3.1).
3. קינטיקה צמיחה בנוזל תרבות תחת תנאי סלקטיבי (GiLS)
- השתמש בכלי התקשורת הבא למדידות צמיחה באמצעות כתב URA3-degron:
- לביקורת חיובית של צמיחת שמרים בתנאים שאינם מגבילים, SD תקשורת סלקטיבית פלסמיד השימוש (ראה סעיף 1.2). אם לא נדרשת בחירת פלסמיד, למשל, בעת השימוש בפלסמיד אינטגרטיבי כגון Deg1 -UV, בינוני SD המכיל את כל החומצות האמיניות הדרושות (SD מלא) ניתן להשתמש.
- לדגימות ניסוי מדידת צמיחה בתנאים מגבילים, להשתמש בינוני SD-URA.
- הגדר קורא microplate multimode ל:. טמפרטורת דגירה של 30 מעלות צלזיוס, OD 600 מרווחי מדידה של 15 דקות, ומחזורים מסלולית וליניארי רועד של 1 דקות כל שבע דקות <br /> הערה: המצב הכפול הזה יזעזע את האמות היה מותאם כדי להשיג חלוקה הומוגנית של תאים; עם זאת, מצבים רועדים אחרים או אפילו לא רעד יכולים לעבוד גם כן.
- דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בmicroplate קורא O / N או עד תאים הגיעו השלב הנייח (HR 12-24).
- לייצא את הנתונים הגולמיים לקובץ גיליון אלקטרוני.
- לקבוע קינטיקה צמיחת שמרים באמצעות MDTcalc, תוכנה מותאמת אישית, שמחשבה את הזמן המינימלי (בשעות) לתאים להכפיל את גודל האוכלוסייה שלהם (זמן הכפלה מינימאלי (MDT); לפרטים ראו סעיף 4).
4. חישוב זמן הכפלה המינימלי (MDT): עקרונות של אלגוריתם MDTcalc
הערה: עקרונות של אלגוריתם MDTcalc, באמצעות מדגם מייצג של תאי Try467 שמרים (טבלה 2) גדלו בתקשורת מלאה SD, באות לידי ביטוי בטבלה 1 ואיור 1, מראה מגרשי גיליון אלקטרוני נתונים וצמיחה, respecבקנייה.
- לחסר OD 600 ערכים ריקים, שהושג בבאר בהתאמה, מכל אחת מהקריאות המתקבלות גם במדגם. מחלקים את ההפרשים נובעים ב -0.55 (ל96-גם צלחות) כדי לתקן את אורך נתיב אור. העלילה הערכים הסופיים (טבלת 1, Trans.) נגד זמן כדי לייצר את עקומת צמיחת שמרים בפועל (OD 600 / hr) (איור 1 א).
- לחשב יומן 2 (OD 600) לכל אחד מהערכים הפכו להמיר את שלב צמיחת לוגריתמים לעקומה ליניארית (איור 1).
- לחשב את השיפוע של מרווח 10 נקודות זמן (N = 10) מתחיל בשעה 0 ומרגש נקודת זמן אחת בכל פעם, עד N <10 (טבלה 1, מדרון; איור 1 ג ').
- לחשב את הערך ההופכי של כל מדרון כדי לקבל את הזמן הדרוש לאוכלוסיית התאים להכפיל (טבלת 1, 1 / מדרון; איור 1 ג '). לחשב המינימלי1 / ערך מדרון כדי לקבוע את MDT (טבלת 1, המלבן שחור; איור 1 ג '). חלץ את MDT שחושב לתאים במדגם (טבלה 1, 1 / סלופ, מלבן שחור) מהמרווח שנבחר הזמן (טבלת 1, שתואר על ידי מלבן אדום, איורים 1B, 1D).
הערה: שיעור צמיחת תאים במדיום SD-URA הוא ביחס הפוך לMDT.
5. שימוש MDTcalc
- העתק את קבצי תכנית בתוספת לתיקייה ייעודית במחשב.
- ודא שקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל נתוני הצמיחה נשמר ונסגר. פתח את תכנית יישום MDTcalc לראות את תחילת הופעת מסך.
- הכנס את המידע הנדרש, כפי שהודגם באיור 2:
- תחת 'נתיב קובץ', לחץ על המלבן בצד הימין כדי לאתר את קובץ הגיליון האלקטרוני.
- תחת 'שם גיליון', לכתוב את שם הגיליון האלקטרוני שבו לאהוא מידע גולמי נמצא.
- תחת 'החל העמדה, להכניס את הגיליון האלקטרוני לתאם זמן 0 מהמדגם הראשון.
- תחת 'עמודת זמן', להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של עמודת נקודת הזמן (הזמן צריך להינתן בשניות).
- תחת 'עמודה ריקה', להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של העמודה ריקה (בדרך כלל, אך לא בהכרח ובA1 של צלחת 96-היטב).
- תחת 'ערך OD ", לבחור ערך OD 600 המינימלי הפך נדרש לייזום חישוב MDT (בדרך כלל .15-.25). הגדרת ערך זה מונע חישובים של MDT לתרבויות בשלב פיגור עקב דילול מוגזם, כך שMDT מחושב רק עבור דגימות המגיעות לערך OD 600 המוגדר או גבוה יותר.
- ברגע שהערך האחרון כבר נכנס, לחץ על הכפתור 'המחשבון' בחלק התחתון של המסך. ודא שסרגל ההתקדמות בצד הימין משתנה בהדרגה לזנענעה. אל תפתחו את קובץ הגיליון האלקטרוני במהלך תהליך החישוב.
- לייצא שתי קבוצות של נתונים המופיעות באופן אוטומטי על המסך בסיום חישוב MDT לגיליון אלקטרוני. יש לוודא שהנתונים כוללים: (א) ערך MDT לכל טוב שעובר את מבחן ערך OD המינימלי (כמפורט בסעיף 5.2.1.6) ונקודת הזמן הראשונית של הרווח ממנו MDT חושב (ב) (התחל זמן).
- הכנס את המידע הנדרש, כפי שהודגם באיור 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חוקר את תפקידם של אנזימים של מסלול Doa10 בהשפלתו של מצע כתב
כדי לבדוק את תקפותה של שיטת GiLS זה היה בהשוואה לassay השפלה מסורתית. ניסוי זה מעריך את תרומתו היחסית של רכיבים של ER-הקרום מקומי Doa10 E3-האנזים מורכב 20,21 לזילות של מצע כתב בקרת איכות חלבון Deg1- VU (איור 3 א). פלסמיד Deg1- VU שולב תאים מסוג בר או לתאים חסרי הגן לאנזים conjugating E2, UBC7 (ubc7) ויציבות חלבון נקבעו לאחר מכן על ידי assay מרדף CHX 6. immunoblotting אנטי-הדגל חשף להקת חלבון Deg1 -VU יציבה בתאי ubc7 שנעדרו בתאים פראיים סוג (איור 3 ב). היעדר Deg1 -VU בתאים מסוג בר הוא attribuטד השפלה המתמשכת שלה שבוטלה בתאי ubc7, מצביע על כך שיציבות Deg1 -VU תלויה מאוד על Ubc7.
כמובן, את ההשפלה של Deg1- VU היא מהירה. עם זאת, השיעור היחסי של השפלה לא ניתן לקבוע על ידי assay CHX מאז החלבון הוא בלתי ניתן לגילוי בתאים מסוג בר מלכתחילה. כתוצאה מכך, שיטת assay GiLS החדשה שפותחה הועסקה, על מנת להשוות את ההבדלים יחסי בקינטיקה של פירוק חלבונים בין wild-type וזנים שונים שעברו מוטציה (איור 3 ג). בתחילה, סוג תאים, ubc6, ubc7 או doa10 פראיים להביע Deg1 -VU גדלו על מדיום מלא SD. כדי למדוד GiLS, תאים נשטפו וטופחו בSD-URA. חישוב MDT הוצא להורג כפי שהודגם בפרוטוקול. 3C דמויות, 3D להראות עקומות דומות צמיחה וMDT מחושב (~ 2.5 שעות) עבור כל הזנים גדלים בSD מלא, excluding האפשרות שאת המחיקה של כל אחד מהגנים שנבדקו משפיעה על גדילת תאים. בניגוד לכך, דגירה בSD-URA הביאה לצמיחה ירודה של תאי wild-type (MDT = 6.34), בעוד שרק פגם צמיחת קטין נצפה בזנים מוטנטים (MDT ~ 3 שעות).
בוחן את ההשפעה של מוטציות שונות של אנזים conjugating Ubc7 E2 על השפלה של Deg1- VU
העובדה שUbc7 דרושה לחלוטין לשפלת Deg1- VU מאפשרת הערכה מדויקת של אף השפעות חלקיות של מוטציות E2 שונות, שכן הטווח הניסיוני של המערכת הוא רחב מאוד. בהתאם לכך, פלסמידים המכילים סוג בר או UBC7 מוטציה שולבו תאי Ubc7 להביע Deg1 -VU ותרומתם להשפלה נקבעה על ידי GiLS. כצפוי, קינטיקה צמיחה מהירה נצפתה בתאים המבטאים Ubc7 עם mu הפעיל באתרC89S tants ו -22 N81A (איור 4). בנוסף, שתי מוטציות צפויות לעכב באופן עקיף השפלה Deg1 -VU (V25G וH94K) נבדקו. מוטציות אלה גם משופרות צמיחת תאים, בהשוואה לפרא-הסוג Ubc7, אם כי במידה פחותה מהמוטציות הפעילה באתר (MDTs הממוצע של 3.4 שעות לV25G וH94K לעומת MDTs של 2.7 שעות הממוצעת לC89S וN81K) (איור 4 ). לכן, שיטת GiLS יכולה לשמש למדידה מדויקת של התרומה היחסית של גורמים שונים השפלה ליציבות מצע כתב.
בידוד והערכה של degrons רומן
מערכת GiLS הופעלה גם בפורמט מסך תפוקה גבוה לזהות degrons רומן ולכמת את כוחם היחסי, כלומר, את המידה שבה הם גורמים להשפלה (איור 5). כדי לייעל את זיהוי degrons בתום לב, נוסףשלב של בחירה, אשר צמיחה בנוכחות Fluoroorotic החומצה (5-פואה), נוספו. URA3 ממיר 5-פואה ביעילות לתוך תרכובת רעילה (5-fluorouracil) שיכול לשמש כבחירה חיובית עבור הבידוד של שמרי זנים שבי URA3 הוא ערער 16,23. לזהות degrons רומן, ספרייה של פלסמידים כתב נוצרה על ידי איחוי שברים אקראיים נגזרים מספריית השמרים cDNA לפלסמיד 24 (איור 5 א) URA3-GFP. מחצית GFP נוספה כדי לאפשר מסך משני ולספק מידע על הלוקליזציה של degron ההיתוך (ראה דיון). הספרייה הפכה לשמרים, אז נבחרה בנוכחות 5-פואה (איור 5) ושיבוטים חיוביים בודדו מחדש זורעים על צלחות אגר בפורמט צלחת 96-היטב. כל מושבה הועברה לצלחת 96-היטב, מודגרות O / N, ובדילול מלא בצלחת 96-היטב חדשה כאמור בסעיף 2.2. צפוי כי צמיחה של תאים בSD-URA בינונייהיה לתאם עם תואר ביטוי URA3, אשר הוא התוצאה של העוצמה של degron לגרום השפלה. זה אושר לאחר מכן על ידי יישום GiLS (איור 5 ג). אנו מאשרים כי כל המושבות באופן אקראי שנבחרו שנבחרו מראש, עם 5-פואה הראו ערכי MDT דומים, על מדיום SD-LEU (איור 5 ג, ברים ריקים). בניגוד לכך, כל השיבוטים הראו שיעורי צמיחה משתנים על SD-URA, שהיו איטיים יותר באופן משמעותי מתאים לבטא שליטת URA3-GFP (נתונים לא מוצגים). כפי שצוין, קיים קשר הפוך בין שיעור הצמיחה בSD-URA וMDT. כך,, חזק יותר הוא גבוה יותר MDT degron. ואכן, כל MDTs נגזר משיבוטים חיובי שנבחרו היו גבוה מזה של השליטה (מעל הקו האדום) (איור 5 ג, ברים מלאים).
<איור strong> טבלת 1. חישוב יחידות שמרי MDT. זמן הוא שעות (שעות). בלנק ומדגם הם מקורא OD 600. טרנספורמציה (Trans.) הוא ערך OD 600 לאחר חיסור ריק ותיקון מסלול באורך. יומן 2 מחושבים מנתונים הפכו. השיפוע יומן 2 (OD 600) ערכים ברציפות של מרווחים של נקודות 10 זמן מחולקים בזמן. 1 / השיפוע הזמן הדרוש לאוכלוסיית התא כדי לשכפל את עצמו. מלבן שחור מסמן את MDT ערך. מלבן אדום מסמן את מרווח הזמן שממנו MDT חושב.
| שמרים | גנוטיפ | מקור |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | מחקר זה |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, LEU2 :: ubc7Δ | מחקר זה |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, LEU2 :: ubc7Δ | מחקר זה |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, LEU2 :: ubc7Δ | מחקר זה |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 שלו | מחקר זה |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | מחקר זה |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, LEU2 :: ubc7Δ | מחקר זה |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA ::, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | מחקר זה |
= "Jove_content"> רשימת טבלת 2. זני שמרים ששמשו במחקר זה.
| פלסמידים ששמשו במחקר זה | ||
| פלסמיד | סמנים רלוונטיים | מקור |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 (פלסמיד אינטגרטיבי המכיל LYS1) | מחקר זה |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | מחקר זה |
| פלסמידים כתב מתאימים נוספים | ||
| פלסמיד | סמנים רלוונטיים | מקור |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | לואיס ופלהאם |
טבלה 3. רשימה של פלסמידים השתמשו במחקר זה סימוכין:.. לואיס, MJ & פלהאם, בקרת איכות HR לא יעילה של חלבוני thermosensitive על קרום הפלזמה PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
איור 1. עקרונות החישוב של MDT. תאי שמרי Try467 בOD 600 0.22, הודגרו בתקשורת מלאה SD לתקופת הזמן המוגדרת. OD 600 מדידות נלקחו כל דקות ~ 15 ונאספו נתונים בגיליון אלקטרוני. (א) 600 ערכי OD הפכו מטבלה 1 זממו נגד זמן. (ב)התחבר 2 של OD 600 זממו נגד זמן קו אדום:. מסמן את מרווח הזמן שממנו MDT חושב (ד '). שיעור צמיחת שמרים (ג) (שיפוע) היה מחושב על ידי מדידת שינויים בOD 600 של רציפות נקודות זמן 10 (ליניאריות בהנחה) לאורך זמן שעת התחלה:. הזמן שממנו חישוב יזם. (ד) הזמן הנדרש לשמרים להכפיל הוא ההופכי של השיפוע מ( ג) (1 / Slope) MDT:. הזמן מחושב מינימאלי ההכפלה (בשעה).
איור 2. MDTcalc להתחיל מסך: סעיף פרוטוקול 5.1. ערכי קלט אופייניים לנכנסו מוצגים.
איור 4. מדידת שיעורי השפלה היחסית של Deg1 -VU בזנים מוטנטים Ubc7 שמאל:. עלילה של OD 600 הערכים הפכו, נמדדה במהלך השכפול של הכשרת היישוב מסוג W, Δ ubc7 ומוטציות Ubc7 מצויינים, לעומת זמן. תאים המבטאים Deg1 -VU גדלו על מדיום SD-URA וOD 600 נמדד בכל דקות ~ 15. מימין: MDT עבור כל זן חושב באמצעות MDTcalc.
"= רוחב" 500px 1 / 52021fig5highres.jpg "/>
איור 5. assay תפוקה גבוה לזיהוי ובידוד של degrons רומן. מצגת סכמטי של תכונותיו של כתב URA3-GFP-cDNA (). תרשים זרימה המתאר את שלבי ניסוי לבידוד של זני שמרי ביצוע degron (B). ספריית פלסמיד שתוארה בהפכה לתאי Try467, ואחריו מבחר על צלחות SD-LEU. מושבות לשכפל צלחות SD-LEU המכילות 5-פואה ומושבות בצמיחה מהירה נאספו ומאורגן על צלחות במערך מסודר. מושבות (C) המבטאות URA3-GFP-cDNA שגדל על צלחות המכילות 5-פואה הודגרו באו SD-LEU או SD-URA תקשורת במשך 20 שעות. OD 600 נמדד כל ~ 15 דקות וזמן שמרי הכפלה המינימלית (MDT) חושב באמצעות תוכנת MDTcalc לא degron:. פלסמיד המבטא URA3-GFP ללא degron, משמש כביקורת חיובית לגרowth קו אדום:. סף שנקבע על ידי ערך MDT של השליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים assay המבוסס על צמיחת תאים לקביעת תעריפי פירוק חלבונים יחסית, המכונה "קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי '(GiLS). יש assay GiLS מספר יתרונות: זה פשוט להגדיר, רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט וזה מאוד מודולרי. כתוצאה מכך, יכול להיות מיושם GiLS בו-זמנית לדוגמאות רבות בפורמט ידידותי למשתמש רב גם צלחת שיכול להיות מותאם לאוטומציה ליישומי תפוקה גבוהות. והכי חשוב, GiLS מספק נתונים לשחזור ביותר, כמותי וחזקים וגמיש יותר ממבחנים מבוסס צמיחה אגר-צלחת שיבחרו לצמיחה חיובית / שלילית. בנוסף, GiLS הוא רגיש מאוד בכך שהוא יכול לזהות שינויים קטנים בשערי פירוק חלבונים או רמות מצב יציב, המשקף את הפעילות של רכיבי UPS רלוונטיים או degrons. לבסוף, מבחני GiLS דורשים תקופות צמיחה קצרות יותר באופן משמעותי (<12 שעות) בהשוואה לgrowtמבחני h על צלחות אגר (בדרך כלל 2-4 ימים).
בעוד assay GiLS הוא מאוד שימושי ללימוד פירוק חלבונים, יש לקחת מספר שיקולים חשובים בחשבון. לדוגמא, זה חיוני כדי להשתמש ברקע זן שמרי isogenic בשל מאפייני צמיחת זן ספציפי. יתר על כן, על מנת לוודא תקפות assay, כל assay יש לחזור לפחות שלוש פעמים בתנאים זהים, והכי חשוב, את הצפיפות הראשונית התא (OD 600), טמפרטורת צמיחה, ולוחצת בעוצמה תרבית תאים לא צריכה להיות שונה. לכן, מומלץ שפרוטוקול assay הספציפי מאוחסן בתוכנה של microplate הקורא לשימושים חוזרים ונשנים. משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון הוא שבו degron ממוקם בתוך URA3. כעמדת degron רשאית לקבוע את תפקידיו, מיקום בבית או ג 'או נ' האזורים חייבים להיבדק באופן אמפירי.
כיול של prot הכתברמת ביטוי עין היא גם קריטית ליישום מוצלח של GiLS. כתב אופטימלי הוא אחד כי הוא מושפל ביעילות על ידי המערכת תחת חקירה ובכך מקנה auxotrophy אורציל. עם זאת, שינויים בauxotrophy צריכים גם בנאמנות משקפים את יציבות הכתב. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי בדיקה מוקדמת של המתאם בין שיעורי חלבון כתב השפלה, שנקבעו על ידי שיטות ביוכימיות נוספות, וערכי MDT, שנקבעו על ידי GiLS (איור 3 ב). אחת בעיות נפוצות שעולות כאשר הביטוי במצב יציב בסיס של כתב אינו מגיע לרמת סף ולכן נמוך מכדי לאפשר צמיחה בSD-URA גם כאשר הוא התייצב לחלוטין. כזה ניתן להתגבר על בעיה על ידי הצבת הביטוי העיתונאי תחת השליטה של אמרגן ועין מתנהלת המגביר את ביטוי חלבון בסיסי מבלי להשפיע על השפלה. פעילות יזם במערכות מסוג זה צריכה להיות מכויל היטב, כדי למנוע צמיחה קבועה על SD-URA בשל HIGרמות h חלבונים ובפעילות אנזים כתב גם כאשר הוא מושפל באופן חלקי. היזמים ותנאי ביטוי מתוארים במחקר זה נבחרו משום שהם מאפשרים ויסות רגישה של ביטוי חלבון: MET25p וp CUP1 הם יזמים הנגרמים המטבוליט הפעילות של מה שיכול להיות מכוונת היטב באמצעות שליטה של מתיונין ונחושת, בהתאמה (לוח 3).
מצעי כתב בקרת איכות (כמו אלה המתוארים במחקר זה) יכול ליצור אגרגטים תאיים שעשויות לעקל URA3 ולמנוע את תפקודו. במקרה כזה auxotrophy אורציל יכול להתפרש בטעות כתוצאה מפירוק חלבונים. כדי לבדוק את הנטייה של degrons שונה כדי לצבור, צריך להיות מועסק כתב נוסף. לדוגמא, כתב URA3-GFP המיועד למסך degron (איור 5 א), מאפשר הדמיה של אגרגטים תאיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי גידול בpreseפליטות של 5-פואה. אגרגטים אלה מופיעים מוקדי GFP צפופים כמו שהם בבירור להבחין בין המראה המפוזר של החלבון המסיס (מידע לא מוצג). כתב URA3-GFP-degron יכול לשמש באופן דומה כדי לקבוע את ההשפעה של degron על שיתוף לוקליזציה חלבון והפצת subcellular. זה גם יכול לשמש לביצוע הפירוק של מצעים שנבחרו על ידי cytometry זרימה, כמסך משני 25.
יתרון המשמעותי ביותר של שיטת GiLS הוא שזה מספיק גמיש ולכן יכול בקלות להיות מותאם למגוון רחב של יישומים, בנוסף לאלה שתוארו במסמך זה. לדוגמא, השיטה יכולה לשמש גם לבחינת כשירות של פרוטאזום בתנאים שונים. במקרה זה, מצע פרוטאזום שאינו ubiquitylated כגון decarboxylase ornithine (ODC) התמזג URA3. השיטה יכולה גם לבדוק את פירוק חלבונים בתאים תאיים מובהקים כאשר אות לוקליזציה ספציפית מועסקת.במחקר זה Vma12 מעוגן כתב ER-הקרום (איורים 3, 4). בדומה לכך, אות לוקליזציה גרעינית (NLS), אות ER שימור (KDEL) או cytosol (היעדר אות מסוימת) יכולה להיות מועסק. יש מערכת המאפשרת ניתוח סימולטני של פירוק חלבונים בתאים תאיים שונים יכולה השפעה עמוקה על ההבנה של איך רשתות פירוק חלבונים פועלות. לבסוף, את העקרונות של שיטת הבחירה יכולים להיות מיושמים על מחקר של פירוק חלבונים במערכות המבוססים על תאי מודל אחרים, בחיידקים ותאים אנושיים, שכולן דורשים מוצר גן URA3 להישרדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
